實驗五 熒光分光光度法測維生素C

1、教案首頁教案完成時間：2012年02月課程名稱基礎化學實驗II授課年級及專業(yè)2011級化學各專業(yè)教學內(nèi)容授課題目（章、節(jié)）實驗五熒光分光光度法測維生素C教材名稱化學實驗（下冊），王倫、方賓主編，高等教育出版社教材起止頁碼19-23計劃學時4教學要求掌握內(nèi)容熒光分析法的基本原理（熒光的產(chǎn)生、熒光光譜的特征、熒 光強度與物質(zhì)濃度的關系）；熒光定量分析方法測定維生素C;熒光分光光度計的使用。教學要點重點熒光分析法的基本原理；熒光分光光度計的使用。教學進程熒光分析法的基本原理、維生素C簡介（20 min）實驗步驟（15 min）儀器介紹和使用示范（20 min）教學方法原理部分以講授為主，輔以提問、討

2、論等多種方式；溶液配制強調(diào)規(guī)范操作；儀 器演示，學生使用為主。（教案續(xù)頁）授課時間：2012年2月20日-4月授課地點：2220教學主要內(nèi)容一、實驗目的二、實驗原理(一)熒光分光光度法1、什么是熒光？當紫外光照射到某些物質(zhì)的時候，這些物質(zhì)會發(fā)射出各種顏色和不同強度的可見光，而當 紫外光停止照射時，這種光線也隨之很快地消失，這種光線稱為熒光。2、熒光分光光度法發(fā)展的背景第一次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學家N.Monardes，1575年他提到在 含有一種稱為“LignumNephriticum，的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛的天藍色，在17世紀， Boyle(16261

3、691)和 Newton(16241727)等著名科學家再次觀察到熒光現(xiàn)象，并且給予更詳細的 描述。1852年Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光計觀察到其熒光的波長比入射光的波 長稍為長些，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫 射作用所引起的，從而導入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦物“螢石”推演而提出“熒光” 這一術語。1867年，Goppelsroder)進行了歷史上首次的熒光分析工作，應用鋁一桑色素配合物的熒 光進行鋁的測定。1880年，Liebeman提出了最早的關于熒光與化學結構關系的經(jīng)驗法則，到19世 紀末，人們已經(jīng)知道了包括熒

4、光素、曙紅、多環(huán)芳烴等600種以上的熒光化合物。20世紀以來，熒光現(xiàn)象被研究得更多。例如，1905年Wood發(fā)現(xiàn)了共振熒光；1914年Frank 和Hertz利用電子沖擊發(fā)光進行定量研究;1922年 Frank和Cario發(fā)現(xiàn)了增感熒光;1924年Wawillous 進行了熒光產(chǎn)率的絕對測定；1926年Gaviola進行了熒光壽命的直接測定等等。熒光分析方法的發(fā)展，與儀器應用的發(fā)展是分不開。19世紀以前，熒光的觀察是靠肉眼進行 的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺光電熒光計。早期的光電熒光計的靈敏度是有 限的，1939年Zworykin和Rajchman發(fā)明光電倍增管以后，

5、在增加靈敏度和容許使用分辨率更高 的單色器等方面，是一個非常重要的階段。1943年Dutton和Bailey提出了一種熒光光譜的手工校 正步驟，1948年由Studer推出了第一臺自動光譜校正裝置，到1952年才出現(xiàn)商品化的校正光譜儀 器。近十幾年來，在其它學科迅速發(fā)展的影響下，隨著激光、微處理機和電子學的新成就等一些 新的科學技術的引入，大大推動了熒光分析法在理論方面的進展，促進了諸如同步熒光測定、導 數(shù)熒光測定、時間分辨熒光測定、相分辨熒光測定、熒光偏振測定、熒光免疫測定、低溫熒光測 定、固體表面熒光測定、熒光反應速率法、三維熒光光譜技術和熒光光纖化學傳感器等熒光分析 方面的某些新方法、新

6、技術的發(fā)展，并且相應地加速了各式各樣新型的熒光分析儀器的問世，使 熒光分析法不斷朝著高效、痕量、微觀和自動化的方向發(fā)展，方法的靈敏度、準確度和選擇性日 益提高，方法的應用范圍大大擴展，遍及于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護、公安情報和科學 研究等各個領域中。如今，熒光分析法已經(jīng)發(fā)展成為一種重要且有效的光譜化學分析手段。在我國，50年代初期僅有極少數(shù)的分析化學工作者從事熒光分析方面的研究工作，但到了 70 年代后期，熒光分析法已引起國內(nèi)分析界的廣泛重視，在全國眾多的分析化學工作者中，已逐步 形成一支從事這一領域工作的隊伍。近年來，國內(nèi)發(fā)表的有關熒光分析方面的論文數(shù)量增長較快， 所涉及的內(nèi)容也已從經(jīng)

7、典的熒光分析法逐步擴展到新近發(fā)展起來的一些新方法和新技術，在儀器 應用方面也陸續(xù)有幾種類型的國產(chǎn)的熒光分析光度計問世，為這一分析方法的發(fā)展和普及提供了 一定的物質(zhì)條件。3、熒光產(chǎn)生的原理熒光是一種自然現(xiàn)象，在我們的日常生活中到處可以看見。產(chǎn)生熒光的原因是：熒光物質(zhì)分 子吸收了特征頻率的能量后，由基態(tài)躍遷到較高能級的第一電子激發(fā)態(tài)或第二電子激發(fā)態(tài)，處于 激發(fā)態(tài)的分子，通過相互碰撞或和其它溶劑分子碰撞等去活化的過程，無輻射去活，將多余的能 量轉(zhuǎn)移給其他分子或激發(fā)態(tài)分子內(nèi)振動或轉(zhuǎn)動能級后，回至第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，這種躍 遷稱為無輻射躍遷，它不會發(fā)光。，當電子由激發(fā)態(tài)的最低振動能級躍遷回基態(tài)的不

8、同振動能級時， 則以熒光的形態(tài)發(fā)出能量。此時所發(fā)的光，我們稱為熒光。由此可見，無論物質(zhì)吸收了多高的能 量，它的熒光能量是一致的，因為它都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回到基態(tài)。熒光是物質(zhì)吸收光的能量后產(chǎn)生的，因此任何熒光物質(zhì)都具有兩種光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光 譜。（1）激發(fā)光譜 繪制激發(fā)光譜時，固定熒光的最大發(fā)射波長，然后改變激發(fā)光的波長，所測 得的熒光強度與激發(fā)波長的譜線關系即為激發(fā)光譜。它反映了物質(zhì)的熒光強度對激發(fā)波長的關系。 激發(fā)光譜曲線上的最大熒光強度所對應的波長，稱為最大激發(fā)波長，它表示在此波長處，分子吸 收的能量最大，處于激發(fā)態(tài)分子的數(shù)目最多，因而能產(chǎn)生最強的熒光。（2）發(fā)射光譜

9、發(fā)射光譜 簡稱熒光光譜。繪制發(fā)射光譜時，固定熒光的最大激發(fā)波長，然后改變發(fā)射光的波長，所測得的 熒光強度與發(fā)射波長的譜線關系即為發(fā)射光譜。它反映了物質(zhì)的熒光強度對發(fā)射波長的關系，其 最大熒光強度處所對應的波長稱為最大發(fā)射波長。不同物質(zhì)由于分子結構的不同，其激發(fā)態(tài)能級的分布具有各自不同的特征，這種特征反映在 熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其特征熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，因此可以用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的不同 來定性地進行物質(zhì)的鑒定。在溶液中，當熒光物質(zhì)的濃度較低時，其熒光強度與該物質(zhì)的濃度通 常有良好的正比關系，利用這種關系可以進行熒光物質(zhì)的定量分析，這與紫外可見分光光度法類 似，熒光分析通常也采用標準曲線法進

10、行。在熒光分析中，一般選擇最大激發(fā)波長作為激發(fā)光波 長，通過測量熒光光譜中最大發(fā)射波長處的熒光強度來進行定量分析。熒光強度是表示發(fā)射相對強度的物理量，它是最常用的熒光參數(shù)之一。目前一般的商品儀器 都采用熒光強度來表示，所以單位為任意單位，表示的是相對強度。物質(zhì)發(fā)射的熒光強度與它吸 收的光能成正比，當測量的溶液很稀時，可用如下公式表示：F=2.303010 bc：量子效率，發(fā)射光量子與吸收光量子之比；10：入射光強度； :摩爾吸光系數(shù)；b：光程；c：濃度由上式可發(fā)看出，熒光強度與樣品消光系數(shù)和量子產(chǎn)率成正比，也與樣品的濃度和池光徑長 度成正比。公式成立前提條件： bc=A0.05即：當試樣濃度較

11、低時（c0.05/ b），c與F方成線性。（如果濃度過高，分子碰撞機會增大， 而產(chǎn)生無輻射去激活，造成線性偏離。）由于分子無論被激發(fā)到高于S1哪一個激發(fā)態(tài)，都經(jīng)過無輻射的振動馳豫或內(nèi)部轉(zhuǎn)換等過程， 最終回到S1態(tài)的最低振動能級，然后躍遷回基態(tài)產(chǎn)生熒光。由于無輻射躍遷的幾率大，因此分子 熒光波長常常比激發(fā)光長。激發(fā)光的波長通常是在紫外區(qū)，熒光也可能在紫外區(qū)，但更多的是在 可見區(qū)。因此，熒光光譜形狀與激發(fā)波長無關，且熒光發(fā)射的能量要比吸收光的能量?。úㄩL要 長）。熒光光譜的形狀和吸收光譜的性狀十分相似，且互為鏡像。因為吸收光譜反映的是第一電子 激發(fā)態(tài)的能級分布情況；而熒光光譜反映的是基態(tài)能級的分布

12、情況，而基態(tài)能級的分布和第一電 子激發(fā)態(tài)中的能級分布是相似的，所以熒光光譜的形狀與吸收光譜十分相似。又因為在相當于由 基態(tài)中最低振動能級躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)各振動能級而顯示的熒光峰中，基態(tài)的振動能級越高， 則兩個能級的差距越小，及熒光波長越長。所以前后二者不僅形狀相似，而且互為鏡像。熒光分光光度法與紫外可見分光光度法的區(qū)別：紫外-可見分析是利用紫外光照射物質(zhì)后產(chǎn)生吸收，測其吸光度；而熒光是在透射光的垂直方 向測發(fā)射熒光的強度，以免透射光干擾。簡單的說，二者的區(qū)別主要在于光路不同。熒光分光光度法的特點：（1）靈敏度高熒光分析的最大特點是靈敏度高，通常比紫外可見光度計高出23個數(shù)量級。 主要原因：

13、一是熒光信號是在暗背景下檢測的，噪聲小，較微弱的信號也能被檢測，且可以高倍 放大；二是熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度也可以增大熒光強度，使測定的靈敏 度提高；而吸光光度法測定的是吸光度，不管是增大入射光強度，還是提高檢測器的靈敏度，都 會使透射光信號以同樣的比例增大，吸光度值不會改變，因此靈敏度不能提高。（2）選擇性強熒光分析法的光譜比較簡單，特征性強，而且有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，選擇的 余地大。如果某幾種物質(zhì)的激發(fā)光譜相似，就可以從它們的發(fā)射光譜的差異進行鑒別和分析；反 之亦然。比較適合于有機化合物的分析。對于金屬離子的分析，往往選擇性不太高，這是由于金 屬離子的分析往往是通過產(chǎn)生

14、具有熒光特性的配合物或熒光猝滅進行測定。而且熒光特性又往往 取決于配位體，不同金屬離子經(jīng)常與同一配位體形成相似的配合物，具有相似的熒光特性，故會 相互干擾。（3）提供較多的物理參數(shù)可提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜和三維光譜以及熒光強度、熒光效率、 熒光壽命、熒光成像等多種物理參數(shù)，這些參數(shù)反映了分子的各種特性，能從不同角度提供研究 對象的分子的信息。（二）維生素C維生素C是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以被人們稱做抗壞血酸，廣泛存在于植 物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含量較 多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在有些條件下又是一種抗氧化劑。自然

15、界存在的有L 一型、D 一型兩種，D 一型的生物活性僅為L一型的1/10。維生素C具有較強的還原性，對光敏感， 氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性，進一步水解則生成2, 3一二酮古樂糖酸， 失去生理作用。食品分析中的所謂總抗壞血酸是指抗壞血酸和脫氫抗壞血酸二者的總量，不包括 二酮古樂糖酸和進一步的氧化產(chǎn)物。測定維生素C的常用方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、熒光法和高效液相色譜法等。靛酚滴定 法測定的是還原型抗壞血酸，該法簡便，也較靈敏，但特異性差，樣品中的其它還原性物質(zhì)（如 Fe2+、Sn2+、Cu+等）會干擾測定，測定結果往往偏高。高效液相色譜法可以同時測得抗壞血酸和 脫氫抗壞血酸

16、的含量，具有干擾少、準確度高、重現(xiàn)性好，靈敏、簡便、快速等優(yōu)點，是目前最 先進的方法，但是所需的儀器昂貴。苯肼比色法和熒光光度法測得的都是抗壞血酸和脫氫抗壞血 酸的總量，其中以熒光法受干擾的影響較小，準確度較高。熒光分光光度法測定維生素C的原理分子結構與熒光的關系物質(zhì)分子能發(fā)射熒光的兩個必要條件是：有強的紫外-可見吸收；有一定的熒光效率。長共軛結構具有長共軛結構的分子都是一些芳香環(huán)、稠環(huán)或雜環(huán)的物質(zhì)。這類物質(zhì)有利 于熒光的發(fā)射，因為它們的共平面性大，兀電子共軛程度也大，熒光效率就大。所以共軛系統(tǒng)越 長，熒光效率越大，激發(fā)波長、熒光波長長移。例如：入ex （激發(fā)）入em （激發(fā)）%苯205278

17、0.11萘2863210.29蒽365400046四苯3904800.60另外 稠芳環(huán)分子排列的幾何形狀對熒光也有影響，比如蒽和菲都是三個苯環(huán)組成，蒽的熒蒽菲苯并蒽另外，含有長共軛雙鍵的脂肪烴也可能有熒光，但這類化合物為數(shù)不多。XAJCHzOCOC%VAex=327nmAem=510nm分子的剛性和共平面性 在共軛系統(tǒng)中，分子的剛性和共平面性越大，越有利于熒光發(fā)射。OH聯(lián)苯竹=0.2芴1.0OxO-O,Na8-羥基喹林w8-羥基喹林鎂Mg/2|COO-熒光素鈉1-二甲氨基萘-7-磺酸鹽1-二甲氨基萘-8-磺酸鹽片=0.75片=0.03對于順反結構，順式共面性差，反式共面性好，如1，2-二苯乙烯

18、幾乎無熒光，反式有熒光。取代基供電子基：如 NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN等，這些基團存在，使熒光效率增加 如 t，熒光強度增強Ft。吸電子基：如-no2、-cooh、-nhcoch3、-c=o、-no、-sh、鹵素等，使熒光效率降 低竹I，減小躍遷幾率，熒光強度減小Fl，甚至熄滅。(3)-R、-SO3H、-NH3+:對無影響，因為它們對芳香環(huán)n電子影響不大。三、實驗步驟1、準確稱取抗壞血酸50mg,加50mL偏磷酸-乙酸溶液溶解稀釋定容至50mL。2、移取該溶液10mL于一個100mL的容量瓶中用偏磷酸-乙酸溶液稀釋定容。3、將100mL的看抗壞血酸溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，在臺秤上稱量2g活性炭加入，振搖1min，過 濾，得脫氫抗壞血酸。4、取上述脫氫抗壞血酸溶液10mL，加入5mL50%乙酸鈉后，用水稀釋至刻度，得10ug/mL的 脫氫抗壞血酸溶液。5、向1-7號10mL的容量瓶中分別加入上述脫氫抗壞血酸溶液0.00, 0.50, 1.00, 1.50, 2.00, 2.50, 1.70 mL，分別加入5mL鄰苯二胺溶液（現(xiàn)配，稱取20mg用水溶解定容于250mL容量瓶），用水 稀釋至刻度，搖勻，暗處