新型重組免疫毒素DT390

1、新型重組免疫毒素DT390賈怡,李虹,陳文捷,呂梅勵,李明遠,蔣忠華,張林【關鍵詞】實驗性變態(tài)性腦脊髓炎;,DT390;,Rantes;,重組免疫毒素PriarystudyftherebinantiuntxinDT390RantesinEAEtherapyAbstratAI:TnstrutanveleukarytiexpressinplasidinludingtherebinantiuntxinDT390Rantesandtreatexperientalautiuneenephalyelitis(EAE)inie.ETHDS:EAEin57BL/6ieereinduedbytheextrate

2、dBP.TheRantesfragentasinsertedinttheeukarytiexpressinplasidSRntainingDT390.ThenatinilipseebeddedplasidDNAasinjetedinttheuslesfthehindlibsinie.TheeffetfDT390Rantesasevaluatedbybservinglinialsypts,pathlgialhangesfbrain,relativeytkinefperipheralbld,andtheprprtinfTellsandBells.RESULTS:Therebinantiuntxin

3、DT390Rantesassuessfullynstruted.paredtheieintreatedgrupiththseinuntreatedgrupthelinialsyptsfEAEerealleviated,theinfiltratinfinflaatryellseredereased,theIFNlevelasfallen,andtheratifT/Bellsasdereased.NLUSIN:TherebinantiuntxinDT390RanteshasdistinteffetsnEAEinie,hihaybeusedfrbenefiialreferenetthetherapy

4、fS.Keyrdsexperientalautiuneenephalyelitis(EAE);DT390;Rantes;rebinantiuntxin摘要目的:構建一種含有重組免疫毒素DT390Rantes白喉桿菌外毒素390片段活化T細胞表達與分泌調(diào)節(jié)因子的真核表達質(zhì)粒,并用于治療小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎EAE。方法:利用自提的BP誘導57BL/6小鼠產(chǎn)生EAE,將Rantes導入含有DT390的真核表達質(zhì)粒SR中,經(jīng)陽離子納米脂質(zhì)體包被后,治療小鼠EAE,同時對其臨床病癥、腦部病理改變、外周血相關細胞因子及T/B細胞比例進展檢測,理解該重組免疫毒素的治療效果。結(jié)果:成功構建真核表達質(zhì)粒

5、DT390RantesSR,治療組小鼠臨床病癥減輕,腦部特異性淋巴細胞浸潤減少,外周T細胞相關細胞因子表達降低,T/B細胞比例降低。結(jié)論:新型重組免疫毒素DT390Rantes治療小鼠EAE有較為明顯的效果,為治療人的多發(fā)性硬化S提供有益的借鑒。關鍵詞實驗性變態(tài)性腦脊髓炎;DT390;Rantes;重組免疫毒素人的多發(fā)性硬化ultipleslersis,S是一種難以治愈的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變?yōu)橹饕卣鞯淖陨砻庖咝约膊嶒炐詣游镒陨砻庖咝阅X脊髓炎experientalautiuneenephalyelitis,EAE,又稱為實驗性變態(tài)反響性腦脊髓炎experientalallergienep

6、halyelitis與S在臨床表現(xiàn)、生化指標及病理等方面均具有很多一樣之處,常被作為S的理想動物模型1。在EAE中,T細胞被自身抗原如髓鞘素堿性蛋白yelinbasiprtEin,BP2、蛋白脂蛋白prtelipidprtein,PLP3、少突膠質(zhì)細胞糖蛋白yelinigdendryteglyprtein,G4、髓鞘素結(jié)合糖蛋白AG等活化而進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生炎性反響。本實驗中將活化T細胞外表受體R5的配體RantesregulatednativatinnralTellsexpressedandsereted5與修飾的白喉桿菌外毒素DT390相連,構建一種新型的重組免疫毒素核酸制劑DT390R

7、antes。用其定向殺傷活化的自身反響性T細胞,并檢測該重組免疫毒素對EAE的治療作用。1材料和方法1.1材料57BL/6雌性小鼠48只,68周齡,質(zhì)量1318g,購自四川大學華西實驗動物中心。新穎牛脊髓,福氏完全佐劑FA,內(nèi)含結(jié)核分枝桿菌5g/L為四川大學根底醫(yī)學與法醫(yī)學院免疫學教研室饋贈。滅活的百日咳桿菌菌液內(nèi)含百日咳桿菌39109/L為成都市生物制品研究所產(chǎn)品。真核表達質(zhì)粒SR內(nèi)含DT390片段為美國isnsin大學胡懷忠教授提供。RTPR試劑盒為Tarkara公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶NI、ERI、SalI、T4連接酶為NeEngland公司產(chǎn)品。質(zhì)粒大抽試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品。IF

8、NELISA檢測試劑盒為RD公司產(chǎn)品。兔抗鼠R5單克隆抗體(Ab)為博士德公司產(chǎn)品?？故驞19PE、抗鼠D3FIT為BDPharingen公司產(chǎn)品。流式細胞儀EpisEliteESP為Bekanulter公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1BP粗提物的提取與鑒定參照Kies法6加以改良從新穎牛脊髓中提取BP粗提物,在UV260紫外分光光度計上測定粗提物的吸光度A260和A280值。根據(jù)公式:蛋白質(zhì)濃度g/L=1.45A2800.74A260稀釋倍數(shù),計算出蛋白濃度。利用SDSPAGE電泳檢測蛋白的濃度和純度。1.2.2重組免疫毒素真核表達質(zhì)粒的構建使用Trizl試劑從小鼠肝組織中提取出總RNA。RT

9、PR的方法參照TaKaRa公司試劑盒二步法說明書進展。為了便于克隆和表達,在Rantes基因PR特異性的引物兩端分別參加了NI和ERI的酶切位點和相應的保護堿基,上游:5ATGATGGGTAATATGGTGGA3,下游:5GGAATTTAGTATTAAATAGTT3,PR擴增產(chǎn)物使用10g/L瓊脂糖電泳別離。將Rantes基因片段插入到含有DT390的真核質(zhì)粒SR中,構建成一種新的真核表達質(zhì)粒DT390RantesSR。利用限制型內(nèi)切酶NI,ERI及SalI酶切圖譜分析重組質(zhì)粒,酶切產(chǎn)物使用10g/L瓊脂糖電泳分析,同時進展DNA序列分析上海博亞生物技術公司完成。1.2.3真核表達質(zhì)粒的包被大

10、量抽提DT390RantesSR真核表達質(zhì)粒,參照Qiagen公司endfreeplasidaxi試劑盒操作手冊,并用陽離子納米脂質(zhì)體將其包被形成DNA陽離子脂質(zhì)體復合物7。1.2.4EAE動物模型的建立及治療將57BL/6小鼠48只隨機分成2組,其中8只為陰性對照組,40只為實驗組。將自提的BP粗提物與FA內(nèi)含結(jié)核分枝桿菌5g/L等體積混和制成油包水的乳劑,實驗組小鼠每只腹腔注射該混和液0.2L,百日咳桿菌菌液PBS150混和液0.2L內(nèi)含百日咳桿菌0.61.8106個;初次免疫后第7天加強免疫1次,方法及劑量與第1次一樣。將鑒定正確的真核表達質(zhì)粒DT390RantesSR轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌

11、J109,挑取單克隆菌落擴大培養(yǎng),然后進展質(zhì)粒大量抽提,方法參照Qiagen公司endfreeplasidaxi試劑盒操作手冊。將40只實驗組小鼠隨機平分為2組,即治療組與未治療組。治療組小鼠經(jīng)后腿肌肉注射DNA陽離子脂質(zhì)體復合物50g/只/次溶于50LPBS中,未治療組小鼠后腿注射PBS50L10l/LpH7.4,初次免疫后第1天與第3天進展2次治療,方法與劑量同上。1.2.5小鼠臨床病癥的觀察從初次免疫起,每天觀察小鼠的臨床病癥。參照Kn的分級方法8將病癥分為6級:0級,沒有任何臨床病癥;1級:動物尾部乏力;2級:動物尾部乏力前肢或后肢中等乏力;3級:前肢或后肢嚴重乏力,人為翻身后不能恢復

12、;4級:肢體麻木,人為翻身后不能恢復;5級:瀕死狀態(tài)。根據(jù)其病癥進展評分。1.2.6小鼠腦部病理改變的觀察每隔3d取實驗組和對照組小鼠,20g/L戊巴比妥那0.2L將小鼠麻醉后,用40g/L多聚甲醛進展心臟灌注,解剖取出其大腦、小腦、延腦及脊髓。使用R5Ab經(jīng)免疫組織化學染色,鏡下觀察病理改變。1.2.7小鼠外周血血清中IFN含量的檢測每隔3d取小鼠眼球血,別離血清,操作按照RD公司的ELISA試劑盒操作手冊,檢測外周血中IFN程度的變化情況。1.2.8小鼠外周血中T、B細胞的檢測每隔3d將小鼠處死后,無菌取小鼠脾臟,制成脾細胞懸液,使用小鼠淋巴細胞別離液別離得到單個核細胞;置于含有PA,ne

13、nsin及Inyin的含有100L/L胎牛血清RPI1640培養(yǎng)液中,3750L/L2孵育過夜;搜集細胞,參加FIT標記的D3Ab及PE標記的D19Ab室溫避光孵育20in;洗滌3次后,PBS10l/LpH7.4重懸,使用流式細胞儀檢測T淋巴細胞/B淋巴細胞的比例。2結(jié)果2.1蛋白粗提物相對分子質(zhì)量r和濃度BP蛋白粗提物SDSPAGE電泳的結(jié)果見圖1,片段r約為17000。測得蛋白粗提物的吸光度A260=0.123和A280=0.155,根據(jù)公式其蛋白濃度為1.3373g/L。圖1BP粗提物SDSPAGE電泳結(jié)果略Fig1EletrphresisresultsfBP1,3:PrtEinarke

14、r;2:ExtratedBP.2.2真核表達質(zhì)粒DT390RantesSR的構建經(jīng)過RTPR,得到了小鼠特異性的Rantes基因片段,大小約為210bp,將Rantes基因片段插入真核質(zhì)粒SR特定位置,構建成真核表達質(zhì)粒DT390RantesSR。圖2為ERI、SalI、NI酶切鑒定的結(jié)果,使用ERI單酶切,片段長度約為85kb;ERI及SalI雙酶切,2條片段長度分別約為7kb及1.5kb;將雙酶切后的小片段用NI酶切后,結(jié)果又將該片段切割成為約200bp及1.3kb左右的片段(圖2)。DNA測序結(jié)果顯示,插入Rantes片段后,真核質(zhì)粒的閱讀框架保持不變,且小鼠Rantes及DT390序列

15、與基因庫公布的符合測序結(jié)果未顯示。圖2利用限制型內(nèi)切酶分析重組質(zhì)粒DT390RantesSR略Fig2RestritinenzyedigestinanalysisfrebinantplasidDT390RantesSR1:DNAarker(1kbplus);2:DT390RantesSRERI;3:DT390RantesSRERI+SalI;4:DT390Rantesfragentfgelextratin;5:DT390RantesfragentN.2.3EAE小鼠臨床病癥的變化初次免疫后第6天開場,未治療組小鼠開場出現(xiàn)EAE病癥,包括行動緩慢,后肢外展,拖尾等,在第1520天,病癥到達頂峰,

16、出現(xiàn)體質(zhì)量減輕,后肢癱瘓等,頂峰期的臨床評分為2.170.17,從第21天病癥開場減輕,第35天左右恢復正常;治療組小鼠平均第14天才開場發(fā)病,疾病周期持續(xù)約20d,頂峰期的臨床評分為1.170.29(P0.05,圖3。圖3實驗組與對照組小鼠臨床評分略Fig3Theeanliniaalsresfdifferentgrups2.4EAE小鼠腦部病理學及免疫組織化學檢測結(jié)果臨床病癥頂峰期的未治療組小鼠腦膜周圍有大量炎性細胞浸潤,整片發(fā)現(xiàn),大腦皮質(zhì)疏松,小腦腦膜下淋巴細胞浸潤,腦膜血管周圍淋巴細胞浸潤等病理改變;而治療組小鼠腦膜血管周及大腦本質(zhì)中淋巴細胞浸潤明顯減少,未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變;使用抗小鼠

17、的R5Ab作為一抗進展免疫組織化學檢測,未治療組小鼠病癥頂峰期發(fā)現(xiàn),R5陽性細胞可存在于白質(zhì)、灰質(zhì)及軟腦膜等,其中腦膜血管周部分最多,同期治療組小鼠R5陽性細胞很少,在該組小鼠病癥頂峰期檢測發(fā)現(xiàn),R5陽性細胞仍然很少圖4。圖4中樞神經(jīng)系統(tǒng)中R5+T細胞免疫組織化學結(jié)果略Fig4IunhistheialdetetinfXR5+TellsintheNS(40)A:Theeningealperivasularsituatinftreatedie;B:Theerebralsituatinftreatedie;:Theeningealperivasularsituatinfuntreatedie;D:T

18、heerebralsituatinfuntreatedie;E:Theeningealperivasularsituatinfnralie;F:Theerebralsituatinfnralie.2.5外周血細胞因子檢測結(jié)果治療組外周血IFN的峰值為45.472.35ng/L,低于PBS組的337.7033.57ng/LP0.05,且治療組頂峰出現(xiàn)的時間較未治療組晚約10d圖5。2.6DT390Rantes對T淋巴細胞的作用流式細胞術檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),治療組中小鼠頂峰期D3+T細胞的比例為(14.11.35)%,未治療組中為(24.932.14)%,陰性對照組為(12.491.32)%;而治療組中

19、小鼠頂峰期D19B細胞的比例為(68.277.19)%,未治療組中為(61.574.54)%,陰性對照組為(70.875.06)%圖6。圖5各組小鼠外周血IFN程度變化情況略Fig5TheIFNlevelinperipheralbldfdifferentgrups圖6各組T細胞與B細胞的比例略Fig6TheprprtinfTellsandBellsindifferentgrupsA:DT390Rantestreatedgrup;B:Untreatedgrup;:Nralgrup.3討論EAE是由T細胞介導的自身免疫性疾病,它的發(fā)生開展是一個非常復雜的過程,體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡系統(tǒng)會發(fā)生一系

20、列的變化9。目前認為小鼠EAE產(chǎn)生是由活化的自身免疫性T細胞由部分淋巴組織遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng),造成NS炎性損害的結(jié)果,其中趨化因子及其受體之間的互相作用在T細胞遷移過程中發(fā)揮了重要的作用。研究說明,在活化T細胞外表表達有一些特異性的受體,如R510、XR3、IL2R等,而未活化的T細胞外表不表達這些受體。本實驗中,將活化T細胞上R5受體的配體Rantes與修飾過的白喉桿菌外毒素DT390組成一種重組免疫毒素,通過R5與Rantes之間的作用,DT390Rantes與R5+的T細胞發(fā)生特異性結(jié)合,并通過內(nèi)吞的方式進入胞內(nèi)。DT390在胞內(nèi)發(fā)揮其抑制細胞內(nèi)蛋白合成的作用,最終殺死細胞,以此治療EA

21、E疾玻為了使Rantes基因片段正確地插入到真核質(zhì)粒的指定位置,設計Rantes基因的引物時,在其PR特異性的引物兩端分別參加了NI和ERI的酶切位點和相應的保護堿基,同時使用這2個酶切真核質(zhì)粒SR,然后進展連接反響,成功地形成了DT390Rantes的重組免疫毒素片段。從而有利于相應的DT390Rantes交融蛋白的表達。通常,利用重組免疫毒素治療的方法首先是將重組免疫毒素在細菌或酵母菌中體外表達,然后經(jīng)濃縮和純化后使用11。本實驗中,將含有重組免疫毒素核酸片段的真核表達質(zhì)粒用陽離子脂質(zhì)體進展包被后形成DNA脂質(zhì)體復合物直接使用,簡化了實驗步驟,同時由于包被后形成的DNA脂質(zhì)體復合物具有保護

22、DNA和緩釋的作用,使得目的DNA可以緩慢釋放,在體內(nèi)翻譯成為目的蛋白,延長了作用時間。通過對治療組與未治療組小鼠臨床病癥的觀察評分、腦部病理切片的檢查、外周血IFN的程度的變化、和T/B細胞的比率變化,說明一種新型重組免疫毒素DT390Rantes真核表達載體被構建成功,同時它可以延緩小鼠EAE的發(fā)生,減輕疾病的強度,有效地抑制活化的T細胞,對其具有較強的殺傷才能。本研究為治療人的S提供了一些有益的借鑒,其中包括靶向分子的選擇、新型重組免疫毒素的構建及常用的治療方法等。目前需要進一步研究的內(nèi)容包括重組免疫毒素體內(nèi)毒性的檢測,及其在體內(nèi)各臟器的代謝情況等。只有對該重組免疫毒素特性的進展深化研究

23、,才能為人S的治療提供更詳盡的資料,為S的治療提供新的方法。參考文獻:1PetryK,BulleeA,PussetF,etal.ExperientalallergienephalyelitisanialdelsfranalyzingfeaturesfultipleslersisJ.PathlBil,2000,48(1):47-53.2ekalaDJ,AlliRS,GeigerTL.IL10dependentsuppressinfexperientalallergienephalyelitisbyTh2differentiated,antiTRrediretedTlyphytesJ.JIunl,

24、2022,174(6):3789-3797.3LuaE,KelJ,vanRijs,etal.annsylatedPLP(139-151)induespeptidespeifitleranetexperientalautiuneenephalyelitisJ.JNeuriunl,2022,160(1-2):178-187.4SithPA,rrisDnes,HeijansN,etal.EpitpespreadisntritialfrtherelapseandprgressinfG821induedEAEinBizziABHieJ.JNeuriunl,2022,164(1-2):76-84.5KarlssnI,AntnssnL,ShiY,etal.evlutinfRANTESsensitivityanddefR5reeptrusebyhuaniundefiienyvirustype1ftheR5phent