工程五任務(wù)二三微生物菌種選育

1、工程五任務(wù)二三微生物菌種選育一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。 二、分離思路 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性。采樣：有針對(duì)性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。分離篩選：采用選擇性培養(yǎng)基利用分離技術(shù)得到純種目的

2、菌。發(fā)酵性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營(yíng)養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟 （一）采樣1、采樣對(duì)象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采

3、樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。采取土壤樣品要考慮的幾個(gè)問題土質(zhì)肥，微生物含量高，特別肥沃的土壤中細(xì)菌多，放線菌少；在植物殘?bào)w枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌。離地面520cm處的土壤通氣良好、不受陽光直射，含菌量最高。采土季節(jié)以春秋兩季最好。采土方法：選擇適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)、鏟除表土、取土樣數(shù)十克，盛入事先準(zhǔn)備的無菌防水紙袋中，其上記錄采土?xí)r間、地點(diǎn)、植被情況等。多點(diǎn)采土、混合分離，可以代表每一地塊上的微生物分布平均情況（二）增殖培養(yǎng)含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)如果原有樣品中目的菌含量低，可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì)

4、，培養(yǎng)使之以較其它微生物更快的速度生長(zhǎng)繁殖，從而提高它們?cè)跇悠分械谋壤?，便于分離。富集培養(yǎng)的一般方法：采用有利于目的菌種而不利于無關(guān)微生物的營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件，以達(dá)到使目的菌種在群體中比例上升的目的。 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多。一些有特定物質(zhì)產(chǎn)生能力的菌種，不容易富集，只有通過大量艱苦的工作篩選取得。某些細(xì)菌的富集條件 富集對(duì)象 接種菌樣添加營(yíng)養(yǎng)物(g)特殊培養(yǎng)條件好氧氨基酸氧化菌土壤好氧，pH7.0好氧性芽孢桿菌土壤，巴氏消毒 好氧

5、，pH7.0氨基酸發(fā)酵性梭菌土壤，巴氏消毒 厭氧，pH7.0耐堿解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6 厭氧八疊球菌土壤 葡萄糖20厭氧，pH23 乳酸菌植物體或牛奶 葡萄糖20厭氧，pH6.5 腸道細(xì)菌土壤或污水葡萄糖20，CaCO320好氧或厭氧， pH7.0 丙酸菌干酪 乳酸鈉20厭氧，pH7.0 醋酸菌果實(shí)或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0注：培養(yǎng)基成分為酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO4 1.0g，MgSO47H2O 0.2g，加水1000ml。一般培養(yǎng)在30下。（三）培養(yǎng)分離純化 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化

6、。在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。稀釋分離法 稀釋倒 平板法 平板 涂布法注意：必須要做多個(gè)濃度的稀釋分離平板。 劃線分離法平板劃線法（四）篩 選1、初篩：從分離得到的大量微生物中，將目標(biāo)微生物 篩選出來的過程。常用的初選方法： 水解酶產(chǎn)生菌的篩選： 將酶的作用底物加在培 養(yǎng)基中，接種后適溫培 養(yǎng)，根據(jù)菌苔周圍是否 產(chǎn)生水解圈篩選出水解 酶產(chǎn)生菌。一般采用平板篩選。 拮抗菌的篩選對(duì)峙培養(yǎng)： 將病原指示菌與待測(cè)菌株 相對(duì)接種在平板上適溫培 養(yǎng)，根據(jù)病原菌的生長(zhǎng)情 況篩選出拮抗性菌株。分初篩、復(fù)篩。2）搖瓶發(fā)酵篩選：

7、將待測(cè)菌株進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，取 發(fā)酵濾液進(jìn)行活力測(cè)定。2、復(fù)篩：在初篩的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步鑒定有希望菌株的 生產(chǎn)能力強(qiáng)弱的過程。 復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)后，發(fā)酵液采用精確的分析方法 進(jìn)行測(cè)定。 復(fù)篩過程中，要結(jié)合培養(yǎng)條件進(jìn)行。 培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)基 pH值 發(fā)酵溫度 供氧量等。（五）菌種鑒定 經(jīng)典分類鑒定方法：形態(tài)特征、生理生化特征、血清學(xué)試驗(yàn)等?，F(xiàn)代分類鑒定方法：遺傳特性、細(xì)胞化學(xué)組分、計(jì)算機(jī)數(shù)值分析。（六）毒性試驗(yàn) 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無

8、須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。任務(wù)三 食品微生物育種技術(shù)一、誘變育種中的幾個(gè)原則 指利用物理或化學(xué)誘變劑處理微生物群體細(xì)胞，促進(jìn)其突變率顯著提高，然后設(shè)法從中選取少數(shù)符合育種目的的突變株。2個(gè)主要環(huán)節(jié)：誘變（隨機(jī)）選用合適的誘變劑和誘變劑量處理大量均勻、分散的微生物細(xì)胞，以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中的突變頻率大大提高。篩選（定向）設(shè)計(jì)有效的篩選方法，將少量正變株中的優(yōu)良菌株挑選出來。（一） 出發(fā)菌株（original strain）出發(fā)菌株指用于誘變育種的起始菌株。 具有有利性狀（如高產(chǎn)、生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求粗放、 標(biāo)記明顯等）； 對(duì)誘變劑敏感野

9、生型菌株；從生產(chǎn)中選育的自發(fā)突變菌株；誘變獲得的高產(chǎn)菌株出發(fā)菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)：出發(fā)菌株的來源：二、誘變育種的方法（二） 菌懸液的制備1. 選用單細(xì)胞或單孢子懸液（均勻、分散）目的：使每個(gè)細(xì)胞能均勻接觸誘變劑； 減少表型延遲現(xiàn)象（誘變后性狀的分離及退化現(xiàn)象）2. 同步培養(yǎng)（生理狀態(tài)一致）3. 菌齡：對(duì)誘變劑最敏感時(shí)期 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞：對(duì)數(shù)期 孢子或芽孢：萌發(fā)前期4.菌懸液的制備方法 物理誘變：生理鹽水配制 化學(xué)誘變：緩沖液配制5. 菌懸液的濃度 酵母菌，霉菌的孢子：106個(gè)/mL 細(xì)菌，放線菌孢子：108個(gè)/mL （三）誘變劑的選擇及處理方法1. 誘變劑的選擇（高效，簡(jiǎn)便） 物理誘變劑：頻度低、大損傷，

10、難修復(fù)，且操作簡(jiǎn)便； 化學(xué)誘變劑：頻度高，點(diǎn)突變，易回復(fù)突變，操作麻煩。 ( NTG超誘變劑）UV是最常用的一種誘變劑2. 劑量的選擇 突變率隨劑量的增加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量, 反而會(huì)使突變率下降。 正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。 在產(chǎn)量變異工作中，常采用相對(duì)殺菌率為7075%, 甚至3070%的劑量。 UV的劑量: 固定UV功率和照射距離,以照射時(shí)間長(zhǎng)短來確定劑量多少。最適劑量：在提高突變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度， 又能使變異向正突變范圍移動(dòng)的劑量。常以殺菌率來表示相對(duì)劑量（劑量-存活率曲線）3. 誘變處理方法單因素處理或多因素的復(fù)合處理：同一誘變

11、劑的重復(fù)使用；兩種或多種誘變劑的先后使用；兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用.（四） 中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜）目的：克服表型延遲表型延遲（phenotypic lag）：表型的改變落后于基因型改變的 現(xiàn)象. 分離性延遲： 突變的基因經(jīng)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后變成純 合狀態(tài)，表型才能表現(xiàn)出來。 生理性延遲： 由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)，突變表型仍不能 表現(xiàn)出來。分離性延遲的原因: 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中，單核細(xì)胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，多核細(xì)胞的核也成倍增加，誘變對(duì)數(shù)期的細(xì)胞時(shí)，突變通常發(fā)生在一個(gè)核上，故其變異或非變異的細(xì)胞必須經(jīng)過一代或幾代繁殖才能分離，這種純種變異細(xì)胞出現(xiàn)的推遲現(xiàn)象稱為分離延遲現(xiàn)象。生理性延遲的原因: 當(dāng)

12、變異細(xì)胞由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時(shí),由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發(fā)揮作用,必須經(jīng)過細(xì)胞多代分離后,才能將這些非變異的酶稀釋掉,最終達(dá)到變異后應(yīng)該表現(xiàn)的形態(tài),如營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選過程。（五）突變株的篩選 初篩 復(fù)篩1. 初篩（以量為主）（1）利用形態(tài)變異：需預(yù)先測(cè)定形態(tài)與產(chǎn)量的相關(guān)性（2）根據(jù)平板顏色反應(yīng)直接挑選 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素）透明圈直徑（H）/菌落直徑（C）：產(chǎn)量高低（初篩指標(biāo)）2. 復(fù)篩（以質(zhì)為主，定量測(cè)定）搖瓶培養(yǎng)，直接檢測(cè)所需產(chǎn)物方法需簡(jiǎn)便、快速2步誘變育種的基本原則：

13、選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑； 挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株； 處理單細(xì)胞或單孢子懸液； 選用最適的誘變劑量； 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)； 利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)； 設(shè)計(jì)高效篩選方案； 創(chuàng)造新型篩選方法。三. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選（1）幾個(gè)概念：三類培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（MM, minimal medium）-：某野生型能生長(zhǎng)的最低成分的組合培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM,complete medium）+：各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型能生長(zhǎng)的天然或半組合培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM, supplemental medium）A:-+A B:-+B相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型能生長(zhǎng)的組合或半組合培養(yǎng)基三種遺傳型：野生型（wild t

14、ype） 從自然界分離到的、發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。A+B+, 可在-生長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph） 野生型菌株經(jīng)誘變劑處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)的突變菌株（主要指合成維生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。 A+B-：能在+、B生長(zhǎng) A-B+：能在+、A生長(zhǎng) A-B-：能在+生長(zhǎng)原養(yǎng)型（prototroph） 營(yíng)養(yǎng)缺陷型經(jīng)回復(fù)突變或重組，回到原來野生型的營(yíng)養(yǎng)要求 A+B+, 可在-生長(zhǎng)（2）篩選步驟（5步）誘變處理中間培養(yǎng)淘汰野生型檢出缺陷型鑒定缺陷型中間培養(yǎng)CM或SM培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜?？朔硇脱舆t。淘汰野生型即濃縮缺

15、陷型，以提高檢出率方法 抗生素法（G+細(xì)菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 菌絲過濾法（絲狀真菌、放線菌） 饑餓培養(yǎng)（無N）MM 612 h 2N培養(yǎng)(2N)MM 12 h 加抗生素(或菌絲過濾)，培養(yǎng)過夜 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出方法夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法逐個(gè)檢出法影印平板法 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定生長(zhǎng)譜法：快速，直觀分兩步：a.三大類營(yíng)養(yǎng)要求（氨基酸、維生素、核苷酸）的鑒定b.具體到某一種營(yíng)養(yǎng)要求的鑒定(哪一種氨基酸,哪一種 維生素,或哪一種堿基)具體操作:一般采用“濾紙片法” a. 不含維生素的酪素水解液或氨基酸混合液 b. 維生素混合液 c. 0.1%堿水解酵母核酸液a b c三大類營(yíng)養(yǎng)要求的鑒

16、定：以氨基酸缺陷為例進(jìn)行說明將18種氨基酸按右表分為6組特點(diǎn)：每2組只有一種共同物質(zhì)單一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求的鑒定：組別化合物代號(hào)1178910112271213141533812161718449131619205510141719216611151820211 3 52 4 6（3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途生產(chǎn)菌 (氨基酸、核苷酸、維生素等高產(chǎn)菌需求)；研究代謝途徑和雜交、轉(zhuǎn)化等遺傳規(guī)律的遺傳標(biāo)記。 誘變育種的程序： 出發(fā)菌株（純化） 前培養(yǎng)（ CM ，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期） 菌懸液制備 活菌計(jì)數(shù) 誘變預(yù)備實(shí)驗(yàn)（劑量存活率曲線） 誘變處理（相對(duì)殺菌率為70-75%，30-70%） 活菌計(jì)數(shù) 中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜，克服表型延遲） 突變株分離 初篩 復(fù)篩 生產(chǎn)性能試驗(yàn) 菌種（鑒定與）保藏 二、 雜交育種 發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種的選育主要采用誘變育種方法。但是，一個(gè)菌種長(zhǎng)期使用誘變劑處理之后，其生活能力一般要逐漸下降，例如生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，孢子量減少，代謝減慢，產(chǎn)量增加緩慢，誘變因素對(duì)產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，有必要利用雜交育種方法。 雜交育種是指將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合（或接合）使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。 1、雜交育種的目的在于： 1）通過