遺傳性疾病的基因診斷遺傳性疾病基因診斷的策略課件

1、遺傳性疾病的基因診斷遺傳性疾病基因診斷的策略（一）直接診斷策略 基因診斷的直接策略就是通過(guò)各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測(cè)基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。 直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。 （二）間接診斷策略 間接診斷的實(shí)質(zhì)是在家系中進(jìn)行連鎖分析，通過(guò)分析可確定個(gè)體來(lái)自雙親的同源染色體中的哪一條為致病染色體，從而判斷該個(gè)體是否帶有致病基因。 間接診斷不是尋找 DNA 的遺傳缺陷，而是通過(guò)分析DNA的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性估計(jì)被檢者患病的可能性。直接診斷所采用的技術(shù)DNA片段性突變的檢測(cè) （1）Southern 印跡技術(shù)(或PCR直接檢測(cè)） 將基因組DNA

2、用限制性酶水解成無(wú)數(shù)片段經(jīng)凝膠電泳后用堿處理使凝膠中的DNA變性為單鏈，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用標(biāo)記探針與變性單鏈雜交，可使特異條帶顯影。11kb/12kb/12kb/11kb/12kbF基因的直接檢測(cè)22號(hào)內(nèi)含子倒位檢測(cè) 長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增22號(hào)內(nèi)含子（2）多重PCR技術(shù) 在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中放入多對(duì)引物，當(dāng)基因的外顯子發(fā)生缺失時(shí)，根據(jù)條帶缺失的數(shù)目和引物相應(yīng)的位置，可判斷基因中哪一個(gè)或哪幾個(gè)擴(kuò)增部位發(fā)生缺失。DMD基因的檢測(cè)2. 點(diǎn)突變（1） 已知點(diǎn)突變的檢測(cè)方法 a）PCR-RFLP 利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)。若點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位

3、點(diǎn)內(nèi)，可在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者。b）等位基因特異性寡核苷酸雜交被檢基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與長(zhǎng)度為1520bp、經(jīng)標(biāo)記的正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。由于20個(gè)堿基中僅一個(gè)堿基差異即可使DNA分子的Tm值下降 57.5，因此通過(guò)嚴(yán)格控制雜交條件，可使PCR產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針雜交，根據(jù)有無(wú)雜交信號(hào)即可判斷被檢者的擴(kuò)增片段中是否帶有突變點(diǎn)。c）DNA芯片技術(shù)（DNA chip） 在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龍膜等）表面有序地陣列一系列固定于一定位置

4、的分子（探針），當(dāng)標(biāo)記樣品（如用化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法標(biāo)記）與探針進(jìn)行雜交后，用共聚焦熒光自動(dòng)掃描等技術(shù)獲取信息，經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)處理、分析后得到結(jié)果。（2）未知點(diǎn)突變的檢測(cè)方法a) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生兩條與正常 DNA構(gòu)象不同的單鏈，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳時(shí)，不同構(gòu)象的片段顯示不同的電泳遷移率，從 而能區(qū)別正常與突變的DNA。SSCP只適用于檢測(cè) 150200bp長(zhǎng)度的DNA片段。 b) 變性梯度凝膠電泳（DGGE）利用不同序列的DNA分子具有不同的融點(diǎn)溫度(Tm

5、)的特性。設(shè)計(jì)引物時(shí)使被擴(kuò)增的目的片段含有2個(gè)不同的區(qū)域，一個(gè)Tm較高，另一個(gè)較低，將該P(yáng)CR產(chǎn)物在由變性劑形成的梯度凝膠上進(jìn)行電泳，由于正常序列的PCR產(chǎn)物與突變的 PCR 產(chǎn)物的Tm不同，在電泳過(guò)程中Tm較低的區(qū)域被部分解鏈的先后不同，造成電泳遷移率的變化也不同，最后在凝膠中所處的電泳位置也不同，據(jù)此可以區(qū)別正常片段與突變片段。c)異源雙鏈分析（heteroduplex analysis，HA） 正常DNA和突變DNA在一起變性后再緩慢復(fù)性，可使兩者互補(bǔ)形成異源雜合雙鏈，并在錯(cuò)配處形成一個(gè)凸起。在非變性凝膠電泳時(shí)，異源雙鏈片段會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈片段不同的遷移率，從而使二者分開(kāi)。d) 熔

6、點(diǎn)曲線分析(melting curve analysis） DNA片段中突變堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異源雙鏈，所產(chǎn)生的Tm較完全配對(duì)的同源雙鏈的Tm低，在儀器上顯示出不同的曲線從而將突變序列檢測(cè)出來(lái)。所需儀器如高效液相色譜儀(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系統(tǒng)、LightCycler等。e.DNA序列分析（DNA sequencing） Sanger測(cè)序技術(shù)： 以待測(cè)序列的單鏈DNA作為模板，加入一個(gè)引物和dNTP作為底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用過(guò)程中，正常dNTP的摻入使鏈延伸，若ddNTP的摻入則使鏈終止，這樣就可以得到一系列長(zhǎng)度不同的以四種d

7、dNTP結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)電泳后可直接讀出堿基序列。3. 動(dòng)態(tài)突變的檢測(cè) PCR技術(shù) Southern印跡技術(shù)4.基因表達(dá)異常的檢測(cè)定量PCR技術(shù) 1. DNA結(jié)合染料技術(shù) 2. 水解探針技術(shù)(又稱TaqMan probe)技術(shù) 3. 雜交探針技術(shù)(又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (fluorescence resonance energy transfer, FRET)（二）間接診斷所采用的技術(shù)1. 雙等位基因多態(tài)性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP） 第一代DNA的遺傳標(biāo)記，具雙等位基因（bi-allele）多態(tài)性，所含信息量有限。 檢測(cè)方法：Southern印跡技術(shù)Bcl I RFLP（血友病A

8、）2. 多等位基因多態(tài)性小衛(wèi)星序列又稱串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（variable number tandem repeats，VNTR), 第二代DNA的遺傳標(biāo)記，以6 70bp為單位，可重復(fù)數(shù)次至數(shù)十次，以串聯(lián)形式排列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列。等位基因常常達(dá)10 個(gè)以上，信息量比RFLP大得多。 檢測(cè)方法：Southern印跡或PCR技術(shù)F基因連鎖分析 F基因st14位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)B/A/B/CB/CC/DC/B/DPCR檢測(cè)VNTR （st14）位點(diǎn)進(jìn)行家系連鎖分析C/微衛(wèi)星序列 (microsatellite) 以26bp為單位，重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾十次，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR) 。在基因組中

9、出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性。 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP） 第三代DNA的遺傳標(biāo)記，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個(gè)核苷酸的變異。在人類(lèi)基因組中的數(shù)目可達(dá)300萬(wàn)個(gè)，是一種信息量非常大的標(biāo)記系統(tǒng)。 檢測(cè)方法：DNA芯片技術(shù)C50: C49: C45: C44: Cjp:11223C50: C49: C45: C44: Cjp:1221221313C50: C49: C45: C44: Cjp:2112121313C50: C49: C45: C44: Cjp:2112121313C50: C49: C45: C44: Cjp:21

10、12112212C50: C49: C45: C44: Cjp:12212C50: C49: C45: C44: Cjp:21313C50: C49: C45: C44: Cjp:1122312212C50: C49: C45: C44: Cjp:21313C50: C49: C45: C44: Cjp:213131234567891011121314151617181920212223125.8 5.8 2.8 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 N N N 4.8 4.8 4.8 5 5 55.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9

11、0.9 N N N N 4.8 4.8 4.8 4.8 5 5 5 5 1 2 3 45.8 2.8 4.8 4.8 1.2 0.9 inv N 5 52.84.80.9 - 52.84.80.9 - 55.8 4.8 1.2 inv 55.8 4.8 0.9 N 55.8 4.8 1.2 inv 55.8 4.8 0.9 N 5123456789101112（三）間接診斷的不確定性遺傳標(biāo)記所帶的信息性有限新突變基因重組家系成員不夠完整基因檢測(cè)的標(biāo)本制備DNA或RNA來(lái)自外周血、體液、分泌物和組織如毛發(fā)、皮膚、肌肉、器官、腫瘤組織等產(chǎn)前基因診斷標(biāo)本：羊水細(xì)胞（1620周）絨毛膜細(xì)胞（812周）

12、非創(chuàng)傷性取樣遺傳咨詢戰(zhàn)略路線（以DMD為例）MD是否由Dystrophin缺陷所致是。孕婦是否攜帶者？是。或可能是。胎兒性別？男孩。分子生物學(xué)研究不是。尋找引起本病的原因不是。不進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，但應(yīng)研究家系中其他有風(fēng)險(xiǎn)者女孩。不進(jìn)行分子生物學(xué)研究遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷 遺傳咨詢明確診斷先證者，確定引起疾病的分子異常了解本病傳遞至下代的風(fēng)險(xiǎn)率判斷胎兒是否患病遺傳性代謝性疾病基因診斷策略遺傳性代謝性疾病（inherited metabolic disorders）先天代謝性疾?。╟ongenital metabolic disorders） 基因突變導(dǎo)致代謝途徑中酶的質(zhì)和量的改變，從而所催化的酶

13、促反應(yīng)發(fā)生變化二引起的一系列疾病代謝性疾病的分類(lèi)遺傳性代謝病診斷：生化酶學(xué)或蛋白（脂類(lèi)）檢測(cè)基因診斷遺傳代謝性疾病的特點(diǎn)代謝途徑某些終末產(chǎn)物缺乏受累代謝途徑的中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積出現(xiàn)能量缺乏表現(xiàn)遺傳代謝性疾病發(fā)病特點(diǎn)一、苯丙酮尿癥苯丙酮尿癥（phenylketonuria,PKU）高苯丙氨酸血癥（hyperphenylalaninemia, HPA） 第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的可引起智力發(fā)育延遲的代謝性疾病 第一個(gè)可以通過(guò)飲食控制治愈的遺傳性疾病 第一個(gè)可以進(jìn)行新生兒篩查的疾病Inherited PKU二氫葉酸還原酶（DHPR）缺乏也可以導(dǎo)致PUKPKU is caused by the lack of

14、an enzyme known as phenylalanine hydroxylase. This enzyme is responsible for converting the amino acid phenylalanine to a second amino acid, tyrosine. Tyrosine is involved in the production of the pigment melanin in the skin. Individuals with PKU are unable to make melanin and are, therefore, usuall

15、y blond haired and blue eyed.When phenylalanine is not converted to tyrosine, it builds up in the body and is converted instead to a compound known as phenylpyruvate. Phenylpyruvate impairs normal brain development, resulting in severe mental retardation in a person with PKU. The worst symptoms of P

16、KU can be prevented if the disorder is diagnosed early in life. In that case, a person can avoid eating foods that contain phenylalanine and developing the disorder that would follow.臨床癥狀實(shí)驗(yàn)室診斷血清苯丙氨酸濃度測(cè)定血清酪氨酸濃度測(cè)定尿三氯化鐵試驗(yàn)和2，4一二硝基苯肼試驗(yàn) 兩者都是檢測(cè)尿中苯丙酮酸的化學(xué)呈色法。由于其特異性欠佳，有假陽(yáng)性和假陰性的可能，一般用作對(duì)較大兒童的初篩尿蝶呤分析 應(yīng)用高壓液相層析（HP

17、LC）測(cè)定尿液中新蝶呤和生物蝶呤的含量，可以鑒別各型PKU：PAH缺乏的患兒尿中蝶呤總排出量增高，新蝶呤與生物蝶呤比值正常；DHPR缺乏患兒呈現(xiàn)蝶呤總排出量增加，四氫生物蝶呤減少酶學(xué)診斷PAH僅存在于肝細(xì)胞中，因而它的活性檢測(cè)比較困難。其他酶的活性都可采用外周血中紅、白細(xì)胞或皮膚成纖維細(xì)胞測(cè)定 基因診斷同型胱氨酸尿癥（homocystinuria,HCU）病因臨床表現(xiàn)基因診斷酪氨酸血癥（tyrosinemia）病因分型基因診斷半乳糖血癥（galactosemia）半乳糖代謝過(guò)程中酶缺陷而導(dǎo)致的糖代謝紊亂GALT：半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶GAKL1: 半乳糖激酶GALE:尿苷-二磷酸半乳糖-

18、4-表異構(gòu)酶基因診斷糖原累積病（glycogen storage disease, GSD）分型基因診斷家族性高脂蛋白血癥原發(fā)性高脂蛋白血癥(primary hyperlipoproteinemia)ApoB48ApoA-ApoB48ApoCApoAApoEApoB48ApoAApoEPL CHEApoA CE、DApoA E、D、CApoB100ApoB100ApoCApoEApoB100ApoEApoB100ApoE 小腸新生CM成熟CMCMR肝細(xì)胞攝取游離脂肪酸供肝外組織利用LPLApoCApoEApoCTG新生HDLLCAT成熟HDL肝新生VLDLApoCApoE成熟VLDLLPLPL

19、 CHApoCCHEIDL游離脂肪酸供肝外組織利用LDL外周組織攝取1.型高脂蛋白血癥脂蛋白酶缺乏癥LPLD;外源性高甘油三酯血癥等1/100000TC多正常，TG極度升高，外觀極度混濁，上層奶油蓋，下層清亮，CM升高，LDLc和HDLc均降低臨床癥狀：大多青少年時(shí)發(fā)?。桓雇?；肝脾腫大；皮膚疹狀黃色瘤； 脂血癥視網(wǎng)膜原發(fā)性型高脂蛋白血癥主要見(jiàn)于LPL缺陷，繼發(fā)性該病可見(jiàn)于胰島素依賴性糖尿病，胰腺炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡。LPL活性測(cè)定以資鑒別家族性脂蛋白脂肪酶缺乏病LPL對(duì)于CM和VLDL的代謝具有關(guān)鍵作用。較罕見(jiàn)常染色體隱性遺傳病，兒童期發(fā)病，空腹血明顯CM，TG極度升高，表現(xiàn)為型臨床特點(diǎn)為經(jīng)常的

20、腹痛和反復(fù)的胰腺炎發(fā)作，皮疹性黃色瘤及肝脾腫大等，血LPL活性極度降低，而apoC正常血清外觀極度渾濁，CM存在，奶油蓋，下層透明，VLDL正?；蛏愿?，LDLc和HDLc均明顯降低。載脂蛋白以apoC 代償性增高為顯著特點(diǎn)，這是與apoC 缺乏所致LPL活性降低的重要鑒別診斷2.型高脂蛋白血癥又稱高脂蛋白血癥，最常見(jiàn)脂蛋白升高，TC升高，TG正常為a型，TG升高為b型無(wú)奶油蓋，a型血漿清亮，b型不同程度混濁，LDLc升高臨床特點(diǎn)：黃色瘤；脂性角膜環(huán)；早發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化原發(fā)性主要見(jiàn)于LDL受體缺陷所致的家族性高Chol血癥繼發(fā)性可見(jiàn)于：甲狀腺功能低下，阻塞性肝病，腎病綜合征，糖尿病，腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)，骨髓瘤等II型高脂蛋白血癥可分為: 家族性高膽固醇血癥:LDL-R缺陷 (familial hypercholesterolemia) 家族性混合型高脂血癥:LPLLCAT 家族性載脂蛋白B缺陷癥 多基因高膽固醇血癥3.型高脂蛋白血癥VLDL具有而非前遷移率：-VLDL。寬病。1/5000極易患動(dòng)脈粥樣硬化，一半合并冠心病、外周及腦血管疾??；治療效果滿意；寄予希望探明機(jī)制TC、TG均明顯升高，外觀混濁，模糊奶油蓋，寬帶，Chol主要是以VLDL而不是LDL轉(zhuǎn)運(yùn)臨床特征：特有扁平狀掌部扁平黃色瘤；間歇性跛行；冠心病。常伴有痛風(fēng)、糖尿病及甲狀腺功能低下發(fā)