分子發(fā)光分析..課件

1、2022/7/24 第12章 分子發(fā)光分析12.1 概述 分子發(fā)光分析法：基于被測物質的基態(tài)分子吸收能量激發(fā)到較高能態(tài)后，返回基態(tài)時，以發(fā)射輻射的方式釋放能量，通過測量輻射光強度對被測物質進行定量測定的分析方法。 當分子吸收光能被激發(fā)到較高能態(tài)，返回基態(tài)時發(fā)射出與激發(fā)光波長相同或不同輻射的現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。 最常見的兩種光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。由此建立的分析方法稱作分子熒光分析和磷光分析。2022/7/2412.2 熒光和磷光分析基本原理1. 熒光和磷光的產(chǎn)生(1) 分子的能級與躍遷 分子中每個電子能級中都包含一系列的振動和轉動能級。 基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特

2、定頻率的輻射；量子化。 激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式; 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1、S2 基態(tài)(S0)稱為熒光； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1、T2 基態(tài)(S0)稱為磷光。2022/7/24(2) 電子激發(fā)態(tài)的多重度 電子激發(fā)態(tài)的多重度：M = 2S + 1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(等于0或1)大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)(Pauli不相容原理，s =, S = 0, M = 1)； 激發(fā)時電子自旋方向不變，分子處于激發(fā)單重態(tài)S1, S2； 激發(fā)時電子自旋方向改變，S = 1, M = 3，分子處于激發(fā)三重態(tài)T1, T2； 三重態(tài)能級比相應單重態(tài)能級低(洪特規(guī)則)。 S0T1 禁

3、阻躍遷。2022/7/24(3) 激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑 分子的激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，電子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉換系間竄越振動弛豫外轉換無輻射躍遷以速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢，發(fā)光強度高。熒光：10-910-7s，第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)磷光：10-410s，第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)2022/7/24S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉換振動弛豫能量l 2l 1l 3 外轉換l 2T2內(nèi)轉換振動弛豫2022/7/24輻射能量傳遞過程 發(fā)射熒光：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能

4、級基態(tài) (S1 S0躍遷)，發(fā)射波長為 2的熒光，10-910-7 s。 發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小， 2 2 1 . 發(fā)射磷光：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài) (T1 S0躍遷)； 電子由S0進入T1的可能過程： S0激發(fā)振動弛豫內(nèi)轉移系間跨越振動弛豫T1 S0 T1禁阻躍遷，發(fā)光速度很慢：10-410 s。 光照停止后，可持續(xù)一段時間。2022/7/24非輻射能量傳遞過程 振動弛豫：同一電子能級內(nèi)分子以熱能交換形式由高振動能級至低振動能級間的躍遷。 內(nèi)轉換：同一多重態(tài)電子能級間的無輻射能量交換。 通過振動弛豫和內(nèi)轉換，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。 系間

5、竄越：不同多重態(tài)有重疊的振動能級間的非輻射躍遷。是禁阻躍遷，通過自旋軌道耦合進行。 外轉換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉移能量的非輻射躍遷。 外轉換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。2022/7/24 2. 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(1)激發(fā)波長選擇與激發(fā)光譜曲線 不同波長入射光具有不同的激發(fā)效率。 固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，測量不同激發(fā)波長下化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與入射光波長的關系曲線(曲線I )。 激發(fā)光譜曲線峰值處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大。2022/7/24(2) 熒光及磷光光譜 固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長)，測定化合物發(fā)射的熒光強度(或磷光強度)與發(fā)射

6、光波長的關系曲線(圖中曲線II或III)。2022/7/242022/7/24(3) 發(fā)射光譜的特性 a. Stokes位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。 b. 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關 電子激發(fā)到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2, 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如2 )。 c. 鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與其吸收光譜(基態(tài)第一態(tài))成鏡像對稱關系。 2022/7/24鏡像規(guī)則2022/7/243. 熒光的產(chǎn)生與分子結構的關系 (1) 分子產(chǎn)生熒光必須具備的條

7、件 具有一定結構，多為含芳香環(huán)、雜環(huán)的化合物或具有剛性平面的分子 具有一定的熒光效率 熒光效率 代表物質發(fā)射熒光的能力，通常小于1。 熒光效率與激發(fā)態(tài)分子能量釋放各過程的速率常數(shù)有關，如外轉換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。2022/7/24(2) 化合物結構與熒光 躍遷類型：*的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生； 共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移; 剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故熒光量子產(chǎn)率高。如熒光素和酚酞有相似結構，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有; 取代基效應：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強；相反，芳環(huán)上有吸電子基團，熒光減弱或無熒光

8、。2022/7/242022/7/244. 影響熒光強度的因素 外部因素: (1) 溶劑的影響 除一般溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化； (2) 溫度的影響 熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉換去活的幾率增加; (3) 溶液pH 對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制.2022/7/245.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象 自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收 光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。 內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質發(fā)射的熒光的組分，如色胺酸中的重鉻酸鉀；2022/7/246. 溶液熒光的猝滅 碰撞猝滅； 氧的熄

9、滅作用等。2022/7/2412.3 儀器結構流程 測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。 特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。 基本流程如圖：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；光源：高壓氙燈或高壓汞燈檢測器：光電倍增管。2022/7/24同步掃描技術 根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步掃描可分為固定波長差()和固定能量差及可變波長三種； 同步掃描技術可簡化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率； 如圖。 合適的可減少光譜重疊；酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴重重疊，但60n

10、m時，只顯示色氨酸的特征光譜，實現(xiàn)分別測定。2022/7/24可獲得三維光譜圖的儀器 可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時變化時的熒(磷)光光譜圖2022/7/24磷光檢測 熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。測量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源和可控檢測及時間分辨技術。 室溫測量時，不需要杜瓦瓶。2022/7/2412.4 熒光分析方法與應用1. 特點(1) 靈敏度高 比紫外-可見分光光度法高24個數(shù)量級 檢測下限：0.10.1g/cm-3(2) 選擇性強 既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜(3)

11、試樣量少 缺點：應用范圍小2022/7/242.定量依據(jù)與方法 (1) 定量依據(jù) 熒光強度 If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率 ： If = Ia 由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 濃度很低時，將括號項近似處理后： If = 2.3 I0 l c = Kc2022/7/24(2) 定量方法標準曲線法： 配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度；比較法： 在線性范圍內(nèi)，測定標樣和試樣的熒光強度，比較；2022/7/243.

12、 熒光分析法的應用(1) 無機化合物的分析 與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定； 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定； 鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定； 鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定.(2) 生物與有機化合物的分析 見表. 2022/7/242022/7/242022/7/2412.5 磷光分析法的應用1.稠環(huán)芳烴分析 采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質）；見表2.農(nóng)藥、生物堿、植物生長激素的分析 煙堿、降煙堿、新煙堿，2，4-D等分析

13、檢測限0.01 g/cm-3 3.藥物分析和臨床分析 見表2022/7/242022/7/242022/7/2412.6 化學發(fā)光1. 化學發(fā)光反應 在化學反應過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。 A +B = C + D* D* D + h（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物；（2）化學發(fā)光反應多為氧化還原反應，激發(fā)能與反應能相當 E=170300 kJ/mol；位于可見光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時間較長，反應持續(xù)進行； 化學發(fā)光反應存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。2022/7/242.化

14、學發(fā)光效率化學效率：發(fā)光效率：時刻t 的化學發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt 分析物參加反應的速率；2022/7/243.化學發(fā)光強度與化學發(fā)光分析的依據(jù) 在化學發(fā)光分析中，被分析物相對于發(fā)光試劑小得多，對于一級動力學反應： dc/dt =Kc； K 為反應速率常數(shù)。定性依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性；（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強度(S)，其與被測物濃度成線性：2022/7/244.化學發(fā)光反應的類型（1）氣相化學發(fā)光反應a. 一氧化氮與O3的發(fā)光反應 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 發(fā)射的光譜范圍：600875nm，靈敏度

15、1ng/cm-3；b.氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應 O3 O2 + O （1000 C石英管中進行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3； 2022/7/24 O3 O2 + O （1000 C石英管中進行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 發(fā)射光譜范圍：4001400nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與CO的發(fā)光反應： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 發(fā)射光譜范圍：300500nm；靈敏度1ng/cm-3； 氧原子與NO的發(fā)光反應：2022/7/24c.

16、乙烯與O3的發(fā)光反應 乙烯與O3反應，生成激發(fā)態(tài)乙醛： CH2O* CH2O + h 最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應；線性響應范圍1 ng/cm-3 1g/cm-3；2022/7/24（2）火焰中的化學發(fā)光反應 在富氫火焰中，也存在著很強的化學發(fā)光反應；a. 一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 發(fā)射光譜范圍：660770nm； 最大發(fā)射波長：690nm； 在富氫火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 該反應十分迅速；2022/7/24b.硫化物 揮發(fā)性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強的化學發(fā)光（藍色）

17、： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 發(fā)射光譜范圍：350460nm； 最大發(fā)射波長：394nm； 靈敏度： 0.2 ng/cm-3； 發(fā)射光強度與硫化物濃度的平方成正比。2022/7/24（3）液相中的化學發(fā)光反應 機理研究較多，在分析中應用最多；可測痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 應用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）； 化學發(fā)光反應效率：0.150. 05； 魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應過程： 該發(fā)光反應速度慢，某些金屬離子可催化反應；利用這一現(xiàn)象可測定這些金屬離子。魯米諾在堿性溶

18、液中與雙氧水的反應過程：2022/7/245. 化學與生物發(fā)光分析的應用（1） 該發(fā)光反應速度慢，某些金屬離子可催化反應；利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子?？蓽y痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2） 可檢測低至 10-9 mol/L 的H2O2；（3） 間接測定某些生物試樣 氨基酸 + O2 酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通過測定生成的H2O2 ，確定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶2022/7/24 草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧水+稠環(huán)芳烴(能量接受體)+金屬離子+溶劑組成的反應體系，可發(fā)出很強的可見光，發(fā)光效率高，使用不同的稠環(huán)芳烴，發(fā)射出不同顏色的光(冷光源)。2022/7/24生物發(fā)光分析應用 1 在pH 78；熒光素酶(E)和Mg2+的存在下，熒光素(LH2)與磷酸三腺甙(ATP)的反應，生成磷酸腺甙(AMP)熒光素和熒光素酸的復合物和鎂的焦磷酸鹽(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+pH7 - 8復合物與氧反