天然產(chǎn)物中多糖的提取、純化與鑒定

1、實(shí)驗(yàn)三、天然產(chǎn)物中多糖的分離、純化與鑒定第一部分多糖的提取、純化1、目的要求了解多糖提取和純化的一般方法。2、實(shí)驗(yàn)原理多糖類物質(zhì)是除蛋白質(zhì)和核酸之外的又一類重要的生物大分子。早在60年代，人們就 發(fā)現(xiàn)多糖復(fù)雜的生物活性和功能。它可以調(diào)節(jié)免疫功能，促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的生物合成，調(diào) 節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，提高生物體的免疫力，具有抗腫瘤、抗瘍和抗愛(ài)滋病(AIDS)等功效。由于高等真菌多糖主要是細(xì)胞壁多糖，多糖組分主要存在于其形成的小纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交 織的基質(zhì)中，利用多糖溶于水而不溶于醇等有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，通常采用熱水浸提后用酒精沉 淀的方法，對(duì)多糖進(jìn)行提取。影響多糖提取率的因素很多，如：浸提溫度、時(shí)間、加水量以

2、及脫除雜質(zhì)的方法等都會(huì)影響多糖的得率。多糖的純化，就是將存在于粗多糖中的雜質(zhì)去除而獲得單一的多糖組分。一般是先脫除 非多糖組分，再對(duì)多糖組分進(jìn)行分級(jí)。常用的去除多糖中蛋白質(zhì)的方法有：Sevag法、三氟 三氯乙烷法、三氯醋酸法，這些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白質(zhì)沉淀，其中Sevag 方法脫蛋白效果較好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4： 1比例混合，加到樣品中振搖，使 樣品中的蛋白質(zhì)變性成不溶狀態(tài)，用離心法除去。本實(shí)驗(yàn)采用Sevag法(氯仿：正丁醇=4： 1混合搖勻)進(jìn)行脫蛋白，用DEAE Sepharose 層析柱進(jìn)行純化，然后合并多糖高峰部分，濃縮后透析，凍干，得多糖級(jí)分。3、試劑和器材一、

3、試劑平衡緩沖溶液：0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2。洗脫液：A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2。氯仿、正丁醇、乙醇(95%)等，均為分析純。二、材料灰樹花子實(shí)體。三、器材DEAE Sepharose Fast Flow，旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀，搖床，離心機(jī)，層析柱：26x10。4、操作方法一、粗多糖的提取將多糖子實(shí)體切碎烘干后稱量，采用熱水浸提法，每次原料和水之比均為1： 5,浸提 溫度為70C 80C，浸提時(shí)間3 5h，共提取4次，合并4次浸提液。真空

4、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮， 濃縮一倍體積。對(duì)多糖提取液需進(jìn)行脫色處理，即以1 %的比例加入活性炭，攪拌均勻15min 后過(guò)濾即可。在濃縮液中加入3倍體積的乙醇攪拌，沉淀為多糖和蛋白質(zhì)的混合物，此為粗 多糖。它只是一種多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、單糖、低聚糖、蛋 白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，必須進(jìn)一步分離純化。二、粗多糖的純化粗多糖溶液加入Sevag試劑(氯仿：正丁醇=3： 1混合搖勻)后，置恒溫振蕩器中震蕩過(guò) 夜，使蛋白質(zhì)充分沉淀，離心(3000r /min)分離，去除蛋白質(zhì)。然后濃縮，透析，加入4倍 體積的乙醇沉淀多糖，將沉淀凍干。取樣品0.1g溶于10ml 0.01mol/L Tris-HCL,

5、PH=7.2的平衡緩沖液中。上樣，用Buffer A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; Buffer B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2 進(jìn)行線性洗脫，分部收集。各管用硫酸苯酚法檢測(cè)多糖。合并多糖高峰部分，濃縮后透析，凍 干，即得多糖級(jí)分。第二部分多糖的鑒定1、目的要求了解薄層層析法分析單糖組分的原理和方法。了解紅外光譜法鑒定多糖的原理和方法。2、實(shí)驗(yàn)原理采用薄層層析法分析單糖組分。薄層層析顯色后，比較多糖水解所得單糖斑點(diǎn)的顏色和 Rf值與不同單糖標(biāo)樣參考斑點(diǎn)的顏色和Rf值，確定樣品多糖的單糖組分。多糖

6、的分析鑒定一般借助于氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、紅外光譜(IR)和紫外 光譜(UV)等技術(shù)，氣相(液相)色譜一質(zhì)譜(GC / HPLCMS)聯(lián)用技術(shù)成為分析多糖更為有效 的手段。本實(shí)驗(yàn)利用紅外光譜對(duì)多糖進(jìn)行鑒定。多糖類物質(zhì)的官能團(tuán)在紅外譜圖上表現(xiàn)為相應(yīng)的 特征吸收峰，我們可以根據(jù)其特征吸收來(lái)鑒定糖類物質(zhì)。0H的吸收峰在36503590cm 一1，CH的I申縮振動(dòng)的吸收峰在29622853cm1，C=O的振動(dòng)峰為151016701 之間的吸收峰，CH的彎曲振動(dòng)吸收峰為14851445cm 1，毗喃環(huán)結(jié)構(gòu)的C0的吸收 峰為 1090cm 1。3、試劑和器材一、試劑濃硫酸，氫氧化鋇。

7、展開劑:正丁醇：乙酸乙酯：異丙醇：醋酸：乙醇：水：毗啶=7： 20： 12： 7： 6： 6。顯色劑:1，3二羥基萘硫酸溶液(0.2%1，3一二羥基萘乙醇溶液)：濃硫酸=1： 0.04 (V/V)。單糖標(biāo)準(zhǔn)品。二、器材沸水浴，玻璃板，傅里葉變換紅外光譜。4、操作方法一、單糖組分分析1 .薄層板制備：稱取硅膠5g于50ml燒杯中，加入用12 mL 0.3mol/ L磷酸二氫鈉水 溶，用玻璃棒慢慢攪拌至硅膠分散均勻，鋪在玻璃板上(7. 5cmx10cm)，110C活化1h。即 置有干燥劑的干燥箱中備用。點(diǎn)樣：稱取少許的多糖(0.1克)于2. 0mL離心管中，加入1M的硫酸1mL，沸水 浴水解2h，

8、然后加氫氧化鋇中和至中性，過(guò)濾除去硫酸鋇沉淀，得多糖水解澄清液。以此 水解液和單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行點(diǎn)樣進(jìn)行薄層層析展開。用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)， 點(diǎn)樣基線距底邊2.0cm，點(diǎn)樣直徑為24mm，點(diǎn)間距離約為1.52.0cm，點(diǎn)間距離可視斑 點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。展開：展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中， 浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.51.0cm (切勿將樣點(diǎn)浸入展開劑中)，密封室蓋，等 展開至規(guī)定距離(一般為1015cm)，取出薄層板，晾干。顯色：將展開涼干后的薄板再在100C烘箱內(nèi)烘烤30分鐘，將顯色劑均勻地噴灑在 薄板上，此板在110C下烘烤10分鐘即可顯色。薄層顯色后，將樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜進(jìn)行比較，參考斑點(diǎn)顏色、相對(duì)位置及Rf值， 確定樣品中有哪幾種糖。二、紅外光譜在多糖分析上的應(yīng)用將凍干后的樣品用KBr壓片，在4000400cm-1區(qū)間內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，有如下的 多糖特征吸收峰：3401 cm-1 (0-H)，2919 cm-l(C-H), 1381 cm-1 及