引物合成基礎(chǔ)問題

1、Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種，無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理 都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。去保護(hù)：加入Deblocking脫去堿基上5-OH的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5-OH ；耦合：同時加入活化劑和新的堿基，新的堿基5-OH仍然被DMT保護(hù)，3端被活化與溶液中游離的5-OH 發(fā)生耦合反應(yīng)；封閉：耦合反應(yīng)中極少數(shù)5-OH沒有參加反應(yīng)，用封閉試劑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)；氧化：加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩(wěn)定的核苷磷酸酯。Q2.引物合成如何處理？切割與脫保護(hù)基：將合成好的寡核苷酸鏈從支持物

2、上化學(xué)切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG與初始 核苷之間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3羥基。純化：根據(jù)所合成寡核苷酸的組成和應(yīng)用來選定純化的方法。常用的純化方法有：C18、OPC、PAGE和 HPLC。定量：根據(jù)寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。儲存：分裝抽干。Q3.合成的引物5端是否有磷酸化？合成的引物5為羥基，沒有磷酸基團(tuán)。如果需要您可以用多核苷酸激酶進(jìn)行5端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5或3端進(jìn)行磷酸化，需要另外收費。Q4.需要什么級別的引物？根據(jù)實驗需要，確定訂購引物的純度級別。診斷PCR擴(kuò)增40baseHEPD,PAGE應(yīng)用引物長度要求純度級別要求一般PCR擴(kuò)增

3、60basePAGE亞克隆，點突變等根據(jù)實驗要求定HEPD,PAGE，HPLC基因構(gòu)建（全基因合成）根據(jù)實驗要求定HEPDPAGE反義核酸根據(jù)實驗要求定HEPDPAGE修飾引物根據(jù)實驗要求定PAGE,HPLCDNA測序20base左右HEPDQ5.需要合成多少OD數(shù)？根據(jù)實驗?zāi)康拇_定。一般PCR擴(kuò)增，2OD弓I物，可以做500-1000次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因 拼接或退火后做連接，1OD就足夠了。Q6.如何計算引物的濃度？引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。一般情況下，我們建議將引物的濃度配制成100pmol/ul,稱為保存 濃度，而引物的工作濃度一般配制成10-50pmol/ul

4、。加水的體積（微升）可直接參照合成報告單上推薦的 體積，也可按下列方式計算：V（微升）=OD數(shù)x33x10000/引物的分子量引物的分子量可以從合成報告單上獲得。注意：1OD26033ug/ml。溶解前您需要核對合成報告單和引物標(biāo)簽上的引物OD數(shù)是否一致。如果不一致，請和我們聯(lián)系。我們可 以根據(jù)生產(chǎn)記錄查到實際產(chǎn)量是多少。Q7.如何計算引物的Tm值？引物設(shè)計軟件都可以給出Tm，與引物長度、堿基組成及所使用緩沖夜的離子強(qiáng)度有關(guān)。長度為25base以下的引物，Tm計算公式為：Tm=4 C（G+C）+2 C（A+T）對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：Tm=81.5 + 16.6xLog10Na+

5、0.41（GC%） 600/size 大火公式中，Size=引物長度。Q8.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？非修飾的引物的分子量（MW）在隨引物提供的報告單上可以找到。如果需要估計一個引物的分子量按每 個堿基的平均分子量為324.5,引物的分子量=堿基數(shù)x堿基的平均分子量，或按下列公式計算MW=（NA*WA)+(NC*WC)+(NG*WG)+(NT*WT)+(Nmod*Wmod) +(Nx*Wx)+(NI*WI) + 16*Ns-62.NA,NG,NC,NT,NI 分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量，WA,WG,WC,WT,WI 分別為引物 中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod

6、, Wmod分別為修飾基團(tuán)的數(shù)目和分子量。對于混合堿基 的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù)，例如G+A混合的分子量為(313.21+329.21)/2 = 321.21。 Ns為硫代數(shù)目，硫代每個位置增加分子量16。常規(guī)堿基分子量BaseMolecularWeightA313.21C289.18G329.21T304.19I314.2U290.17常規(guī)修飾基團(tuán)分子量5-Biotin405.4535-TAMARA623.605-(6FAM)537.463-Dabsyl498.495-HEX744.133-(6FAM)569.465-TET675.243-AminoModifierC3153

7、.075-Cy5533.633-AminoModifierC7209.185-Cy3507.593-ThiolModifierC3154.12Q9.如何溶解引物？干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前最好瞬時離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到 管底。根據(jù)計算出的體積加入去離子無菌水或TE(pH8.0)緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶 液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5)，引物在這 種條件下不穩(wěn)定。Q10.如何保存引物?引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成無色或白色絮狀干粉。干粉：運輸時常溫運輸，-20笆可以

8、保存一年。儲存液：配好后分裝成幾管，避免反復(fù)凍融，-20笆可以保存半年。工作液：常規(guī)使用，4C保存，也可-20C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物：需要避光保存，盡快使用為宜。Q11.引物定量不準(zhǔn)是怎么回事兒？我們偶爾收到用戶投訴定量不準(zhǔn)的報告，出現(xiàn)這種情況的可能性有：定量錯誤、分裝錯誤、引物抽干或收樣過程中意外丟失。這種可能性有，但是很少，因為作為專業(yè)的 引物合成公司，我們的生產(chǎn)人員都是經(jīng)過嚴(yán)格的專業(yè)培訓(xùn)，這種錯誤是要求謹(jǐn)慎避免甚至杜絕的。一般情 況下，引物都有留樣備份，接到用戶投訴后，我們都會找出留樣重新定量，一般都沒有問題，如確實存在 問題，則可安排重新準(zhǔn)備一份。系統(tǒng)誤差，我們認(rèn)為10

9、%左右為允許誤差。使用過程中，引物工作濃度范圍很寬，定量上的少許偏 差不影響實驗。用戶收到引物干粉時，打開引物管蓋前沒有離心或其他誤操作導(dǎo)致引物干粉部分丟失。用戶沒有能夠正確理解引物OD數(shù)的含義，沒有能夠正確使用分光光度計，特別是使用微量測定； 用戶沒有將OD讀數(shù)，正確地轉(zhuǎn)換成母液中OD數(shù)。這種情況比較常見。例如，驗證標(biāo)2OD引物量是否準(zhǔn)確，簡單的做法是：加A1ml水，徹底溶解混勻后，取100ul,加入900ul 水，用光徑為1cm的石英比色杯，波長260nm,此時光吸收的讀數(shù)為0.2。Q12.最長可以合成多長的引物？我們合成過100base的引物，但是產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長度不要

10、超過80base。引物越長， 出現(xiàn)問題的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗產(chǎn)品，全長引物的百分比不高，后續(xù) 處理還有丟失很多，最后的產(chǎn)量很低。Q13.為什么修飾引物的產(chǎn)量要比一般引物低，價格要高？主要因為是修飾單體穩(wěn)定性較差，偶連時間長，效率低，最后得到的產(chǎn)量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產(chǎn) 品的價格也高。Q14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？連接反應(yīng)需要引物的5磷酸基團(tuán)。如果需要將合成的引物退火直接連接相應(yīng)的載體上，引物需要磷酸化。 磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，

11、需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子 具有特殊的對稱結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。Q15.如果測序發(fā)現(xiàn)引物突變，是否有補(bǔ)償？該如何處理？如果出現(xiàn)測序發(fā)現(xiàn)引物位置堿基錯誤的情況，我們可以免費重合一次，沒有其他任何補(bǔ)償或賠償，不承擔(dān) 其他連帶責(zé)任，這是國際行規(guī)。原因我們在前面已提到，化學(xué)合成效率不可能達(dá)到100%。如果遇到這種情況，首先和我們聯(lián)系，我們會檢查合成序列是否和原始訂單一致，如果確認(rèn)引物合成序列 沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。根據(jù)我們經(jīng)驗，40個堿基以下的引物， 測1-2個克隆就可以了； 40個以上的特別是用于全片段

12、拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每 個克隆突變的位點都不一樣，正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次， 不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。 基因拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。根據(jù)全基因合成的數(shù)據(jù)，我們的引物能做到2000個堿基的片段，取三個克隆，其中至少有一個是正確的。Q17.為什么引物的OD260/OD280小于1.5？需要指出的是OD26/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD26/OD280的比值過低一般是由于引物中 C/T的含量比較高所致。下表

13、是一個20base同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/D280 的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。A260/280ratiosofCrude20-merOligosofDifferingBaseCompositionsBaseCompositionA260/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-32.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-31.855-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-31.155-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-31.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-31.66Q18.同樣的OD用PAGE檢測

14、，EB染色為什么深淺不一？通?？梢杂肊B染色的方法來判斷雙鏈DNA的量（如質(zhì)粒DNA），因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合 成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo（dT） 等不形成二級結(jié)構(gòu)，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。Q19.如何檢測引物的純度？實驗室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5OD 的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95C2mins）。加入尿 素的目的一是變性，二是增加樣品比

15、重，容易加樣600V電壓進(jìn)行電泳，一定時間后（約2-3小時），剝膠， 用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用銀 染方式染色。Q20.已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？如果您溶解引物的水pH過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均 勻也可能會造成引物加入量不準(zhǔn)確。建議分裝引物，避免反復(fù)凍溶。建議使用10mMTrispH7.5緩沖液溶 解引物，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5），引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒 有問題，而是PCR使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用

16、的不完全一致。Q21.引物是我們設(shè)計的，現(xiàn)在您擴(kuò)不出來，我們要負(fù)責(zé)嗎？不承擔(dān)相關(guān)責(zé)任。我們?yōu)橐恍嶒灲?jīng)驗不足的客戶，免費設(shè)計引物，提供一定的便利。我們遵循一般的引 物設(shè)計原則設(shè)計好引物之后都會發(fā)給您確認(rèn)，而后再安排合成并保證引物質(zhì)量。但是設(shè)計的引物是否能夠 滿足您的實驗要求，一定擴(kuò)增出您需要的基因片段，誰也不能100%保證。Q22.PCR擴(kuò)增無目的片段是引物質(zhì)量有問題嗎？PCR擴(kuò)增無目的條帶或者非特異性擴(kuò)增，影響因素是多方面的，需要耐心地分析，如模板結(jié)構(gòu)與質(zhì)量、反應(yīng)條件、引物設(shè)計等等。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的PCR擴(kuò)增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴(kuò)增中遇到的擴(kuò)不出，擴(kuò)增效率低的問題

17、。如巢式PCR就是擴(kuò)增拷貝數(shù)很低的基因片段。通過提高模板質(zhì)量、優(yōu)化反應(yīng)條件等方面找到對策，或者有必要時重新設(shè)計引物，最好在實驗時設(shè)置對照來判定原因。如 果您懷疑引物的問題，請您首先測定您溶解的引物的OD值，看實驗時加入的引物量是否正確。如果量是 正常的，請您告訴我司您的引物編號，我們會復(fù)查留存樣品。如不明原因，我們免費為您重新合成一次。 如果仍然不能擴(kuò)增，請您查找其它原因。多數(shù)情況下我們復(fù)檢引物質(zhì)量都沒有問題，因為我們在引物出售 前已經(jīng)嚴(yán)格把好質(zhì)量關(guān)。Q23.常用熒光染料參數(shù)ExcitationEmission染料（激發(fā)波長，nm）（發(fā)射波長，nm）顏色6-FAM494518Fluoresce495520Yellow-greeninTET521536JOE520548YellowHEX533559CY3550570Yellow-orangeTAMRA544576ROX576601Ora