發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的分離純化方法(共8頁)

1、發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的分離純化(chn hu)方法摘 要: 微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)透明質(zhì)酸的主要方法，透明質(zhì)酸微生物發(fā)酵液中往往都含有(hn yu)蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)1,分離(fnl)純化是發(fā)酵法制備高分子量、高純度透明質(zhì)酸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此需要分離純化。只有高純度的透明質(zhì)酸才能更好的發(fā)揮其工業(yè)效用,但是分離純化的方法卻多種多樣。目前主要方法有過濾法、凝膠層析法、離子交換層析法等,而不同的方法又將導(dǎo)致操作、成本、和純度的不同。因此本文將從多方面多角度綜合分析各種透明質(zhì)酸分離純化方法。本文探討了透明質(zhì)酸發(fā)酵液的特性和分離純化過程中工藝條件對透明質(zhì)酸分子量和結(jié)構(gòu)的影響2，對預(yù)處理、分離、純化各階段的工藝方法

2、進(jìn)行了系統(tǒng)比較和分析3，指出了透明質(zhì)酸分離純化工藝中存在的問題，并提出了今后分離純化研究的重點(diǎn)關(guān)鍵詞:透明質(zhì)酸;發(fā)酵液;分離純化工藝一、透明質(zhì)酸介紹透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,簡稱HA)又名玻璃酸,是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元的酸性高分子粘多糖。HA具有許多天然多糖共有的性質(zhì):呈白色,為無定形固體,無臭無味,有強(qiáng)吸濕性,溶于水,不溶于有機(jī)溶劑。它是一種國際上公認(rèn)的生物大分子保濕劑,用于眼科顯微手術(shù)、關(guān)節(jié)炎治療、高檔化妝品、食品添加劑等領(lǐng)域。二、透明質(zhì)酸的作用1、在臨床醫(yī)學(xué)方面(1)眼科 由于透明質(zhì)酸分子為高分子化合物,不具抗原性,不致敏,不發(fā)生免疫反應(yīng)

3、,無熱原性,無色透明,無膠質(zhì)滲透作用,具有高赫性和高彈性,理化性質(zhì)穩(wěn)定透明質(zhì)酸可廣泛的應(yīng)用于滴眼液、干眼病的治療、青光眼的手術(shù)、白內(nèi)障的手術(shù)、淚道探通術(shù)和一些眼外傷手術(shù)4。(2)骨科HA在骨科領(lǐng)域主要應(yīng)用在關(guān)節(jié)疾病中。5HA是構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨和滑液的主要成分,關(guān)節(jié)中的HA主要是由滑膜細(xì)胞及單核吞唆細(xì)胞合成6。(4)藥物透明質(zhì)酸與甲殼素制成緩釋、控釋材料(cilio)既具有(jyu)透明質(zhì)酸的豁膜薪附作用(zuyng),同時有甲殼素的滲透促進(jìn)效果7,8。它們聯(lián)合使用在體外試驗中表現(xiàn)出緩釋和促進(jìn)藥物吸收利用的特點(diǎn)9,10,112、在化妝中的應(yīng)用透明質(zhì)酸具有特殊的保水作用,高分子量的透明質(zhì)酸最多可以持水

4、6L/g,因而是一種理想的天然保濕因子。它可以改善皮膚的營養(yǎng)代謝,使皮膚柔嫩、光滑、去皺、增加彈性、防止衰老(1)保濕作用HA在低相對濕度 (35%)下的吸濕量最高,吸收的水分是其它物質(zhì)的1.5?6倍,而在高相對濕度(75%)下的吸濕量最低,吸收的水分僅為其他物質(zhì)的1/25/6.。這種獨(dú)特的性質(zhì),正適應(yīng)皮膚在不同季節(jié)、不同環(huán)境濕度下對化妝品保濕作用的要求。HA作為保濕劑較少單獨(dú)使用,常與其他保濕劑配合使用。(2)營養(yǎng)的作用HA是皮膚固有的生物物質(zhì),外源性的HA是對皮膚內(nèi)源性HA的補(bǔ)充。分子量較小的HA可滲入皮膚表皮層,促進(jìn)皮膚營養(yǎng)的供給和廢物的排泄,從而防止皮膚老化,起到美容和養(yǎng)顏的作用。(3

5、)皮膚損傷的修復(fù)和預(yù)防作用庚膚受到陽光暴曬所引起的光灼傷或日灸,如皮膚變紅、變黑、脫皮等,主要是陽光中的紫外線的作用。HA通過促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖和分化,以及清除氧自由基的作用,可促進(jìn)受傷部位皮膚的再生12。其作用機(jī)制與防曬霜中常用的紫外線吸收劑不同。因此,在防曬護(hù)膚品中HA與紫外線吸收劑混合使用,具有協(xié)同作用,可同時減少紫外線的透過和對透過的少量紫外線所造成的皮膚損傷進(jìn)行修復(fù),起到雙重保護(hù)作用。皮膚遭受輕度的燒資傷時,表面涂抹含HA的水劑化妝品可減輕疼痛,加速受傷部位皮膚的愈合。(4)潤滑性和成膜性HA屬于高分子聚合物,具有很強(qiáng)的潤滑感和成膜性。含HA的護(hù)膚品涂抹時潤滑感明顯,手感良好。涂于皮

6、膚后,可在皮膚表面形成一層薄膜,使皮膚產(chǎn)生良好的光滑和濕潤感,對皮膚起到保護(hù)作用。含HA的護(hù)發(fā)品,可在頭發(fā)表面形成一層薄膜起到保濕、潤滑、護(hù)發(fā)、消除靜電等作用,使頭發(fā)易于梳理、飄逸自然。(5)增稠性HA在水溶液中具有很高的粘度,其1%的水溶液呈凝膠狀,添加在化妝品中可起.增稠和穩(wěn)定作用,而不會存在油膩感覺。三、分離純化(chn hu)工藝介紹(jisho)分離(fnl)純化的主要目的是獲得純度較高的 HA，目前國內(nèi)外一般以葡糖醛酸含量表示 HA 的純度，保健食品及化妝品級 HA 的葡糖醛酸含量為 35%45%，藥用級為 42%48%。生物發(fā)酵法制得的藥用級 HA 蛋白質(zhì)含量不應(yīng)大于 0.1%（

7、質(zhì)量分?jǐn)?shù)），細(xì)菌內(nèi)毒素限量應(yīng)小于 1 EU/mg，溶血率應(yīng)不大于5%。針對 HA 發(fā)酵液的特性，分離純化方法很多，在不同階段所適用的分離純化技術(shù)不盡相同，但總體上分離純化工藝過程可以概括為如下流程：發(fā)酵液預(yù)處理分離（初步純化）純化干燥成品 四、預(yù)處理 預(yù)處理是在分離純化前對發(fā)酵液進(jìn)行滅酶、滅菌、除菌的工藝。對于一些非透明質(zhì)酸酶缺陷型菌株發(fā)酵所得的發(fā)酵液，通過預(yù)處理可以殺滅透明質(zhì)酸酶，減少 HA 分子量的降低。史鵬13等采用兩種預(yù)處理方式進(jìn)行滅酶，熱處理方式為發(fā)酵液在 70 下保溫 1 h，靜置 5 h；酸處理方式為發(fā)酵液用三氯乙酸調(diào) pH 值至 4.5，1 h 后回調(diào)至 6.0，靜置 5 h，

8、兩種預(yù)處理方式的蛋白質(zhì)去除率、HA 得率很接近，但酸處理的分子量降低率要低于熱處理，表明酸處理能更有效的抑制透明質(zhì)酸酶的活性。殺滅發(fā)酵液中的菌體通常加入殺菌劑，常用的殺菌劑包括三氯乙酸、氯仿等。三氯乙酸可以溶解細(xì)胞上的脂類物質(zhì)，使細(xì)胞破壞，從而起到滅菌和抑制酶活力的作用。氯仿和三氯乙酸的作用類似，能夠使 HA 逐漸從細(xì)胞膜上脫落3，使蛋白質(zhì)變性沉淀，并能滲入細(xì)胞膜，除去細(xì)菌內(nèi)毒素等致炎物質(zhì)，使 HA 產(chǎn)品安全性提高14。采用加熱進(jìn)行滅菌，滅菌溫度一般為 7580 15，國外專利報道，將發(fā)酵液加熱到 90 ，再除去菌。通過有效除菌可以改善分離效果，使 HA 分離得率提高，同時也可以去除部分雜蛋白

9、。除菌的方法較多，祝慶16等比較了微濾除菌和經(jīng)鹽酸、甲醛和三氯乙酸分別處理后再離心除菌的效果，發(fā)現(xiàn)微濾除菌效果最好，但微濾過程中需要加壓和不斷稀釋，在后期沉淀階段需消耗大量有機(jī)溶劑，濾速慢也使得整個分離周期延長，因此工業(yè)化生產(chǎn)可行性不大。相對于鹽酸法、甲醛法，三氯乙酸除菌法 HA產(chǎn)量和質(zhì)量均有提高，這是由于三氯乙酸的加入使HA 與蛋白質(zhì)的絡(luò)合有一定的解除。鄧禹17等采用25 g/L 三氯乙酸滅活菌體并使蛋白質(zhì)變性沉淀，以混合硅藻土為過濾助劑，再配以特定的后處理工藝，所得成品透明質(zhì)酸中蛋白質(zhì)含量僅為 0.047%。周榮清等比較了絮凝、離心、三氯乙酸 3 種預(yù)處理方式對超濾膜污染的影響，所采用的絮

10、凝劑為陰離子型聚丙烯酰胺（AN926），添加量為 10010 3mg/mL，絮凝預(yù)處理的上清液經(jīng)超濾后膜通量降低率僅為其它兩種方法的 1/10，表明絮凝法預(yù)處理可以有效除去菌體和雜蛋白，改善膜分離效果。郭育濤等采用發(fā)酵液中加入2倍體積的氯仿除菌體的方法，在 28 、pH 值為 7.0 的條件下攪拌 60 min，離心后，HA 提取率達(dá) 97.5%，純度達(dá) 97.3%。國外專利報道了采用過濾除去菌體的方法。盛瑞堂等也采用過濾法除去菌體，并發(fā)現(xiàn)使用硅藻土作吸附劑時的濾液濁度和終濾液 HA 收率優(yōu)于活性炭。在 HA 發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加入工業(yè)乙醇得到 HA 粗品沉淀，以 20 g/L 的濃度溶于去

11、離子水，加入硅藻土，充分?jǐn)嚢枰晕骄w雜質(zhì)，在 pH 值4.64.8 的條件下過濾，濾液在 pH 值為 4.8 時濁度最小，在 pH 值為 4.6 時蛋白含量最低，蛋白含量和濁度變化趨勢隨 pH 值改變基本一致。過濾法除菌體是物理過程，操作簡便，效果明顯，并且容易在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。五、分離(fnl)提純透明質(zhì)酸發(fā)酵法生產(chǎn)(shngchn)的HA具有分離精制(jngzh)容易,保濕性強(qiáng),品質(zhì)穩(wěn)定,產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn),目前已得到廣泛使用,并已成為研究HA生產(chǎn)的主要方向。由于微生物發(fā)酵液中提取的透明質(zhì)酸粗品都含有菌體,雜蛋白、核酸等雜質(zhì),需要進(jìn)一步分離純化。以下簡單介紹幾種工業(yè)上常用的發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的

12、分離提純的方法。181.過濾法過濾法分離純化發(fā)酵液中的HA 是一種簡單有效并可以規(guī)?；a(chǎn)HA的分離純化方法,可以有效地除去菌體和雜蛋白,對分子量的影響相對較小。鄧禹等采用25g/L三氯乙酸滅活菌體并使蛋白質(zhì)變性沉淀,以發(fā)酵液質(zhì)量1.2%的混合硅藻土為過濾助劑,過濾溫度為60,pH為7.0的透明質(zhì)酸發(fā)酵液預(yù)處理工藝,完全去除了透明質(zhì)酸發(fā)酵液中的菌體和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。采用這一工藝得到的成品透明質(zhì)酸中葡萄糖醛酸含量達(dá)46.39%,蛋白質(zhì)含量僅為0.047%,分子量為190萬,提取收率為91.3%。這種方法利用三氯乙酸滅活菌體并使蛋白質(zhì)變性沉淀,然后以硅藻土作為過濾助劑吸附、截留蛋白質(zhì)和菌體的透明質(zhì)酸

13、發(fā)酵液預(yù)處理方法。2. 凝膠層析法凝膠層析法是生物化學(xué)中一種常用的分離手段,凝膠層析是依據(jù)不同分離純化目的和HA分子量大小選擇合適的分子篩量達(dá)幾十萬到幾百萬,而蛋白質(zhì)的分子量僅為幾萬,所以選擇合適的凝膠可以起到分離純化的效果。吳華昌等采用葡聚糖凝膠G-100以 0.1mol/L氯化鈉溶液為洗脫劑,以HA提取率與純度為指標(biāo),對HA發(fā)酵液進(jìn)行分離純化,再用醇沉法提取HA,擬達(dá)到提高HA提取率和純度的目的。在優(yōu)化的凝膠層析條件下,HA提取率達(dá)到79.85%,蛋白質(zhì)去除率為84.93%。3.離子交換(l z jio hun)層析法如果采用化學(xué)方法(fngf)從發(fā)酵液中分離純化透明質(zhì)酸,純化(chn h

14、u)過程中的pH值、光、熱和還原劑等因素易導(dǎo)致其黏度發(fā)生不可逆的下降。而在進(jìn)入HA純化階段后,由于離子交換層析等具有選擇性吸附特點(diǎn)的層析技術(shù)已經(jīng)成為分離提取生物大分子的有效方法。倪杭生等采用強(qiáng)酸型陽離子樹脂為交換劑的離子交換柱,和經(jīng)組氨酸基團(tuán)修飾的強(qiáng)堿型陰離子樹脂為交換劑的離子交換層析柱串聯(lián)。選擇以氯化鈉溶液為洗脫劑,在優(yōu)化的洗脫條件下,對HA粗品進(jìn)行分離純化,純化重量收率為58%61%,分子量近100萬19。HA粗品溶液先通過交換柱,其中主要雜質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì),在偏酸性溶液中帶正電荷,能與強(qiáng)酸型陽離子發(fā)生交換吸附而被純化。六、 純化工藝 1. 季銨鹽純化 氯化十六烷基吡啶（CPC）是一種季

15、銨鹽類陽離子表面活性劑，它能與黏多糖分子中的聚陰離子形成絡(luò)合物，此絡(luò)合物在低濃度鹽溶液中產(chǎn)生沉淀，而在高濃度的鹽溶液中逐漸解離，引起 HA 與 CPC復(fù)合物解離所需的鹽濃度遠(yuǎn)比其它黏多糖與 CPC復(fù)合物解離所需濃度要低，利用此性質(zhì)可達(dá)到純化HA 的目的。Cifonelli 等早在 1957 年就對發(fā)酵液經(jīng)濃縮后再用 CPC 純化進(jìn)行了研究。洪水聲等向 HA 粗品溶液中加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%的CPC 溶液，形成絮狀物后靜置 1h，再離心分離，沉淀溶于 1.5 mol/L 的 NaCl 溶液中，離心除去不溶物。祝慶將乙醇沉淀得到的 HA 粗品溶于 0.05 mol/L的 NaCl 溶液中，加

16、入 1% CPC，攪拌 30 min 后靜置 1 h，離心收集沉淀后溶于不同濃度 NaCl 溶液中，發(fā)現(xiàn)NaCl溶液濃度為0.35 mol/L時HA純度和產(chǎn)量較高。丁霞將 HA 粗品溶于 0.15 mo1/L NaCl 中得到0.25%的HA溶液，1倍體積10% CPC(溶在0.15 mo1/L NaCl 中)加入 8 倍體積的 0.25%的 HA 溶中，通過離心分離 CPC 沉淀，用 0.15 mol/L NaCl洗滌，得到較純的 HA 溶液。采用 CPC 進(jìn)行純化的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，但 CPC 回收困難，單位價格較高，所以應(yīng)用成本較高。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）純化 HA 的作用機(jī)制與

17、 CPC 相似，但成本相對較低。丁霞等將初步除去菌體和不溶性雜質(zhì)的提取液中加入 CTAB，通過離心分離沉淀，并用 0.15 mol/L NaCl 洗滌沉淀，浸泡在 1.5 mol/L NaCl 溶液中過夜，CTAB-HA 復(fù)合物可解離溶解，最終可得清亮、較純的 HA 液體20。盛瑞堂等報道了用 CTAB 沉淀法從發(fā)酵液中分離HA 的方法，將發(fā)酵液稀釋至 4.5 倍，調(diào)節(jié) pH 值至6.5，加入發(fā)酵液體積 12%的 CTAB 溶液（體積分?jǐn)?shù)為 10%），HA 的收率可高達(dá) 97.0%，與乙醇法相比， CTAB 法 HA 的收率提高了 2.1%，HA 沉淀中雜蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了 2.4%，與 C

18、PC 法相比成本降低了45.2%。可見，采用 CTAB 法對 HA 進(jìn)行分離純化具有明顯優(yōu)勢和很好的應(yīng)用前景。2 . 酶解純化(chn hu) 加入(jir)蛋白酶能夠使 HA 與蛋白質(zhì)的絡(luò)合狀態(tài)(zhungti)除，HA 更多地游離于溶液中，使其易于純化。常用的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，鏈酶蛋白酶等，鏈酶蛋白酶對接近糖蛋白質(zhì)鏈肽鍵上的作用效果優(yōu)于木瓜蛋白酶，而胃蛋白酶的水解作用不夠徹底，往往需要配以其它酶才能見效。祝慶等將除菌體后的上清液加入鏈酶蛋白酶作用 2 h，乙醇沉淀后再經(jīng)氯仿除蛋白，HA 產(chǎn)量得到了較大幅度的提高，雜蛋白的含量為 2.8%，與采用氯仿三次除蛋白后的純度相當(dāng)。 3

19、. 過濾法純化 過濾法純化易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，能有效濾除菌體和蛋白質(zhì)，對分子量影響相對要小。盛瑞堂等報道了采用過濾法純化 HA 的工藝：將 HA 粗品以 20 g/L 的濃度溶于水中，加入硅藻土作為吸附劑，調(diào)節(jié)溶液 pH 值至 4.64.8，在 HA 粗品溶液中加入10 g/L 粗硅藻土和 3.3 g/L 細(xì)硅藻土為助濾劑，用粗硅藻土和細(xì)硅藻土預(yù)涂層過濾，然后用 H 乙-1 型濾板過濾，經(jīng)過超濾后，將濾液用乙醇沉淀并干燥，得到葡糖醛酸含量達(dá) 44.2%的 HA。鄧禹等將發(fā)酵液經(jīng)過前處理后，以發(fā)酵液質(zhì)量 1.2%的混合硅藻土（粗細(xì)硅藻土比為 1.51）作為過濾助劑，過濾溫度為 60 ，pH 值為 7

20、.0，再配以酒精沉淀、氣浮、酒精造粒的后處理工藝，得到的成品透明質(zhì)酸中葡萄糖醛酸含量達(dá) 46.39%，蛋白質(zhì)含量僅為 0.047%，相對分子質(zhì)量為 1.9106 Da。 4. 離子交換層析純化 在進(jìn)入 HA 純化階段后，離子交換層析等具有選擇性吸附特點(diǎn)的層析技術(shù)往往被采用。與化學(xué)方法相比，離子交換層析分離條件溫和，不引起分子結(jié)構(gòu)的變化，己經(jīng)成為分離提取生物大分子的有效方法。離子交換法用于純化 HA 的關(guān)鍵問題是選擇合適的交換樹脂及相應(yīng)的交換條件21。Poli 等將粗濾后的濾液先后流經(jīng)陽離子交換樹脂和 Amberlite IRA900 強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂，雜質(zhì)(zzh)吸附在樹脂上，HA 不被

21、吸附而流出，流出液直接(zhji)冷凍干燥或減壓干燥可得純度在 98%以上(yshng)的 HA，其蛋白質(zhì)含量為 0.3%。Gerard等 曾報道了采用 DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖分離 HA 的研究，但由于這兩種層析劑價格昂貴，限制了在工業(yè)上的應(yīng)用。倪航生等選擇經(jīng)組氨酸修飾的強(qiáng)堿型陰離子樹脂作為離子交換劑，以增大 HA 及其所含蛋白質(zhì)、核酸等各組分與交換劑相互作用的差異，選擇氯化鈉為洗脫劑，對 HA 粗品進(jìn)行離子交換層析，純化質(zhì)量收率為 58%61%，相對分子質(zhì)量近1.0106 Da，蛋白質(zhì)含量為 0.075%。5. 凝膠過濾柱層析純化 凝膠過濾層析常在純化階段的后期被采用，需要根據(jù)不

22、同分離純化目的和 HA 分子量大小選擇合適的分子篩。丁霞采用 Sephadex G-25 凝膠過濾柱層析分離 HA 溶液中殘留的 CPC 及其它雜質(zhì)。洪水聲等將發(fā)酵液經(jīng)過氯仿與正丁醇混合液除蛋白、季銨鹽（CPC）復(fù)合物沉淀、DEAE-纖維素柱層析后制得的樣品，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%的溶液，采用 Sephadex G-75 凝膠過濾柱進(jìn)行層析純化，進(jìn)樣量為 2.0 mL，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，洗脫速度為 6 mL/h ，收集洗脫峰并冷凍干燥， HA 總收率為59.65%，蛋白質(zhì)含量為 0.075%。 六、總結(jié)純度和分子量的高低決定了 HA 產(chǎn)品國際市場中的競爭力，下游分離純化工藝是獲得高純度、高分

23、子量 HA 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從發(fā)酵液中分離純化制得高純度、高分子量的 HA，必須充分考慮工藝條件對 HA 分子量的影響，根據(jù)發(fā)酵液的特性和分離純化方法的特點(diǎn)找到合適的分離純化工藝路線22。發(fā)酵液中 HA 分離純化工藝研究的重點(diǎn)將是：對分離純化方法進(jìn)行遴選、優(yōu)化組合，精細(xì)化操作，降低生產(chǎn)成本，探索適合于工業(yè)化生產(chǎn)的下游分工藝路線，在提高 HA 純度的同時盡量保持高的分子量；提高分離純化工藝的安全性，操作上的簡捷性，縮短生產(chǎn)周期。參考文獻(xiàn):1 凌沛學(xué). 透明質(zhì)酸M. 北京：中國輕工業(yè)出版社，2000：11-15.2Jorn Kaufmann, Kerstin Mohle, Hans-Jorg Hoim

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