細(xì)菌的人工培養(yǎng)課件

1、 細(xì)菌的培養(yǎng)與 分離技術(shù) 第一節(jié) 培 養(yǎng) 基 一、培養(yǎng)基的主要成分及其作用 培養(yǎng)基（culture media）的概念 (一)營養(yǎng)物質(zhì)：氮源、碳源、無機(jī)鹽、水、生長因子 蛋白胨: 是眎、胨和氨基酸組成的水溶性混合物, 用以供給細(xì)菌的氮源,以合成蛋白質(zhì)、酶類等 。 可分植物胨(大豆類蛋白的水解產(chǎn)物)和動物胨(牛肉、魚粉、禽蛋或動物的心、肝、腦等組織).兩者長混合使用。 特點(diǎn): 經(jīng)噴霧干燥成粉末,吸水性強(qiáng),易溶于水,也易潮解結(jié)塊,保存需要干燥,密封;高溫下不凝固;遇酸不沉淀;含多種游離氨基酸,容易被細(xì)菌吸收利用;是兩性電解質(zhì),具緩沖作用。 2.肉浸液及牛肉膏 提供氮源和碳源 肉浸液 去出筋膜的新鮮

2、牛肉加定量水浸泡過夜,浸泡液再煮沸而成。 其蛋白質(zhì)大多已凝固,只含少量氨基酸和其他含氮物質(zhì),以及一些非氮類浸出物和少量生長因子。 牛肉膏 為肉浸液加熱濃縮制成(膏狀),糖類等不耐熱的物質(zhì)已被破壞,營養(yǎng)價值不及前者.但因其無糖,常作腸道桿菌的鑒別培養(yǎng)基。 因兩者的營養(yǎng)成分有限,不能滿足細(xì)菌生長的需要,故制備培養(yǎng)基時,還需要加入蛋白胨。 3.糖(醇)類: 給細(xì)菌提供碳源,更多的是用來鑒別細(xì)菌，常用的糖： 單糖:葡萄糖、阿拉伯膠糖 雙糖:乳糖、蔗糖 多糖:菊糖、淀粉 醇類:甘露醇、衛(wèi)矛醇、側(cè)金盞花醇 特點(diǎn):不耐熱,長時間的高溫、或堿性可破壞糖的成分,故制備這類培養(yǎng)基時,通常不用高溫,并與其他成分分開

3、滅菌。 4.無機(jī)鹽 常量元素：磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣、鐵等。 微量元素：鈷、鋅、錳、銅、鉬等。 作用 構(gòu)成菌體成分；為酶的組成部分，維持酶的活性；參與能量的儲存和轉(zhuǎn)運(yùn)；調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外的滲透壓；部分與細(xì)菌的生長繁殖和致病有關(guān)（白喉桿菌在0.14mg/L時產(chǎn)毒量最高，在0.6mg/L時不產(chǎn)毒），如銅含量過多，對細(xì)菌有害，故培養(yǎng)基不宜用銅鍋配制。 自來水中一般都含上述元素。 5.血液 可以增加培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)、多種氨基酸、糖類和無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分 提供V因子 (一些輔酶)、X因子（血紅蛋白）等。還可測定細(xì)菌的溶血作用。 6.雞蛋、動物血清 為營養(yǎng)要求高的細(xì)菌（如結(jié)核分支桿菌、白喉棒狀桿菌等）所必需。 此

4、外，雞蛋和血清也可把培養(yǎng)基做成固體的賦形劑。 7.生長因子 （二）水分 作用 制備培養(yǎng)基常用不含雜質(zhì)的蒸餾水或離子交換水。 也可用自來水、井水、河水等，但常含鈣、磷、鎂，可與蛋白胨或肉浸液中的磷酸鹽生成不溶性磷酸鈣或磷酸鎂，高壓滅菌后可出現(xiàn)沉淀。所以用此類水時，最好先煮沸然后再經(jīng)過濾方可。 （三）賦形劑（凝固劑） 要求：本身不被細(xì)菌利用；37時應(yīng)保持凝固狀態(tài)；不因消毒滅菌所破壞，粘著力強(qiáng)，透明度好。 瓊脂（agar）海生植物中提取的一種多糖，在100為液體，45以下時為固體，無營養(yǎng)作用。 明膠（gelatin）即動物的膠原組織（皮、肌腱等）煮沸溶解熬制而成。 主要為蛋白質(zhì)。因缺乏必需的氨基酸，

5、故營養(yǎng)價值不大。 24以上溶解，20以下凝固（不能放37 ），用于鑒別細(xì)菌。 （四）抑制劑 加在選擇培養(yǎng)基中用于抑制非檢出菌的生長，利于目的菌的分離的 化學(xué)藥物。 如抑制革蘭陰性桿菌的：膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉。 抑制革蘭陽性菌的：亞碲酸鹽、四硫磺酸鹽、疊氮鈉及一些抗生素等。 （五）指示劑 觀察細(xì)菌分解糖、蛋白質(zhì)產(chǎn)酸、堿，鑒定細(xì)菌用。 酸堿指示劑：酚紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚蘭、中性紅、中國藍(lán)、甲基紅、酸性復(fù)紅。 氧化還原指示劑：美蘭、刃天青、四氮唑等。 二、培養(yǎng)基的分類1.按其性狀分： 液體培養(yǎng)基 多用于增菌 固體培養(yǎng)基 分純、鑒定、藥敏 半固體培養(yǎng)基 用動力觀察，保存菌種 肉湯配方:

6、蛋白胨 1 克 牛肉膏 0.5克 （或肉浸液 100ml） NaCL 0.5克 蒸餾水 100ml 瓊脂粉 2-3克 0.3-0.5克 2.按用途分基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basic media）營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrient media）加血液、血清生長因 子等，如血、巧克力平板選擇培養(yǎng)基（selective media）加抑菌劑，如SS、 中國藍(lán)、伊紅美蘭、麥康凱等 鑒別培養(yǎng)基（differential media）加糖、醇、蛋白 質(zhì)、氨基酸和指示劑等，如生化反應(yīng)管增菌培養(yǎng)基（enrichment media）如葡萄糖肉湯、NG 肉湯特殊培養(yǎng)基（special media）如厭氧培養(yǎng)基、高滲等三、培養(yǎng)基

7、的制備1.玻璃器皿的準(zhǔn)備 （實驗課講授）2.培養(yǎng)基制備的一般程序調(diào)配 溶化 矯正pH 過濾澄清 分裝 滅菌 鑒定 保存（三）培養(yǎng)基制備的注意事項 1. 最好用中性硬質(zhì)的玻力器皿 若含銅量為0.3mg/L時細(xì)菌不長；鐵超過0.11mg/L，會影響其毒素的產(chǎn)生。 2.化學(xué)藥品等級應(yīng)在化學(xué)純以上。 3.稱量要準(zhǔn)。干燥商品培養(yǎng)基要按說明書稱量，并先在容器中加部分水?？刹患訜崛芙?。 4. pH值要準(zhǔn)：冷和熱時的酸堿度有差別，故須在冷卻后測定。 5.分裝不宜超過容器的2/3，以免溢出。 6.高壓滅菌時，要注意先排除冷空氣；時間不宜過長（時間長了會增加酸性反應(yīng)）；如含糖、明膠、血清等應(yīng)采用低溫或間歇滅菌法。

8、 第二節(jié) 細(xì)菌的人工培養(yǎng) 一、接種的工具和條件（一）接種針和接種環(huán) 針長約50-80mm；環(huán)的直徑2-4mm；使用前均需要在火焰上燒灼滅菌。（二）酒精燈（三）生物安全柜：結(jié)構(gòu)、工作原理（四）無菌室 （五）培養(yǎng)箱 超凈工作臺 生物安全柜A：前開口；B：窗口；C：排風(fēng)HEPA 過濾器；D：后面的壓力排系統(tǒng)；E：供風(fēng)HEPA 過濾器；F：風(fēng)機(jī) 二級生物安全柜工作原理二、無菌技術(shù) 1.無菌室使用前的消毒：打開紫外燈照射30min-1小時，或用5%的石炭酸噴霧消毒。 2.所用物品均應(yīng)在使用前嚴(yán)格滅菌。使用時不得觸摸、碰撞未經(jīng)滅菌的物品。 3.無菌的試管、瓶子打開后應(yīng)在火焰上通過 2-3次，盡快蓋好，或盡

9、量靠近火焰；管、瓶口切忌朝上暴露于空氣下。 4.接種環(huán)、針，每次使用前、后都要在火焰上燒灼滅菌。 5.進(jìn)行培養(yǎng)基的分裝、細(xì)菌接種都要在生物安全柜中進(jìn)行，注意生物安全，防止污染。 6.無菌吸管頭上應(yīng)塞有棉花，不用口吹或吸液體。 7.實驗室的所有感染性物品未經(jīng)消毒滅菌不能拿出實驗室，應(yīng)經(jīng)消毒處理。 8.操作者要注意個人防護(hù)，穿好工作服，必要時戴好帽子、口罩、手套等，離開時要更衣、消毒、洗手。 9.桌面、操作臺需及時用消毒液擦干凈。 三、細(xì)菌的接種與分離技術(shù)1.液體培養(yǎng)基的接種法2.半固體培養(yǎng)基的接種法3.瓊脂斜面接種法4.固體培養(yǎng)基的接種法(平板劃線分離法) 連續(xù)劃線法 分區(qū)劃線法5.傾注平板法6.涂布接種法 四、細(xì)菌的培養(yǎng)方法 1.普通培養(yǎng) 2.二氧化碳培養(yǎng)法： 二氧化碳培養(yǎng)箱法、燭缸法、重碳酸鹽-鹽酸法（兩者之比為0.4g ：0.35ml）。 3.微需氧培養(yǎng)法：微需氧環(huán)境為 5-6%氧氣、5-10%二氧化碳、85%氮?dú)狻?4.厭氧培養(yǎng)法 厭氧手套箱法、厭氧罐法、氣袋法等。 5.高滲培養(yǎng)法 厭氧手套箱 厭氧罐 厭氧袋五、細(xì)菌的生