分子生物學(xué)重點(diǎn)全

1、-. z.分子生物學(xué)重點(diǎn)：最新期末試題第二章 染色體與DNA染色體chromosome是細(xì)胞在有絲分裂時遺傳物質(zhì)存在的特定形式，是間期細(xì)胞染色質(zhì)構(gòu)造嚴(yán)密包裝的結(jié)果。真核生物的染色體在細(xì)胞生活周期的大局部時間里都是以染色質(zhì)(chromatin)的形式存在的。染色質(zhì)是一種纖維狀構(gòu)造，叫做染色質(zhì)絲，它是由最根本的單位核小體(nucleosome)成串排列而成的。原核生物(prokaryote) ：DNA形成一系列的環(huán)狀附著在非組蛋白上形成類核。染色體由DNA和蛋白質(zhì)組成。蛋白質(zhì)由非組蛋白和組蛋白H1,H2A,H2B,H3,H4DNA和組蛋白構(gòu)成核小體。組蛋白的一般特性：P24進(jìn)化上的保守性無組織特異

2、性肽鏈氨基酸分布的不對稱性：堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。組蛋白的可修飾性:甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。 H5組蛋白的特殊性：富含賴氨酸24%(鳥類、魚類及兩棲類紅細(xì)胞染色體不含H1而帶有H5)組蛋白的可修飾性在細(xì)胞周期特定時間可發(fā)生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修飾作用較普遍，H2B有乙?；饔谩1有磷酸化作用。所有這些修飾作用都有一個共同的特點(diǎn)，即降低組蛋白所攜帶的正電荷。這些組蛋白修飾的意義：一是改變?nèi)旧w的構(gòu)造，直接影響轉(zhuǎn)錄活性；二是核小體外表發(fā)生改變，使其他調(diào)控蛋白易于和染色質(zhì)相互接觸，從而間接影響轉(zhuǎn)錄活性。2、DNA1) DNA的變性和復(fù)

3、性變性Denaturation) DNA雙鏈的氫鍵斷裂，最后完全變成單鏈的過程稱為變性。增色效應(yīng)(Hyperchromatic effect)在變性過程中，260nm紫外線吸收值先緩慢上升，當(dāng)?shù)竭_(dá)*一溫度時驟然上升，稱為增色效應(yīng)。融解溫度Melting temperature ，Tm ) 變性過程紫外線吸收值增加的中點(diǎn)稱為融解溫度。 生理條件下為85-95影響因素：G C含量，pH值，離子強(qiáng)度，尿素，甲酰胺等復(fù)性Renaturation)熱變性的DNA緩慢冷卻，單鏈恢復(fù)成雙鏈。減色效應(yīng)Hypochromatic effect) 隨著DNA的復(fù)性，260nm紫外線吸收值降低的現(xiàn)象。2) C值反常

4、現(xiàn)象C-value parado*) C值是一種生物的單倍體基因組DNA的總量。真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開，這就是著名的C值反常現(xiàn)象。四核小體(nucleosome)：用于包裝染色質(zhì)的構(gòu)造單位，是由DNA鏈纏繞一個組蛋白核H2A、H2B、H3、H4)*2的八聚體】構(gòu)成的。1、原核生物基因組構(gòu)造特點(diǎn) 基因組很小，大多只有一條染色體 構(gòu)造簡煉 存在轉(zhuǎn)錄單元(trnascriptional operon)多順反子(polycistron)重疊基因由基因基因、局部重疊基因、一個堿基重疊組成。2、真核生物基因組構(gòu)造特點(diǎn)真核基因

5、組構(gòu)造龐大 3109bp、染色質(zhì)、核膜單順反子基因不連續(xù)性 斷裂基因interrupted gene、含子(intron)、外顯子(e*on)非編碼區(qū)較多 多于編碼序列(9:1) 含有大量重復(fù)序列 不重復(fù)序列/單一序列：在基因組中有一個或幾個拷貝。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝的。如：蛋清蛋白、血紅蛋白等功能：主要是編碼蛋白質(zhì)。 中度重復(fù)序列：在基因組中的拷貝數(shù)為101104。如：rRNA、tRNA一般是不編碼蛋白質(zhì)的序列，在調(diào)控基因表達(dá)中起重要作用 高度重復(fù)序列：拷貝數(shù)到達(dá)幾百個到幾百萬個。衛(wèi)星DNA：AT 含量很高的簡單高度重復(fù)序列。1、 DNA的一級構(gòu)造：指4種脫氧核苷酸的連接

6、及其排列順序， DNA序列是這一概念的簡稱。堿基序列2特征：雙鏈反向平行配對而成脫氧核糖和磷酸交替連接，構(gòu)成DNA骨架，堿基排在側(cè)側(cè)堿基通過氫鍵互補(bǔ)形成堿基對A：T，C：G。2、DNA 的二級構(gòu)造：指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所產(chǎn)生的雙螺旋構(gòu)造。2分類：右手螺旋：A-DNA，B-DNA左手螺旋：Z-DNA3、DNA的高級構(gòu)造：指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間構(gòu)造。是一種比雙螺旋更高層次的空間構(gòu)象。2主要形式：超螺旋構(gòu)造正超螺旋和負(fù)超螺旋一DNA的半保存復(fù)制semi-nservative replication1、定義：由親代DNA生成子代DNA時，每個新形成的子代DNA中，一條鏈來

7、自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式稱半保存復(fù)制。3、DNA半保存復(fù)制的生物學(xué)意義：DNA的半保存復(fù)制說明DNA在代上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。二與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物4、引物合成酶引發(fā)酶：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物Primer)。實質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。5、 DNA聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物反響需要有模板的指導(dǎo)

8、反響需要有3-OH存在DNA鏈的合成方向為5 3性質(zhì) 聚合酶 聚合酶 聚合酶3 5 外切活性5 3 外切活性 - -5 3聚合活性 中 很低 很高新生鏈合成 - -聚合酶主要是對DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時切除RNA引物并填補(bǔ)其留下的空隙。聚合酶修復(fù)紫外光引起的DNA損傷聚合酶 DNA 復(fù)制的主要聚合酶，還具有35外切酶的校對功能，提高DNA復(fù)制的保真性6、DNA連接酶1967年發(fā)現(xiàn)：假設(shè)雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起

9、重要作用7、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA Topisomerase)：拓?fù)洚悩?gòu)酶：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例：大腸桿菌中的蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶：該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶8、DNA 解螺旋酶 /解鏈酶DNA helicase)：通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白沿3 5移動，而解螺旋酶I、II、III沿5 3移動。9、單鏈結(jié)合蛋白(SSBP-single-strand

10、binding protein)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。三DNA的復(fù)制過程大腸桿菌為例雙鏈的解開RNA引物的合成DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段1、雙鏈的解開- ftju制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)。 ori(或o、富含A、T的區(qū)段。從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個復(fù)制單位，叫復(fù)制子復(fù)制時，解鏈酶等先將DNA的一段雙鏈解開，形成復(fù)制點(diǎn)，這個復(fù)制點(diǎn)的形狀象一個叉子，故稱為復(fù)制叉雙鏈解開、復(fù)制起始P44大約20個DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個9bp保守序列相結(jié)合在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna復(fù)制起始復(fù)合物使3個

11、13bp直接重復(fù)序列變性,形成開鏈解鏈酶六體分別與單鏈DNA相結(jié)合(需DnaC幫助),進(jìn)一步解開DNA雙鏈2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶，引發(fā)RNA引物的合成。引物長度約為幾個至10個核苷酸，3、DNA鏈的延伸DNA的半不連續(xù)復(fù)制semi-discontinuous replication)：DNA復(fù)制時其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復(fù)制。在DNA復(fù)制時，合成方向與復(fù)制叉移動的方向一致并連續(xù)合成的鏈為前導(dǎo)鏈；合成方向與復(fù)制叉移動的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈為滯后鏈。在DNA復(fù)制過程中，前導(dǎo)鏈能連續(xù)合成，而

12、滯后鏈只能是斷續(xù)的合成53 的多個短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。4、切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段復(fù)制終止當(dāng)復(fù)制叉遇到約22個堿基的重復(fù)性終止子序列Ter時，Ter-Tus蛋白復(fù)合物能使DnaB不再將DNA解鏈，阻擋復(fù)制叉繼續(xù)前移。P47在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填補(bǔ)上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈四復(fù)制的幾種主要方式 P421、雙鏈環(huán)狀、型復(fù)制、雙向等速2、滾環(huán)型：1模板鏈和新合成的鏈分開;2不需RNA引物，在正鏈3OH上延伸3只有一個復(fù)制叉;3、D環(huán)復(fù)制-單向復(fù)制的特殊方式如：動物線粒體DNA五真核生

13、物中DNA的復(fù)制特點(diǎn)1、真核生物每條染色體上有多個復(fù)制起點(diǎn)，多復(fù)制子約150bp左右；2、復(fù)制叉移動的速度較慢約50bp秒，僅為原核生物的110。3、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前,各個起始點(diǎn)不再重新開場DNA復(fù)制；真核生物快速生長時，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。4、真核生物有多種DNA聚合酶。5、真核生物DNA復(fù)制過程中的引物及岡崎片段的長度均小于原核生物。真核岡崎片段長約100-200bp，原核岡崎片段長約1000-2000bp。六原核和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)比擬復(fù)制起點(diǎn)ori：原核一個，真核多個；復(fù)制子 ：原核一個，真核多個；復(fù)制子長度：原核長；真核短；復(fù)制叉：原核多個；真核多個；復(fù)制移動

14、速度：原核較快；真核較慢；真核生物染色體在全部完成復(fù)制前，各起始點(diǎn)的DNA 復(fù)制不能再開場。而在快速生長的原核生物中，復(fù)制起點(diǎn)上可以連續(xù)開場新的DNA復(fù)制。原核生物染色體的復(fù)制與細(xì)胞分裂同步，可以屢次復(fù)制；真核生物染色體的復(fù)制發(fā)生在S期，是細(xì)胞分類的特定時期，而且僅此一次。四、DNA的修復(fù)DNA修復(fù)系統(tǒng) 功能錯配修復(fù) 恢復(fù)錯配堿基切除修復(fù) 切除突變的堿基核甘酸切除修復(fù) 修復(fù)被破壞的DNADNA直接修復(fù)SOS系統(tǒng) 修復(fù)嘧啶二體或甲基化DNADNA的修復(fù)，導(dǎo)致變異1、錯配修復(fù) mismatch repairDam甲基化酶使母鏈位于5GATC序列中腺甘酸甲基化甲基化緊隨在DNA復(fù)制之后進(jìn)展幾秒種后至

15、幾分鐘根據(jù)復(fù)制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子鏈上的錯配堿基2、堿基切除修復(fù) e*cision repair所有細(xì)胞中都帶有不同類型、能識別受損核苷酸位點(diǎn)的糖苷水解酶，它能特意切除受損核苷酸上的N-糖苷鍵，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點(diǎn)，統(tǒng)稱為AP位點(diǎn)。一些堿基在自發(fā)或誘變下會發(fā)生脫酰胺，然后改變配對性質(zhì)，造成氨基轉(zhuǎn)換突變腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤與胞嘧啶配對鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤與胞嘧啶配對胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏づc腺嘌呤配對3、核苷酸切除修復(fù)1通過特異的核酸切酶識別損傷部位2由酶的復(fù)合物在損傷的兩邊切除幾個核苷酸3 DNA 聚合酶以母鏈為模板復(fù)制合成新子鏈4DNA連接酶將切口補(bǔ)平4 、DNA的直接修

16、復(fù)在DNA光解酶的作用下將環(huán)丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物復(fù)原成為單體甲基轉(zhuǎn)移酶使O6-甲基鳥嘌呤脫甲基生成鳥嘌呤，防止G-T配對SOS反響 (SOS response)：是細(xì)胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，細(xì)胞為求生存而產(chǎn)生的一種應(yīng)急措施。包括誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂的抑制以及溶原性細(xì)菌釋放噬菌體等。細(xì)胞癌變也與SOS反響有關(guān)。兩個作用1DNA的修復(fù)；2產(chǎn)生變異五、 DNA的轉(zhuǎn)座DNA的轉(zhuǎn)座或叫移位transposition)：由可移位因子(transposable element) 介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座子transposon Tn：存在于染色體DNA上

17、可自主復(fù)制和位移的根本單位。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座這一命名并不十分準(zhǔn)確，因為在轉(zhuǎn)座過程中，可移位因子的一個拷貝常常留在原來位置上，在新位點(diǎn)上出現(xiàn)的僅僅是它的拷貝。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA復(fù)制。原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：1、插入序列(IS)IS是最簡單的轉(zhuǎn)座子，不含有任何宿主基因，它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成局部。2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子(posite transposon)復(fù)合轉(zhuǎn)座子是一類帶有*些抗藥性基因或其他宿主基因的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個一樣或高度同源的IS序列 3、TnA家族TnA家族沒有IS序列、體積龐大 (5000bp以上)、帶有3個基因，其中一個編碼-酰胺酶(AmpR)，另兩

18、個則是轉(zhuǎn)座作用所必須的。(三轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制轉(zhuǎn)座時發(fā)生的插入作用的普遍特征，是受體分子中有一段很短的(3l2bp)、被稱為靶序列的DNA會被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個重復(fù)的靶序列之間。對于一個特定的轉(zhuǎn)座子來說，它所復(fù)制的靶序列長度是一樣的，如IS1兩翼總有9個堿基對的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。靶序列的復(fù)制可能起源于特定切酶所造成的黏性DNA末端。三轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng) p631轉(zhuǎn)座引起插入突變2轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因3轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變4轉(zhuǎn)座引起的 生物進(jìn)化反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子retrotransposon：指通過RNA為中介，反轉(zhuǎn)錄成DNA后進(jìn)展轉(zhuǎn)座的可動元件。第三章 生物信息的傳遞上 從

19、DNA到RNA轉(zhuǎn)錄(transcription) ：生物體以DNA為模板合成RNA的過程 。參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP)模板:DNA酶: RNA聚合酶其他蛋白質(zhì)因子RNA合成方向：5 到 3轉(zhuǎn)錄的不對稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。與mRNA序列一樣的那條DNA鏈稱為編碼鏈；將另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈。DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為構(gòu)造基因。轉(zhuǎn)錄單元transcription unit一段從啟動子開場至終止子完畢的DNA序列。二、參與轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵酶與元件一

20、 RNA聚合酶原核生物RNA聚合酶大腸桿菌為例-全酶=核心酶 因子亞基 基因 相對分子量 亞基數(shù) 組分 功能 rpoA 36500 2 核心酶 核心酶組裝，啟動子識別 rpoB 151000 1 核心酶 和共同形成RNA合成的活性中心 rpoC 155000 1 核心酶 ？ 11000需查 1 核心酶 ？ rpoD 70000 1 因子 存在多種因子，用于識別不同的啟動子真核細(xì)胞的三種RNA聚合酶特征比擬酶 位置 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 相對活性 對-鵝膏蕈堿的敏感性RNA聚合酶 核仁 rRNA 50-70% 不敏感RNA聚合酶 核質(zhì) hnRNA 20-40% 敏感RNA聚合酶 核質(zhì) tRNA 約10% 存

21、在物種特異性RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶 DNA聚合酶大小(M) 大，4.8105dol 小，1.09105dol引物 無 有產(chǎn)物 較短，游離 較長，與模板以氫鍵相連作用方式 一條鏈的*一段 兩條鏈同時進(jìn)展外切酶活性 無 5 3，3 5校對合成能力 無 有修復(fù)能力 無 有二 啟動子(promoter)啟動子定義：指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。TATA區(qū)：酶的嚴(yán)密結(jié)合位點(diǎn)富含AT堿基，利于雙鏈翻開TTGACA區(qū)：提供了RNA聚合酶全酶識別的信號轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-與新生RNA鏈第一個核甘酸相對應(yīng)DNA鏈上的堿基。真核生物啟動子的構(gòu)造核心啟動子core prom

22、oter定義：指保證RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游TATA區(qū)作用：選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證準(zhǔn)確起始2、上游啟動子元件包括CAAT盒CCAAT和GC盒GGGCGG等作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。三 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物-二元閉合復(fù)合物、二元開鏈復(fù)合物、三元復(fù)合物。原核三、轉(zhuǎn)錄的根本過程1、起始位點(diǎn)的識別：RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合2、轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合DNA雙鏈解開在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反響，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物5-pppG -OH NTP 5-pppG

23、pN - OH 3 ppi轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物: RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 33、RNA鏈的延伸 亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。注意：9個核苷酸以前還在啟動子區(qū)，容易脫落，一旦形成9個以上的核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄正式進(jìn)入眼神階段。4、轉(zhuǎn)錄終止終止子terminator：位于基因的末端，在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段回文序列反向重復(fù)序列約6-20bp。真核生物終止: 由一段特定序列5AATAAA3和回文序列反向重復(fù)序列組成。分為兩類：強(qiáng)終止子部終止子：不依賴Rho ()因子的終

24、止。弱終止子 需要因子rho factor，又稱為依賴性終止子 Rho-dependent terminator不依賴因子的終止當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物別離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。終止位點(diǎn)上游一般存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，RNA形成發(fā)夾構(gòu)造；在終止位點(diǎn)前面有一段由4-8個A組成的序列，RNA的3端為寡聚U發(fā)夾式構(gòu)造和寡聚U的共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來。依賴因子的終止因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解

25、離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。二、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程1. 轉(zhuǎn)錄起始真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過程比原核生物復(fù)雜。1. 轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段順式作用元件(cis-acting element)：影響自身基因表達(dá)活性的非編碼DNA序列。 例：啟動子、增強(qiáng)子、弱化子等增強(qiáng)子：在啟動區(qū)存在的能增強(qiáng)或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始的DNA序列。但不是啟動子的一局部。特點(diǎn)：1.遠(yuǎn)距離效應(yīng)；2.無方向性；3.順式調(diào)節(jié)；4.無物種和基因的特異性；5.具有組織特異性；6.有相位性；7.有的增強(qiáng)子可以對外部信號產(chǎn)生反響。2. 轉(zhuǎn)錄因子：能直接、間接識別和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段D

26、NA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-acting factors)。反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptional factors, TF)。參與RNA-pol轉(zhuǎn)錄的TF -TFD、 TFA、TFB、TFF、TFE、TFH3轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiation ple*, PIC)真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。4模板理論(piecing theory)一個真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性、有專一性的復(fù)合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對

27、性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。2. 轉(zhuǎn)錄延伸真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。3. 轉(zhuǎn)錄終止 和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。四、轉(zhuǎn)錄后加工5端加帽、3端加尾、RNA的剪接、RNA的編輯1、在5端加帽5端的一個核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸m7Gppp。mRNA5端的這種構(gòu)造稱為帽子cap。帽子構(gòu)造功能：能被核糖體小亞基識別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合；m7Gppp構(gòu)造能有效地封閉mRNA 5末端，以保護(hù)mRNA免受5核酸外切酶的降解，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定。2、3端加尾-多聚腺苷酸

28、尾巴-AAUAAA：*準(zhǔn)確切割。*加polyA多聚腺苷酸尾巴功能：提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。3、RNA的剪接生物體含子的主要類型：U-AG、AU-AC、類含子、類含子類含子參與RNA剪接的物質(zhì)： snRNA核小分子RNA、snRNP與snRNA結(jié)合的核蛋白 、核RNAU1、U2、 U4、U5、U64、RNA的編輯編輯editing是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、參加或喪失等現(xiàn)象。五、原核生物與真核生物mRNA的特征比擬1、原核生物mRNA的特征 半衰期短 多以多順反子的形式存在單順反子mRNA：只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA。多順反子mRNA：編碼多個蛋白質(zhì)的mRNA。Z： -半

29、乳糖苷酶Y： 透過酶A：乙酰基轉(zhuǎn)移酶ZYA為構(gòu)造基因 5 端無帽子構(gòu)造， 3 端沒有或只有較短的polyA 構(gòu)造。 SD序列：原核生物起始密碼子AUG上游7-12個核苷酸處有一被稱為SD序列的保守區(qū)。mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。P852、真核生物mRNA的特征基因的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。 5 端存在帽子構(gòu)造多數(shù)mRNA 3 端具有polyA 尾巴組蛋白除外以單順反子的形式存在六、RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)一樣點(diǎn)：1、都以DNA鏈作為模板2、合成的方向均為533、聚合反響均是通過核苷酸之間形成的3,5-磷酸二酯鍵，使核苷酸鏈延長。不同點(diǎn)：

30、復(fù)制 轉(zhuǎn)錄模板 兩條鏈均復(fù)制 模板鏈轉(zhuǎn)錄不對稱轉(zhuǎn)錄原料 dNTP NTP酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶產(chǎn)物 子代雙鏈DNA半保存復(fù)制 mRNA， tRNA， rRNA配對 A-T；G-C A-U；T-A；G-C引物 RNA引物 無第四章 生物信息的傳遞下 從mRNA到蛋白質(zhì)翻譯：指將mRNA鏈上的核甘酸從一個特定的起始位點(diǎn)開場，按每三個核甘酸代表一個氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。蛋白質(zhì)合成的場所是核糖體。蛋白質(zhì)合成的模板是mRNA模板與氨基酸之間的接合體是tRNA蛋白質(zhì)合成的原料是20種氨基酸一、遺傳密碼三聯(lián)子一三聯(lián)子密碼：mRNA鏈上每三個核甘酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個氨基酸，這

31、三個核甘酸就稱為密碼子或三聯(lián)子密碼(triplet coden) 。至1966年，20種氨基酸對應(yīng)的61個密碼子和三個終止密碼子全部被查清。三遺傳密碼的性質(zhì)1、 連續(xù)性編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無連續(xù)也無穿插?；驌p傷引起mRNA閱讀框架的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導(dǎo)致框移突變(frameshift mutation)。從mRNA 5端起始密碼子AUG到3端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個蛋白質(zhì)多肽鏈，稱為開放閱讀框架(open reading frame, ORF)。2、簡并性由一種以上密碼子編碼同一個氨基酸的現(xiàn)象稱為簡并degenerac

32、y，對應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子synonymous codon。3、通用性與特殊性蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。4、擺動性轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA上的反密碼子需要通過堿基互補(bǔ)與mRNA上的遺傳密碼子反向配對結(jié)合，在密碼子與反密碼子的配對中，前兩對嚴(yán)格遵守堿基配對原則，第三對堿基有一定的自由度，可以擺動，這種現(xiàn)象稱為密碼子的擺動性。二、tRNA的構(gòu)造、功能與種類一 tRNA的構(gòu)造1、二級構(gòu)造：三葉草形2、三級構(gòu)造： L形二 tRNA的功能1、解讀mRNA的遺傳信息2、運(yùn)輸?shù)墓ぞ撸\(yùn)載氨基酸t(yī)RNA有兩個關(guān)鍵部位：

33、3端CCA：承受氨基酸，形成氨酰-tRNA。與mRNA結(jié)合部位反密碼子部位tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA鏈上的密碼子相識別，把所帶氨基酸放到肽鏈的一定位置。1、起始tRNA和延伸tRNA能特異地識別mRNA模板上起始密碼子的tRNA稱起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。真核生物：起始密碼子AUG 所編碼的氨基酸是Met，起始AA-tRNA為Met-tRNAMet。原核生物：起始密碼子AUG 所編碼的氨基酸并不是 甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA為fMet-tRNAfMet2、同工tRNA代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密

34、碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有*種構(gòu)造上的共同性，能被一樣的氨基酰-tRNA合成酶識別P119。3、校正tRNA無義突變校正tRNA：可以通過改變反密碼子區(qū)校正無義突變錯義突變校正tRNA：通過反密碼子區(qū)的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正常的蛋白質(zhì)。無義突變：在蛋白質(zhì)的構(gòu)造基因中，一個核苷酸的改變可能使代表*個氨基酸的密碼子變成終止密碼子UAG、UGA、UAA，使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。錯義突變：由于構(gòu)造基因中*個核甘酸的變化使一種氨基酸的密碼子變?yōu)榱硪环N氨基酸的密碼子，這種基因突變叫錯義突變。GGA甘氨酸 AGA精氨酸四、氨酰-t

35、RNA合成酶AA- tRNA合成酶是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，它既能識別tRNA，又能識別氨基酸，對兩者都具有高度的專一性。三、核糖體的構(gòu)造與功能核糖體是由rRNAribosomal ribonucleic acid和多種蛋白質(zhì)結(jié)合而成的一種大的核糖核蛋白顆粒，蛋白質(zhì)肽鍵的合成就是在這種核糖體上進(jìn)展的。細(xì)菌是70s50s30s 哺乳動物是80s60s40s二核糖體的功能：合成蛋白質(zhì)在單個核糖體上，可化分多個功能活性中心，在蛋白質(zhì)合成過程中各有專一的識別作用和功能。mRNA結(jié)合部位小亞基結(jié)合或承受AA-tRNA部位A位大亞基結(jié)合或承受肽基tRNA的部位大亞基肽基轉(zhuǎn)移部位P位大亞基形

36、成肽鍵的部位轉(zhuǎn)肽酶中心大亞基四、蛋白質(zhì)合成的過程(生物學(xué)機(jī)制氨基酸的活化翻譯的起始肽鏈的延伸肽鏈的終止蛋白質(zhì)前體的加工(一)氨基酸的活化原核生物中，起始氨基酸是：甲酰甲硫氨酸起始AA-tRNA是：fMet-tRNAfMet真核生物中，起始氨基酸是：甲硫氨酸起始AA-tRNA是：Met-tRNAMet(二)翻譯的起始原核生物細(xì)菌為例：所需成分：30S小亞基、 50S大亞基、模板mRNA、fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2翻譯起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、翻譯起始(翻譯起始復(fù)合物形成)又可被分成3步： P1291. 核蛋白體大小亞基別離2、30S小亞基通過SD序列與mRNA模板相

37、結(jié)合。3.在IF-2和GTP的幫助下， fMet-tRNAfMet進(jìn)入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對。4、帶有tRNA、mRNA和3個翻譯起始因子的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合，GTP水解，釋放翻譯起始因子。真核生物翻譯起始的特點(diǎn)核糖體較大,為80；起始因子比擬多； mRNA 5端具有m7Gppp帽子構(gòu)造 Met-tRNAMet mRNA的5端帽子構(gòu)造和3端polyA都參與形成翻譯起始復(fù)合物；真核生物翻譯起始復(fù)合物形成(區(qū)別原核生物)原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合。而在真核生物中，40

38、S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始復(fù)合物P131。(三)肽鏈的延伸肽鏈延伸由許多循環(huán)組成，每加一個氨基酸就是一個循環(huán)，每個循環(huán)包括：AA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位。延伸因子(elongation factor, EF) ：原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts)、 EF-G真核生物：EF-1 、EF-21、AA-tRNA與核糖體A位點(diǎn)的結(jié)合需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts兩種延伸因子2、肽鍵形成：是由轉(zhuǎn)肽酶/肽基轉(zhuǎn)移酶催化3、移位：核糖體向mRNA3端方向移動一個密

39、碼子。需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子A位點(diǎn)是新到來的氨酰-tRNA的結(jié)合位點(diǎn)。P位點(diǎn)是肽酰- tRNA的結(jié)合位點(diǎn)。E位點(diǎn)是延伸過程中釋放tRNA的位點(diǎn)，即，去氨酰-tRNA通過E位點(diǎn)脫出，釋放到核糖體外的胞質(zhì)中。四肽鏈的終止 RF1：識別終止密碼子UAA和UAG 終止因子 RF2：識別終止密碼子UAA和UGA RF3：具GTP酶活性，刺激RF1和RF2活性，協(xié)助肽鏈的釋放真核生物只有一個終止因子eRF(五)蛋白質(zhì)前體的加工1、N端fMet或Met的切除2、二硫鍵的形成3、特定氨基酸的修飾 磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化和羧基化4、切除新生肽鏈中非功能片段六蛋白質(zhì)折疊由核糖體合成的

40、所有新生肽鏈必須通過正確的折疊才能形成動力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定的三位構(gòu)象，從而表現(xiàn)出生物學(xué)活性或功能。新生多肽一級構(gòu)造二級構(gòu)造三級構(gòu)造已經(jīng)具有活性對于寡聚蛋白需要組裝稱為四級構(gòu)造才有活性。(七)蛋白質(zhì)合成抑制劑青霉素、四環(huán)素和紅霉素只與原核細(xì)胞核糖體發(fā)生作用，從而阻遏原核生物蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌生長。被廣泛用于人類醫(yī)學(xué)。氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細(xì)胞核糖體結(jié)合，又能與真核生物核糖體結(jié)合，阻礙細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞生長。氯霉素有時也用于治病，但劑量和周期受到較嚴(yán)控制。五、蛋白質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制1、翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制2、翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制(1)線粒體蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)(2)葉綠體蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)3、核定位蛋白的運(yùn)

41、轉(zhuǎn)機(jī)制4、蛋白質(zhì)的降解*蛋白質(zhì)的合成位點(diǎn)與功能位點(diǎn)常常被細(xì)胞的膜所隔開，蛋白質(zhì)需要運(yùn)轉(zhuǎn)。*核糖體是真核生物細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的場所，任何時候都有許多蛋白質(zhì)被輸送到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和質(zhì)網(wǎng)等各個局部，補(bǔ)充和更新細(xì)胞功能。*細(xì)胞各局部都有特定的蛋白質(zhì)組分，蛋白質(zhì)必須準(zhǔn)確無誤地定向運(yùn)送才能保證生命活動的正常進(jìn)展。*細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成：絕大多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)中合成；一小局部在細(xì)胞器葉綠體和線粒體中合成。*定位于細(xì)胞器的大局部蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中合成，細(xì)胞器合成的留在細(xì)胞器。*蛋白質(zhì)插入或穿過生物膜的過程稱為蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)protein translocation。蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)的兩種方式翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步co-transl

42、ational translocation是即將進(jìn)入質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)的易位方式；蛋白質(zhì)正合成的時候就可與運(yùn)轉(zhuǎn)裝置結(jié)合；蛋白質(zhì)合成時，核糖體定位于質(zhì)網(wǎng)外表，稱膜結(jié)合核糖體(membrane-bound ribosome。分泌蛋白質(zhì)大多是以同步機(jī)制運(yùn)輸?shù)姆g后運(yùn)轉(zhuǎn)post-translational translocation蛋白質(zhì)翻譯完成后從核糖體上釋放，然合擴(kuò)散至適宜的靶膜并與運(yùn)轉(zhuǎn)裝置結(jié)合。蛋白質(zhì)合成時，其核糖體不與任何細(xì)胞器相連，稱游離核糖體(free ribosome)在細(xì)胞器發(fā)育過程中，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器的蛋白質(zhì)大多是以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸?shù)摹⑴c生物膜形成的蛋白質(zhì)，依賴于上述兩種不同的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)

43、制鑲?cè)肽?。蛋白性質(zhì) 運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制 主要類型分泌 蛋白質(zhì)在結(jié)合核糖體上合成，并以翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制運(yùn)輸 免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素等細(xì)胞器發(fā)育 蛋白質(zhì)在游離核糖體上合成，以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸 核、葉綠體、線粒體、乙醛酸循環(huán)體、過氧化物酶體等細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)膜的形成 兩種機(jī)制兼有 質(zhì)膜、質(zhì)網(wǎng)、類囊體中的蛋白質(zhì)1、翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制信號肽假說信號肽：能啟動蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)的任何一段多肽。常指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的N-末端氨基酸序列有時不一定在N端。絕大局部被運(yùn)入質(zhì)網(wǎng)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個信號肽。信號序列特點(diǎn)：1一般帶有10-15個疏水氨基酸；2在靠近該序列N-端常常有1個或數(shù)個帶正電荷的氨

44、基酸；3在其C-末端靠近蛋白酶切割位點(diǎn)處常常帶有數(shù)個極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的那個氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈丙氨酸或甘氨酸。信號肽假說容：1蛋白質(zhì)合成起始首先合成信號肽2SRP信號識別蛋白與信號肽結(jié)合，翻譯暫停3SRP與SRP受體結(jié)合，核糖體與膜結(jié)合，翻譯重新開場4信號肽進(jìn)入膜構(gòu)造5蛋白質(zhì)過膜，信號肽被切除，翻譯繼續(xù)進(jìn)展6蛋白質(zhì)完全過膜，核糖體解離信號肽與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系P1441完整信號肽是保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的必要條件；2僅有信號肽缺乏以保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生；3信號序列切除并不是轉(zhuǎn)運(yùn)所必需；4并非所有運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)都有可降解的信號肽。蛋白質(zhì)翻譯運(yùn)轉(zhuǎn)同步運(yùn)輸?shù)母具^程可分兩個階段：首先：帶有新生肽鏈的核

45、糖體與膜結(jié)合；然后：新生肽鏈進(jìn)入膜通道并易位。核糖體與膜結(jié)合需要信號識別顆粒signal recognition particle, SRP。SRP有兩種能力：結(jié)合新合成的分泌型蛋白的信號序列；結(jié)合位于膜上的 SRP 受體。2、翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制前導(dǎo)肽及其特性: 翻譯后跨膜易位的蛋白質(zhì)，前體一般含前導(dǎo)肽(leader peptide)，前導(dǎo)肽在跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)中起重要作用。過膜后，前導(dǎo)肽水解，蛋白質(zhì)變?yōu)橛泄δ艿牡鞍踪|(zhì)。前導(dǎo)肽的一般特性：1帶正電荷堿性氨基酸Arg較豐富， 分散于不帶電荷的氨基酸序列之間；2缺少帶負(fù)電荷的酸性氨基酸；3羥基氨基酸Ser含量較高；4有形成兩親親水和疏水- 螺旋能力。線粒體蛋白質(zhì)

46、跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)Hsp70為分子伴侶分子伴侶：結(jié)合在一些不完全裝配或不恰當(dāng)折疊蛋白上，幫助它們折疊或防止它們聚集的蛋白質(zhì)。分子伴侶的生物學(xué)功能(1)幫助新生蛋白質(zhì)正確折疊(2)糾正錯誤折疊或介導(dǎo)其降解泛素活化酶 (ubiquitin - activating enzyme，E1)泛素結(jié)合酶ubiquitin - conjugating enzyme，E2)泛素蛋白連接酶(ubiquitin -proteinligating enzyme, E3)E1,E2,E3的作用：E1激活泛素分子，E2就負(fù)責(zé)把泛素分子綁在被降解蛋白質(zhì)上。E3能識別被降解的蛋白質(zhì)。第五章 分子生物學(xué)研究法重組DNA技術(shù)-基因工程分

47、子雜交及相關(guān)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒错懙脑砗蛻?yīng)用DNA多態(tài)性及其檢測基因操作：主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等。基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入新的宿主細(xì)胞并獲得持續(xù)穩(wěn)定增值能力和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)實際上是核酸操作技術(shù)的一局部。1、理論上的三大發(fā)現(xiàn)遺傳物質(zhì)主要是DNADNA的雙螺旋構(gòu)造和半保存復(fù)制機(jī)制遺傳密碼子的破譯2、技術(shù)上的三大創(chuàng)造限制酶和連接酶體外切割和連接DNA片斷質(zhì)粒改造成載體以攜帶DNA片斷克隆逆轉(zhuǎn)錄酶的使用常用的工具酶限制性核酸切酶 切割DNA

48、DNA連接酶 生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶 探針標(biāo)記、補(bǔ)平3末端反轉(zhuǎn)錄酶 cDNA合成多聚核苷酸激酶 5磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶 3末端多聚尾堿性磷酸酶 切除末端磷酸基載體 vector自我復(fù)制克隆載體、表達(dá)載體原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC噬菌體，M13真核載體：動物病毒載體pL*SN載體的條件分子小 10 Kb有限制酶酶切位點(diǎn)可自主復(fù)制有足夠的copy數(shù)帶篩選的標(biāo)志1982年 - 轉(zhuǎn)基因小鼠1997年 克隆綿羊多利1998年 - 克隆鼠2001年2月 - 人類基因組重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)開展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技

49、術(shù)。重組DNA技術(shù)Rebinant DNA Technique是人類根據(jù)需要選擇目的基因DNA片段在體外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體，以到達(dá)改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術(shù)的開展和應(yīng)用，關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。基因操作：主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等?；蚬こ蹋褐冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入新的宿主細(xì)胞并獲得持續(xù)穩(wěn)定增值能力和表達(dá)。基因工程技術(shù)實際上是核酸操作技術(shù)的一局部。或者說基因操作技術(shù)效勞于基因工程。一、限制酶限制性切核

50、酸酶(restrictive endonucleases)，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶分子手術(shù)刀。發(fā)現(xiàn)于原核生物體，現(xiàn)已別離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。1、限制酶的命名命名原則：限制酶由三局部構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、別離順序。如：屬名 菌株名E co R I種名 編號EcoRI來源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中別離的第一個限制酶。2、限制酶的特點(diǎn)：1. 限制性切酶一般識別完全的回文構(gòu)造，它具有兩個根本特點(diǎn)： 能夠在中間劃一個對稱軸，兩側(cè)的序列兩兩對稱互補(bǔ)配對； 兩條互補(bǔ)鏈的53的

51、序列組成一樣，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180度，則兩條鏈重疊。2. 識別-8個相連的核苷酸組成的特定核甘酸序列。3 切割方式有兩種 錯位切割，產(chǎn)生互補(bǔ)性的粘性末端。錯位切割所產(chǎn)生的DNA末端，兩條鏈不平齊，一條鏈凸出，一條鏈凹進(jìn)，這種末端稱為黏性末端。帶有一樣黏性末端的DNA分子很容易在末端互補(bǔ)配對，連接成新的重組分子。 沿對稱軸切割，產(chǎn)生平齊末端切割后，DNA末端的一條鏈多出一至幾個核苷酸，成為突出末端，又稱粘性末端包括3突出、5突出。切割兩條鏈時產(chǎn)生兩端平整的DNA分子，稱為平末端。4 具有同裂酶來源不同的限制性切酶識別同樣的核甘酸靶序列。如：BamH I和Bst I具有一樣的識別序列GGATCC。

52、5 具有同尾酶來源各異，識別的靶序列也不同，但卻產(chǎn)生一樣的黏性末端，故同尾酶產(chǎn)生的黏性末端可以連接起來，但一般不能再被原來的任何一種酶所切割。如：Taq I、Cla I和Acc I為一組同尾酶，其中任何一種酶切割DNA分子都產(chǎn)生5端CG凸出的粘性末端。二、目的基因及載體一目的基因一目的基因的獲得1化學(xué)合成法：較短的基因60-80bp用途：PCR引物、測序引物、定點(diǎn)突變、核酸雜交探針1DNA 的化學(xué)合成單鏈DNA短片段的合成已成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)實驗室的常規(guī)技術(shù)?；瘜W(xué)合成DNA分子是把新的脫氧核糖核苷酸加到DNA雙鏈的5端，而在細(xì)胞中DNA分子合成的方向恰恰相反。整個DNA的化學(xué)合成過程可以

53、在一個反響柱上連續(xù)進(jìn)展，并且可以對合成過程進(jìn)展計算機(jī)控制。目前常用的化學(xué)合成DNA的方法是磷酰胺法。2基因組文庫和cDNA 文庫基因庫，也叫基因組文庫， DNA文庫 DNA library)是指用克隆的方法將一種生物的全部基因組長期以重組體方式保持在適當(dāng)?shù)乃拗髦小⑸锛?xì)胞基因組DNA通過限制性切酶局部酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。這樣保存的基因組是多拷貝、多片段，當(dāng)需要*一片段時，可以在這樣的圖書館中查找沒有目錄。cDNA文庫 首先獲得mRNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，經(jīng)克隆后形成文庫。cDAN文庫和基因組文庫的不同之處在

54、于，cDNA文庫除卻了mRNA拼接過程中除去的含子等成分，便于DNA重組的使用。其復(fù)雜性比基因文庫低得多。主要用于研究蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可根據(jù)克隆的cDNA分子的核酸序列直接推倒出來。組建一個cDNA文庫的步驟：1)別離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞2)從組織或細(xì)胞中制備總體RNA和mRNA3第一條cDNA鏈的合成，需要RNA模板，cDNA合成引物，逆轉(zhuǎn)錄酶，4種脫氧核苷三磷酸以及相應(yīng)的緩沖液(Mg2 )等。4)第二條cDNA鏈的合成5) cDNA的甲基化和接頭的參加6)雙鏈cDNA與載體的連接二載體載體Vector:將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。載體具以下特征：1)分子

55、量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中增殖；質(zhì)粒大于15kb時，其將外源DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌的效率將大大降低。2)有多種限制酶切點(diǎn)，每種限制酶最好只有單一切點(diǎn)；3)被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力，并有可選擇的標(biāo)記基因如，抗藥基因。4可以在載體細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，即本身是一個復(fù)制子?；蚬こ梯d體的分類根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分1. 質(zhì)粒型載體環(huán)狀dsDNA分子，自主復(fù)制質(zhì)粒DNA載體。如：質(zhì)粒載體2. 病毒型載體環(huán)狀、線狀、ss-和ds-DNA分子，形成病毒顆粒。如：噬菌體載體3.混合型載體具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細(xì)胞生物學(xué)特性。如：柯斯質(zhì)粒載體用于

56、原核生物宿主的載體目前已構(gòu)建應(yīng)用的基因工程載體主要有：質(zhì)粒載體、 噬菌體載體、 柯斯質(zhì)粒載體。一.質(zhì)粒plasmid ：質(zhì)粒是細(xì)胞染色體或核區(qū)DNA外能夠自主復(fù)制的很質(zhì)粒載體特點(diǎn)1、 至少有一個復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。2、 至少應(yīng)有一個克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。3、 至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞。4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。注：前三個特點(diǎn)必不可少。1、 標(biāo)記基因的作用1指示外源DNA分子載體或重組分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞2指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。2、 標(biāo)記基因的種類1抗性標(biāo)記基因可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子主要

57、是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr2生化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化*些易檢測的生化反響，如lacZ3、常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機(jī)制1) 四環(huán)素抗性基因 Tetr ，Tcr2) 氨芐青霉素抗性基因 Ampr ，Apr3) 氯霉素抗性基因 Cmlr ，Cmr4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因5半乳糖苷酶基因lacZ 和lacZ三DNA重組根本程序1.分載體和目的基因的別離2.切限制性切酶的應(yīng)用3.接載體與目的基因連接成重組體4.轉(zhuǎn)基因序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞5.篩目的基因序列克隆的篩選和鑒定6.表目的基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)目的基因的獲取方

58、法：從基因組中提取、CDNA法、化學(xué)合成法、PCR法。鑒定得到的目的基因的鑒定方法：抗性選擇、提取質(zhì)粒電泳鑒定大小、快速提取酶切鑒定、菌落雜交法、DNA序列分析。第二節(jié) 分子雜交及相關(guān)技術(shù)分子雜交：是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上,然后用標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交,經(jīng)顯影后顯示出目的分子所處的位置的過程.分子雜交包括：DNA-DNA雜交原位雜交、點(diǎn)雜交、Southern雜交，DNA-RNA雜交Northern雜交及蛋白雜交Western 雜交等。一、雜交探針Probe的獲得Probe：探針，是由放射性同位素、生物素或熒光染料等進(jìn)展標(biāo)記后，能與目的基因片段特異性雜交的序列的核酸片段。

59、根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。DNA探針：DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA。這類探針多為*一基因的全部或局部序列，或*一非編碼序列?？蓮囊呀⒌幕蚪M文庫中篩選別離并克隆制備。cDNA探針plementary DNA：cDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA其中U與A配對?？梢詮囊褬?gòu)建的cDNA文庫中篩查和別離目的基因探針。RNA探針：RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子

60、，所以它與靶序列的雜交反響效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。寡核苷酸探針：根據(jù)基因序列，人工合成一段互補(bǔ)的DNA片段。一般長約1550個bpRNA探針和cRNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。前三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。三、DNA雜交常用的方法用途：用于快捷地檢查出菌落中是否有*個基因，但不能檢出基因的大小或重復(fù)的程度