臨床微生物標(biāo)本培養(yǎng)前處理課件

1、 臨床微生物標(biāo)本培養(yǎng)前處理張秀珍標(biāo)本采集處理血液培養(yǎng)相關(guān)問題腦脊液相關(guān)問題糞便相關(guān)問題生殖道標(biāo)本相關(guān)問題膿,吸出液及組織標(biāo)本相關(guān)問題痰標(biāo)本相關(guān)問題咽標(biāo)本相關(guān)問題真菌培養(yǎng)相關(guān)問題尿標(biāo)本相關(guān)問題血培養(yǎng)主要病原菌：沙門菌、布氏桿菌、其他革蘭陰性桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以下菌應(yīng)視為非病原菌(除非1次血培養(yǎng)分離出)：芽孢桿菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌、草綠色鏈球菌、棒狀革蘭陽(yáng)性桿菌從兩個(gè)獨(dú)立的皮膚位點(diǎn)采血，每瓶采集10ml#135C 空氣中孵育5天每天檢查濁度并翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶#2#318小時(shí)后傳進(jìn)行次代培養(yǎng)當(dāng)培養(yǎng)瓶顯示細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行革蘭染色和傳代培養(yǎng)革蘭陽(yáng)性球菌接種血平皿奧普托欣試驗(yàn)革蘭陰

2、性桿菌接種血平皿和麥康凱平皿革蘭陰性雙球菌或球桿菌接種巧克力平皿和血平皿CO2中孵育72h#5#4將重要的革蘭染色結(jié)果盡快通知臨床醫(yī)生對(duì)重要病原菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)#6例如：肺炎克雷伯菌例如：肺炎鏈球菌 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution血培養(yǎng)是診斷敗血癥最有價(jià)值的手段敗血癥是一個(gè)非常嚴(yán)重的問題.血液中的微生物在3分鐘內(nèi)到達(dá)每個(gè)器官.在死于敗血癥的患者中,盡管采用抗生素給與合適的治療，1/4的人死亡時(shí)，血中循環(huán)的微生物為10/cc或更少 Septicemia微生物或其產(chǎn)物在血液中引起疾病循環(huán)的 CFU/ml vs. 病原體成人 (1

3、2 歲): 1 CFU/ml金黃色葡萄球菌 27%銅綠假單胞菌55%大腸埃希菌62%其他菌種40%From Mayo Clinic, Boston City Hosp., National Childrens Hosp., Univ. of Washington, Seattle.循環(huán)的 CFU/ml vs. 病原體兒童: 5 CFU/ml任何病原體19% 10 CFU/ml任何病原體27%新生兒: 4 CFU/ml大腸埃希菌26%From Mayo Clinic, Boston City Hosp., National Childrens Hosp., Univ. of Washington

4、, Seattle, York Hosp., York, PA. 1 CFU/ml任何病原體42%用于培養(yǎng)的血液體積 體重 磅 千克體積 (ml)/穿刺總量/2次穿刺1% 全血體積% 總血液體積199042204040 ml1-2%體積% 陽(yáng)性血培養(yǎng)結(jié)果 vs. 采集的套數(shù)%99%89%80%真陽(yáng)性20 ml/套Mayo Clinic Study立即獲得足夠血液并且開始抗生素治療從不同部位獲得2-3套血培養(yǎng)(40-60ml血液) 最好在5分鐘內(nèi)采集#1#2采集血培養(yǎng)時(shí)間的重要性9% +14% +9% +11% +發(fā)熱高峰前12-2.5小時(shí)發(fā)熱高峰前2.5-0.5小時(shí)發(fā)熱高峰期間發(fā)熱高峰后1-1

5、2小時(shí)166 病人105 病人199 病人258 病人Thomson et al. 1991. ASCP. Mayo Clinic Study要學(xué)會(huì)導(dǎo)管相關(guān)感染的診斷關(guān)鍵點(diǎn): 患者必須有菌血癥檢測(cè)導(dǎo)管相關(guān)感染移走導(dǎo)管 Maki Roll (半定量)超聲波降解和稀釋 (定量)通過管腔抽吸 (定量)保留導(dǎo)管管腔刷定量培養(yǎng) (CVC & 外周血)達(dá)到陽(yáng)性的時(shí)間 (CVC & 外周血)兩個(gè)血培養(yǎng)瓶必須同一時(shí)間抽取CVC陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間(TTP)比外周血快 2 小時(shí)短期插管 81% 敏感性 & 92% 特異性長(zhǎng)期插管 93% 敏感性 & 75% 特異性不需要拔掉導(dǎo)管-陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間Raad, I. et al

6、. 2004. Ann. Int. Med. 140:18.6138 份即時(shí)血培養(yǎng); 191份兩個(gè)血培養(yǎng)瓶中鑒定的細(xì)菌相同 (25份不同). 108 (1.8 %) 有導(dǎo)管相關(guān)性感染; 9.8% 僅僅只有CVC培養(yǎng)陽(yáng)性.Maki 滾動(dòng)法導(dǎo)管尖陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果導(dǎo)管血在外周血陽(yáng)性之前2 小時(shí)內(nèi)陽(yáng)性 報(bào)告: CVC不可能是菌血癥的來源2.導(dǎo)管血在外周血陽(yáng)性 2 小時(shí)之前陽(yáng)性 報(bào)告: CVC 可能是菌血癥的來源3. 只有其中一瓶報(bào)警陽(yáng)性 (如果所有瓶子中的血量足夠)報(bào)告: 可能污染; 患者無菌血癥根據(jù)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間判讀污染細(xì)菌血培養(yǎng)污染定義為在幾次血培養(yǎng)中單個(gè)血培養(yǎng)下列細(xì)菌陽(yáng)性:凝固酶陰性葡萄球菌棒狀桿菌

7、微球菌丙酸桿菌 芽孢桿菌血培養(yǎng)污染 vs. 皮膚消毒% 污染Studies from Baylor, Nashville, & France敗血癥 vs. “污染的” 血培養(yǎng)%陽(yáng)性Mayo Clinic Study心內(nèi)膜炎菌血癥皮膚定植細(xì)菌#血培養(yǎng)套數(shù)腦脊液（CSF)培養(yǎng)主要病原菌：B群溶血鏈球菌（新生兒），流感嗜血桿菌（2月-2歲兒童），肺炎鏈球菌，腦膜炎奈瑟氏菌最少1ml，最佳5ml醫(yī)生通過無菌皮膚穿刺采集腦脊液（腰椎穿刺）于無菌管中。第二管和第三管用于微生物學(xué)檢測(cè)。# 11500g離心15分鐘（可能的話）# 2# 3用吸管吸去上清，留下1cc的腦脊液沉淀X注意：不要傾倒# 4滴一滴沉淀于

8、巧克力平皿和血平皿上下吸取10次以上混勻沉淀# 5CO2中孵育72小時(shí)# 6將一大滴沉淀滴在玻片上。不要涂開。自然干燥并進(jìn)行革蘭染色。如見到大量多形核白細(xì)胞則強(qiáng)烈支持感染# 7 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution腦脊液（CSF)培養(yǎng)主要病原菌：B群溶血鏈球菌（新生兒），流感嗜血桿菌（2月-2歲兒童），肺炎鏈球菌，腦膜炎奈瑟氏菌最少1ml，最佳5ml醫(yī)生通過無菌皮膚穿刺采集腦脊液（腰椎穿刺）于無菌管中。第二管和第三管用于微生物學(xué)檢測(cè)。# 11500g離心15分鐘（可能的話）# 2# 3用吸管吸去上清，留下1cc的腦脊液沉淀X注意：不要

9、傾倒# 4滴一滴沉淀于巧克力平皿和血平皿上下吸取10次以上混勻沉淀# 5CO2中孵育72小時(shí)# 6將一大滴沉淀滴在玻片上。不要涂開。自然干燥并進(jìn)行革蘭染色。如見到大量多形核白細(xì)胞則強(qiáng)烈支持感染# 7 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution#1#2接種血平皿，麥康凱平皿，Hektoen或DCA，若懷疑弧菌則還接種TCBS平皿。37 C 空氣孵育48h#3糞便標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)進(jìn)行接種或置于cary-blair運(yùn)輸培養(yǎng)基中#4糞便培養(yǎng)重要的病原菌：沙門菌、志賀菌、彎曲桿菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌&難辨梭菌（在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室可能

10、檢測(cè)不出）選擇血性或膿性的部分進(jìn)行接種血平皿上氧化酶陽(yáng)性的革蘭陰性桿菌需進(jìn)一步鑒定將菌落接種TCBS或含0-6鹽濃度的肉湯中。麥康凱、HEK或DCA平皿上不利用乳糖的革蘭陰性桿菌需進(jìn)一步鑒定。氧化酶陽(yáng)性、濕潤(rùn)的米色菌落革蘭染色顯示彎曲或螺旋形的桿菌彎曲桿菌屬Campy瓊脂#6 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution#5將菌落接種至Campy瓊脂或使用濾紙法。微需氧環(huán)境下37-42 C 孵育 72 hCO2孵育72h TM培養(yǎng)基上尋找淋球菌，血平皿上尋找酵母菌# 2血平皿& Thayer-Martin平皿# 1# 1接種Thayer-Ma

11、rtin培養(yǎng)基&革蘭染色將拭子在玻片上滾動(dòng)制成一個(gè)細(xì)胞厚度的涂片；尋找“線索細(xì)胞”C. 懷孕35-37周的孕婦陰道或肛拭子營(yíng)養(yǎng)肉湯中孵育過夜血平皿上次代培養(yǎng)檢測(cè)B群鏈球菌# 1# 2CO2中孵育48小時(shí)D. 女性的陰道拭子# 1血平皿上尋找酵母菌，T-M培養(yǎng)基上尋找淋球菌革蘭染色輔助診斷細(xì)菌性陰道病# 1# 230 min內(nèi)將拭子置于0.5ml生理鹽水中檢測(cè)滴蟲T-M培養(yǎng)基上的淋球菌血平皿上的酵母菌A. 女性的子宮頸或肛拭子B. 男性的尿道拭子非病原菌金黃色葡萄球菌任何革蘭陰性桿菌，包括大腸桿菌和變形桿菌B群溶血鏈球菌（GBS)，僅為孕婦報(bào)告生殖道標(biāo)本培養(yǎng)主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴蟲，酵母菌&

12、女性的細(xì)菌性陰道病綜合征，孕婦攜帶的B群溶血鏈球菌 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution陰道感染的病因?qū)WFrom a major U.S. Ob/Gyn department.衣原體混合性傳播疾病念珠菌女性百分比細(xì)菌性陰道炎正常女性生殖道感染的癥狀和致病菌子宮頸炎陰道炎其他細(xì)菌性陰道炎念珠菌陰道毛滴蟲衣原體淋病奈瑟菌支原體/脲原體損傷:單純皰疹人乳頭瘤病毒梅毒螺旋體觸染性軟疣 痰標(biāo)本主要病原菌：肺炎鏈球菌，克雷伯菌屬，流感嗜血桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌。非病原菌：酵母菌，草綠色鏈球菌，凝固酶陰性葡萄球菌病人需用水清潔口腔，深咳

13、肺部痰，不要唾液#1進(jìn)行革蘭染色以評(píng)價(jià)標(biāo)本是否適于接種。向臨床醫(yī)生盡快報(bào)告重要的革蘭染色結(jié)果#2#3好：很少扁平上皮細(xì)胞奧普托欣紙片CO2中孵育48小時(shí)#4接種巧克力平皿，血平皿和麥康凱平皿#5拒絕：大量 扁平上皮細(xì)胞肺炎克雷伯菌對(duì)重要病原菌進(jìn)行鑒定&藥敏試驗(yàn)金黃色葡萄球菌肺炎鏈球菌膽汁溶菌 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution奧普托欣流感嗜血桿菌有意義的細(xì)菌濃度值（CFU/ml）標(biāo)本有意義的濃度 CFU/ml自然咳痰107誘導(dǎo)痰不確定氣管內(nèi)吸取物106支氣管肺泡灌洗液104保護(hù)性毛刷103支氣管灌洗液不做培養(yǎng)氣管內(nèi)吸取物加等量的N-

14、乙酰-L-半胱氨酸或溶痰劑漩渦震蕩30s加0.01ml標(biāo)本至1.0ml的TSB每個(gè)平板涂0.01ml血平皿巧克力平皿麥康凱平皿1：100稀釋1：2稀釋生長(zhǎng)出50個(gè)菌落支氣管肺泡灌洗液將所有標(biāo)本裝入50ml離心管內(nèi)離心20min，混勻10ml沉淀液，漩渦震蕩30s每個(gè)平板涂0.01ml血平皿巧克力平皿麥康凱平皿Use pipette.用吸管吸取0.1ml至1mlTSB（1：10稀釋）生長(zhǎng)出10個(gè)菌落制作涂片（細(xì)胞離心)保護(hù)性毛刷將毛刷置于1ml稀釋液中震蕩30s每個(gè)平板涂0.01ml血平皿巧克力平皿麥康凱平皿生長(zhǎng)出10個(gè)菌落Use PRAS if anaerobic若懷疑厭氧菌則使用PRAS制作

15、涂片（細(xì)胞離心)膿，吸取物或組織標(biāo)本主要病原菌：金黃色葡萄球菌，化膿鏈球菌，其他溶血鏈球菌，銅綠假單胞菌，其他革蘭陰性桿菌。非病原菌：凝固酶陰性葡萄球菌，少量的棒狀革蘭陽(yáng)性桿菌用酒精消毒傷口 周圍皮膚最好的標(biāo)本是吸取物和組織最差的標(biāo)本是拭子#1接種血平皿和麥康凱平皿如果是吸取物或組織，進(jìn)行革蘭染色，將重要結(jié)果通知臨床醫(yī)生#2#3銅綠假單胞菌中孵育48小時(shí)#4對(duì)1或2種重要病原菌進(jìn)行鑒定&藥敏試驗(yàn)金黃色葡萄球菌為主溶血鏈球菌肺炎克雷伯菌混合的2種腸道革蘭陰性桿菌：2種均報(bào)告；當(dāng)檢出3種或更多病原菌時(shí)，報(bào)告“混合菌叢”并描述性列出假單胞菌，金葡菌，變形桿菌，腸道革蘭陰性桿菌等。 Ellen Jo

16、Baron 2007; Use with proper attribution#5咽部標(biāo)本培養(yǎng) 主要病原菌：A群溶血鏈球菌。 選擇性報(bào)告：溶血隱秘桿菌拭子擦取咽部和扁桃體。不要碰觸舌頭和面頰。將拭子擦拭血平皿（羊血或馬血）的1/5區(qū)域在第一區(qū)貼相鄰的兩紙片：復(fù)方磺胺和桿菌肽# 1拭子# 2在燭缸中37C孵育過夜并檢查平板；若陰性，繼續(xù)孵育過夜總孵育時(shí)間48小時(shí)# 5# 3分區(qū)畫線3或4區(qū)接種環(huán)溶血菌落， 0.5 mm, 對(duì)復(fù)方磺胺耐藥，對(duì)桿菌肽敏感A群鏈球菌（觸酶陰性）# 6桿菌肽& SXT 紙片# 4桿菌肽復(fù)方磺胺PYR陽(yáng)性可確證A群鏈球菌# 7 Ellen Jo Baron 2007; U

17、se with proper attribution不要報(bào)告咽炎中非致病菌：金黃色葡萄球菌肺炎鏈球菌流感嗜血桿菌卡他莫拉菌溶血鏈球菌所有革蘭陰性桿菌所有酵母菌報(bào)告結(jié)果： 1+ to 4+ A群溶血鏈球菌 或1+ to 4+ 非A群溶血鏈球菌 或未檢出溶血鏈球菌 # 8# 9#1#2常規(guī)：接種沙氏平皿和Mycobiotic培養(yǎng)基。 30 C 空氣孵育四周。對(duì)于皮膚癬菌：接種Mycobiotic和DTM培養(yǎng)基組織，皮膚刮取物或指甲：將一小塊完整的標(biāo)本插入瓊脂表面#3重要的真菌：組織活檢，痰，腦脊液，血培養(yǎng)皮膚癬菌：皮膚刮片，指甲刮片，根部的頭發(fā)不要研磨組織：使用解剖刀將其切成小塊#4真菌培養(yǎng) 重要

18、病原菌：新型隱球菌，人芽囊原蟲 ，皮膚癬菌，和 其他真菌（考慮標(biāo)本來源和病人情況）拭子僅用于酵母菌的分離接種血平皿和沙氏平皿 Ellen Jo Baron 2008; Use with proper attribution#6將標(biāo)本研于一滴10%KOH，加蓋玻片后鏡檢真菌接種后7天內(nèi)每日觀察平皿，之后每周兩次光滑菌落酵母菌毛狀菌落絲狀真菌用通氣膠帶粘貼平皿的側(cè)面或兩邊#5#1babUrine Culture尿培養(yǎng)主要病原菌：大腸埃希菌，變形桿菌，克雷伯菌，其他革蘭陰性桿菌，腸球菌，腐生葡萄球菌，純的金黃色葡萄球菌#2接種血平皿和麥康凱平皿#3空氣孵育24小時(shí)收集中段尿a#4菌落計(jì)數(shù)0.001m

19、l接種環(huán)若 2 種菌生長(zhǎng)，對(duì)每種菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)；若2種菌生長(zhǎng)，報(bào)告“混合菌群”#5注意: 革蘭陰性桿菌在血平皿和麥 康凱平皿上均生長(zhǎng)良好革蘭陽(yáng)性球菌僅在血平皿上生長(zhǎng)良好GNR#675,000 cfu/ml50,000 cfu/ml100,000 cfu/ml Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attributionGPC尿道感染每年850萬例尿路感染, 90%為女性1/2.5個(gè)婦女在一生中會(huì)得UTI下行性感染：血流腎臟膀胱（金黃色葡萄球菌，酵母菌，結(jié)核分枝桿菌）上行性感染：尿道膀胱腎盂 血流尿培養(yǎng)的劃線方式第一區(qū) = 50,000 cfu/ml第二區(qū)= 75,000 cfu/ml第三區(qū)= 100,000 cfu/ml沿中