基因克隆酶學(xué)基礎(chǔ)(4)

1、關(guān)于基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ) (4)第一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月分子克隆工具酶及其應(yīng)用限制性內(nèi)切酶主要用于DNA分子的特異切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特異性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸連接酶用于DNA和RNA的連接 核酸末端修飾酶用于DNA和RNA的末端修飾 其它酶類-用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。第二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 限制性內(nèi)切核酸酶第三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 一 . 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 1.細(xì)菌限制修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) Werner Arber于1962-1

2、968年發(fā)現(xiàn)，1968年分離到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的發(fā)現(xiàn) HOSmith 和Wilox 于1970年首次從流感嗜血桿菌（H. influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到HindII限制酶。 3. SV40 限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制 D. Nathans（1971年）用HindII繪制SV40的限制酶譜。 第四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二 . 限制修飾系統(tǒng)的種類1.I型：由三個基因構(gòu)成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色體上，三個基因

3、構(gòu)成一個復(fù)合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。2.II型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用，在. coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。3.III型：修飾酶與型酶相同，hsd與hsd基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。 上述三個系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。 第五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 三. 限制性內(nèi)切酶的定義、命名 1. 定義：廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶； 狹義指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：Hind前三個字母來自于菌種名稱H. infl

4、uenzae，“”表示菌系為型血清型；“”表示分離到的第三個限制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I ()第六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月四限制酶的特點 1. 識別順序和酶切位點 ）識別-8個相連的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG

5、Fok I 5-()9-3 3-()13-5 外側(cè)，產(chǎn)生-端突起 ）富含第七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 ）對稱性雙對稱 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 ）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外 ）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是-和- 2.末端種類 ）-端突起，個數(shù)為或個核苷酸 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5 ）-端突起，個數(shù)為或個核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5第八張，PPT

6、共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 ）平齊末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 ）非互補(bǔ)的粘性末端 ）切點在識別順序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 ）能識別簡并順序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG 第九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月）相容性末端如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI

7、N GATCN 上述幾種限制酶產(chǎn)生的DNA片段仍可相連，由此形成的重組分子能被MboI和Sau3AI識別和酶切，但BamHI和BglII的識別機(jī)率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識別和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C 不同末端的連接特性: 除第4種末端不能進(jìn)行不同DNA分子或同種DNA分子不同切點產(chǎn)生的末端相連外，其余4種末端可以相互連接。第十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月五. 異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）

8、1. 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制 酶 2. 特點：1）識別相同順序 2）切割位點的異同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 限制酶的星反應(yīng)（star activity） 1.特點: 限制酶識別序列特異性降低 2.發(fā)生星反應(yīng)的限制酶和條件（見下頁） 3.星反應(yīng)的利用和避免第十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月表1 具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條件限制酶誘發(fā)星活性的條件a識別序列AvaI 1, 2, 4BamHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCCBstI 2, 4BsuI 2,

9、4, 6EcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTNHae 2, 4HhaI 2, 4, 7Hind 6HpaI 1, 2, 4PstI 1, 2, 4, 7Pvu 2, 4SalI 1, 2, 4, 7ScaI 4 - 6, 8 Sst 2, 4XbaI 2, 4, 7a.1：亞乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)； 5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5; 7:二甲基亞砜(8%); 8:無NaCl。 第十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月七. 其它特異性的內(nèi)切酶及其用途 1. 末端酶（ terminase）： 5-GGGC

10、GGCGACCTN-3 N-5，出現(xiàn)的頻率約412 分子量為 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000） 2. Omega核酸酶（I-SceI）： 由內(nèi)含子編碼，用于rRNA的剪切，出現(xiàn)的頻率約418 = 6.9 X 1010 bp，其識別順序為 5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 TATT 3. I-PpoI：來自于Physarum polycephalum 識別序列： CTCTCTTAA GGTAGC AATT 4. 用途 遺傳標(biāo)記， 構(gòu)建載體第十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月八. 限制酶的用途 1. DNA重組 2. 限制酶（物理）圖

11、譜繪制 3. 突變分析（RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切與完全酶切附：IIS型限制酶的特點 1. 具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。 2. 酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側(cè)，1- 20nt。 3. 酶切后的末端經(jīng)補(bǔ)平后又可發(fā)生酶切反應(yīng)。 4. 產(chǎn)生粘性末端可以是1-5個核苷酸。 5. 均為單體，分子量為47108 kD。第十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 第二節(jié) DNA 甲 基 化 酶 第十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一. 甲基化酶的種類與識別順序 1. 限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶 三個系統(tǒng)中的甲基化酶可使

12、細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤： 在DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同第十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. Ecoli 的dam、dcm甲基化酶 這類甲基化酶與限制酶無關(guān)，不構(gòu)成相應(yīng)的限制修飾系統(tǒng)。 dam G mATC， dcm C mCA/TGG 3. 哺乳動物的甲基化酶 該酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反應(yīng)與D

13、NA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄等過程有關(guān)。 4. Ecoli中依賴于甲基化的限制修飾系統(tǒng)mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）第十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二. 甲基化酶活性對限制酶活性的影響 1. dcm 和dam甲基化酶對限制酶的影響 1）抑制某些限制酶的活性，不管兩種限制酶的識別順序是完全重疊還是邊界重疊 如：完全重疊 BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG) 邊界重疊 ClaI-dam； Sau96I-dcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管兩者的識別順序為何種重疊 如：dam-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dc

14、m-BstNI第十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月表2 對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶限制酶 識別序列* 甲基化酶Ava GG(A/T)CC(A/T)GG dcmBcl TGATCA dam Cla GATCGAT dam EcoR CC(A/T)GG dcmHph GGTGATC damMbo GATC damNru GATCGCGA damSau96 GGNCC(A/T)GG dcmSauF CC(A/T)GG dcmStu AGGCCTGG dcmTag GATCGA damXba TCTAGATC dam *下橫線字母表示限制酶識別序列, 綠色字母表示dam甲基化酶識別序列,紅

15、色字母表示dcm甲基化酶識別序列第十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2. II型甲基化酶對限制酶活性的影響 ） 抑制同種限制酶的活性 M.BamHI GGATmCCBamHI(GGATCC)M.EcoRI GAmATTCEcoRI(GAATTC) ） 抑制不同種限制酶的活性 a. 順序完全重疊 如：M. ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA） b. 順序邊界重疊 如：M. BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG） ） 抑制不同種限制酶的部分活性 MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGA

16、C 3. 甲基化酶的用途 ） 改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成 ） 在建立基因文庫時，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切第二十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月表3 甲基化酶與識別序列甲基化酶 識別序列a 受甲基化影響的限制酶b M.Alu AGmCT Alu, BamH, Bsp1286 Dde,HgiA, Nhe, Pst M.BamH GGATmCC BamH, Msp M.Cla ATCGmAT Cla, Mbo, Taq dam GmATC c dcm CCA/TGG c M.EcoR GAmATTC EcoR M.HId GCNGC GGmCC M

17、st, Pst, Pvu M.Hae GGmCC Ban,Bgl,Bsp1286,BstX,Hae, Msp,Nae,Nco,Sac, Sau96 M.Hha GmCGC Aha, FnuD, Hha M.Hpa CmCGG Aha,Ava,Ava,Hpa,ScrF M.Hph TmCACC Hinf, Hph, Sau3A M.Msp mCCGG BamH, Msp M.Pst CTGCmAG Alu, Pst M.Taq TCGmA AluI, Ava, EcoRV, HinC, Hinf, Mbo, Taq, Xmna.標(biāo)在堿基的左上角的m表示該堿基被甲基化; b.所列出的限制酶均已商品

18、化; c.參見表2; d.M.HI分離自噬菌體污染的細(xì)菌細(xì)胞，它可識別兩個序列，GCNGC的甲基化位點尚未確定。第二十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭RE用于基因組文庫的建立用于cDNA的連接RERERE第二十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié)核 酸 酶 第二十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月ds-DNA結(jié)構(gòu): 切口, 缺口, 斷口缺口(gap) 切口(nick) 斷口(cut)3HO P53HO P5第二十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于20

19、22年6月一. 外切酶III（ExoIII） 1. 一般特點： 來自于E.coli，分子量28,000 kD 2. 催化反應(yīng)類型 1) 外切酶活性：3 5，產(chǎn)生5-單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 2) 核酸酶H活性：除去DNA-RNA雜交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 3) 3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反應(yīng)，pH 6.8-7.4 4) 內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將DNA鍵切開，pH 7.6-8.5 第二十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.外切酶活性特點 1) 反應(yīng)底物：互補(bǔ)ds-DNA 2) 堿

20、基釋放速度：CA-TG 3) 反應(yīng)產(chǎn)物：5-單磷酸核苷和具缺口或5-端突起的ds-DNA，過度反應(yīng)將導(dǎo)致DNA降解 4.用途 1) 核酸（DNA）標(biāo)記 2) 基因突變-缺失 3) DNA序列測定時作順序缺失 5.使用注意事項 1) 正式使用前，測定在一定條件下酶的反應(yīng)速度 2) 在一定條件下，ExoIII不能作用GC富集區(qū)(來自于cDNA加尾)第二十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5P5P5P5P5P3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HOOH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P53HOP5OH3P5RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用第二十七張，

21、PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c 2 3 4 a b c 3 4 a b c 4 a b c a b cExoIII用于順序缺失 ExoIII ExoIII -32P -32P dCTP dCTP 5PP55PP53HOOH33HOOH3ExoIII用于DNA標(biāo)記第二十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二. 外切酶 1. 反應(yīng)特點 1) 作用底物: 要求5-PO4基; 不作用含切口的DNA分子 2) 作用方向與產(chǎn)物：5 3; 產(chǎn)生5-P核苷和3-突起

22、的ds-DNA 2. 用途：DNA定序測定; 除去5-端突起，產(chǎn)生3-端突起，便于加尾3 HO 3 HO 3 HO OH 3 OH 3 OH 3 5 P 5 P 5 P P 5 P 5 P 5 AAAAAAAAAAAATdT+dATP 第二十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三. 核酸酶Bal31 1. 一般特點：胞外酶；具DNase和 RNase 活性；由“快”和“慢”兩種成分構(gòu)成 2. 催化反應(yīng)特點 1) 底物：ss-DNA，ds-DNA，RNA(外切與內(nèi)切活性) 2) 作用方向與產(chǎn)物：5 3和3 5同時進(jìn)行，但反應(yīng)速度不同； 產(chǎn)生5-單磷酸核苷和縮短的ds-DNA 3.用途：

23、基因突變-缺失; 繪制限制酶譜; DNA定序(與ExoIII相同)，其優(yōu)點是Bal31酶活依賴于Ca+和Mg+，Ca+在反應(yīng)完畢后可用EGTA（乙二醇四乙酸）滅活而不影響Mg+濃度，后者是限制酶活性必需的 4.使用注意事項： 1) 應(yīng)作預(yù)備實驗，因每批酶制品的“快”“慢”酶含量不同 2) DNA兩條鏈堿基組成不同，終止反應(yīng)時存在單鏈突起，需要補(bǔ)平第三十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5PP53HOOH3核酸酶Bal31的活性第三十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月四. 核酸酶S1 1.一般特點：糖蛋白(含糖量8%)，最佳pH 4.5， 對熱穩(wěn)定，抗變性劑 2.催化反應(yīng)類型:

24、 ss-DNA; ss-RNA; 雙螺旋變性區(qū) 3.用途 1) 基因突變-缺失，常與外切酶，如ExoIII、外切酶、Bal31連用 2) DNA定序分析 3) S1作圖法 4) 基因結(jié)構(gòu)分析 5) tRNA結(jié)構(gòu)分析 4.使用注意事項 1) 避免長時間反應(yīng)，因最適酸性pH將導(dǎo)致DNA斷裂或降解 2) 避免使用高濃度酶量，以免DNA被降解(因產(chǎn)生切口)第三十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)555555核酸酶S1活性 第三十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 五. 綠豆核酸酶 1.與S1酶相同點：作用于ss-DNA

25、和RNA，對5-端的突起核苷酸作用速度為GCAT 2.與S1酶的不同點 最適pH接近中性，不會產(chǎn)生切口; 不使具切口的ds-DNA斷裂 3. 用途：與S1酶相同 六. 外切酶 作用于ss-DNA的3- 與5-端，產(chǎn)物為低聚核苷酸 除去單鏈DNA形成平整末端 七. 牛脾磷酸二酯酶 作用含5-羥基端的ss-DNA和RNA，產(chǎn)生3-單磷酸核苷 用于短鏈RNA和 DNA的定序分析第三十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 八. 蛇毒磷酸二酯酶 作用3-羥基單、雙鏈DNA和RNA，產(chǎn)生5-單磷酸核苷 用于RNA和DNA的定序分析表4 幾種常用外切酶的特點 外切酶 作用方向 作用底物 反應(yīng)產(chǎn)物 E

26、xoIII 35 dsDNA 單核苷酸 外切酶 53 ss和dsDNA 同上 Bal31 35和53 ss和dsDNA, RNA 同上 S1 35和53 ssRNA和ss DNA 低、核苷酸 綠豆核酸酶 35和53 ssRNA和ss DNA 同上 Exo VII 35和53 ssDNA 低聚核苷酸 牛脾磷酸二酯酶 53 ssRNA，ss DNA 同上 蛇毒磷酸二酯酶 35 ss，ds RNA和DNA 同上第三十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 九. RNase 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA分子。RNase的識別序列和特點見表5。 1.

27、RNase A分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（100加熱15min仍具活性）, 用于除去DNA樣品中的RNA分子 2. 核酸酶S7，亦稱微球菌核酸酶，對RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源mRNA 十. RNase H 作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去DNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。 第三十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 表5 核糖核酸酶反應(yīng)特點 核酸酶 特異性反應(yīng) 核酸酶 特異性反應(yīng) A Pyp/N PhyM Ap/N或 Up/N CL3 Cp/N, Ap/N和Cp/N B.cereus Cp/N, Up/N T1 Gp/N P

28、1 無特異性反應(yīng) T2 無特異性反應(yīng) S7 Np/A和 Np/U U2 Pup/N或Ap/N Phy1 Ap/N,Gp/N和Up/N第三十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 十一. DNase I 1. 特點：具內(nèi)切酶活性，作用于ds -DNA，但無核苷酸序列特異型，產(chǎn)生5-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活達(dá)最大值 當(dāng)酶濃度很低時，ds -DNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg 2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關(guān)Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置 2. 用途 1) 切口移位，制備DNA探針

29、2) 制備RNA樣品時除去DNA分子 3) 基因突變時產(chǎn)生切口 第三十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 Mn+存在時 Mg+存在時 DNaseI作用特點DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI與Pol I 的切口移位Pol I第三十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) DNA 聚 合 酶 第四十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 一 . E.coli DNA聚合酶I（polI） 1. E.coli 的DNA聚合酶系統(tǒng) Pol I 參與DNA修復(fù), 具35和53外切酶活性 pol II 同上 具35外切酶活性 pol III 參與DNA復(fù)制, 具35

30、和53外切酶活性 2. E.coli polI的特點 1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響（表6） 3） 外切酶活性 第四十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. 用途 1） 除去3-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時） 2） 補(bǔ)齊5-突起端 3） 合成第二條cDNA 4） 切口移位制備探針 其中用途2) 和3)常用大片段表6 E.coli DNA PolI

31、 的延續(xù)性 DNA模板-引物類型 反應(yīng)條件 延續(xù)性(堿基數(shù)) 切口 ColE1 37C, 低鹽 8 缺口 ColE1 37C, 低鹽 47 切口/缺口胸腺DNA 37C, 低鹽 24 poly d(AT) 37C, 低鹽 188 poly d(AT) 5C, 低鹽 14 poly d(AT) 5C, 高鹽 3第四十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 二. T4 DNA聚合酶 1. 特點： 53聚合酶活性，1500 nt/min, 為pol I的兩倍 35外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA, 其切除速度分別為40和 4000nt/min 2.用途： 制備高比活性探針(1010

32、 cpm/gDNA); DNA末端修飾-缺失5CAGCAACGT 3 dATP CAGCAACGT 3 S1 T 33GTCGTTGCA 5T4聚合酶 A 5 A 5 外切酶活性 聚合酶活性 無dNTP dNTP第四十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三. 反轉(zhuǎn)錄酶 1. AMV反轉(zhuǎn)錄酶 1） 結(jié)構(gòu)與酶活性 反轉(zhuǎn)錄酶以，形式存在，其中（無活性）P32（內(nèi)切酶活性）+聚合酶 + P24（RNase H活性），各步反應(yīng)由蛋白酶催化 2）聚合酶活性 a. RNA，DNA引物（大于8 nt）cDNA鏈 bDNA-RNA引物互補(bǔ)DNA鏈 c(rA)1100(dT)12-18(dT)n or (

33、rc)n.dG n(dG) n第四十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)和活性 P24 190 kD 160 kD 65 kD 24 kD P32 RNaseH 聚合酶 5 AAAAA3 引物 5 AAAAA 3 TTTTT 5 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 5 3 5 3 3 5 3 5 全長cDNA 提前終止反應(yīng) 第四十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 1) 特點： 不具內(nèi)切酶活性; RNase H活性低; 穩(wěn)定性差 2) 與AMV反轉(zhuǎn)錄酶比較 a合成短鏈cDNA(0.6 kb)時，兩者相同，但M- MLV反轉(zhuǎn)錄酶需要量大，可能與其穩(wěn)定性差有關(guān) b

34、合成長鏈cDNA(4.5-7.5 kb)時，它比AMV反轉(zhuǎn)錄酶有效得多，這與它無內(nèi)切酶活性有關(guān)。 3) 用途 a. cDNA合成用于文庫建立; b. 制備cDNA探針; c. DNA序列分析; d. 填補(bǔ)5-突起末端以獲平端第四十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月四. Taq DNA聚合酶 1. 特點： 分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75， 對95高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在35外切酶活性 2. 用途： 主要用于DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個DNA 分子因而可被擴(kuò)增4106倍 DNA擴(kuò)增技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它包括以下三個步驟：

35、DNA模板變性(95) 與DNA引物退火(45) 引物延伸(75) 第四十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Taq Pol 和PCR 5 3 變性 3 5 5 3 引物 3 5 復(fù)性 5 3 5 3 3 5 引物 3 5 5 3 延伸 5 3 3 5 3 5 第四十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 五. DNA定序酶 用基因工程方法去除35外切酶活性的Taq DNA聚合酶 六. Tth DNA聚合酶 93kD，75，含有二級結(jié)構(gòu)DNA分子的定序 七. Tli DNA聚合酶 100仍具酶活，35外切酶活性，85 kD DNA的切平反應(yīng)和補(bǔ)平反應(yīng) DNA聚合酶和核酸酶S1或綠

36、豆核酸酶連用, 可用于 DNA末端結(jié)構(gòu)的修飾第四十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 5AAGCTT3 HindIII 5A AGCTT3 3TTCGAA5 3TTCGA A5 S1 dNTP+ klenow frag 5A T3 5AAGCT AGCTT3 3T A5 3TTCGA TCGAA5 T4 DNA連接酶 T4 DNA連接酶 5AT3 5AAGCTAGCTT3 3TA5 3TTCGATCGAA5切平反應(yīng)和補(bǔ)平反應(yīng) 第五十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月四種不同補(bǔ)平反應(yīng)5-GGATCC-3 BamHI 5-G GATCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G

37、-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5 GG-5 AGG-5 TAGG-5 I S1 S1 S1 5-GG CC-3 5-GGA TCC-3 5-GGAT ATCC-3 3-CC GG-5 3-CCT AGG-5 3-CCTA TAGG-5 II III 第五十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第 五 節(jié) RNA 聚 合 酶 第五十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)

38、作于2022年6月 一. SP6 RNA聚合酶 1、特點： 依賴于DNA的RNA聚合酶，具SP6啟動子特異型 2、用途： 主要用于RNA分子的體外合成，RNA分子可用于： 1） RNA分子的拼接研究 2） 標(biāo)記的RNA常用于雜交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更穩(wěn)定，兩條鏈均可標(biāo)記，產(chǎn)生的RNA具高放射比活性 3） DNA的定序分析 4） 基因結(jié)構(gòu)的研究，其中包括內(nèi)含子數(shù)目，長度和位置 5） 還可以用于蛋白質(zhì)的合成研究第五十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA聚合酶活性 第五十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 二. T7 RNA聚合酶 特異性識別T7噬菌體基因啟動

39、子 三. T3 RNA聚合酶 特異性識別T3噬菌體基因啟動子 基因啟動子識別的特異性比較：SP6T7T3 四. E.coli RNA聚合酶五. 多聚核苷酸磷酸化酶 第五十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第 六 節(jié)連 接 酶 第五十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一. T4 DNA連接酶 1. 特點： 只連接ds -DNA分子，要求3-羥基和5-磷酸基 2. 用途： 1) 相同或相容粘性末端的連接 2) 平整末端的相連 DNA平端來源：限制酶作用結(jié)果; 限制酶與其它酶共同作用結(jié)果 。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多 3. 抑制劑： PO43-5mM ,

40、 NaCl25mM, Ca+0.1mM第五十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA TTCGAP 退火 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 或 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 T4 DNA連接酶 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 或 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA

41、 TTCGAA-5 T4 DNA連接酶的連接反應(yīng)(兩種插入方向) +第五十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二. E.coli DNA連接酶 只能連接具粘性末端DNA分子，以NAD作輔助因子三. T4 RNA連接酶參與單鏈RNA分子的連接。主要用于提高T4 DNA連接酶在連接反應(yīng)中的連接效率（20倍） HO P HO P HO P 5 3 5 3 5 3 RNA連接酶活性 第五十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第七節(jié) 核 酸 末 端 修 飾 酶第六十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 一. 細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP） 1.特點 1) 除去ss-DNA，ds-DNA

42、和RNA分子兩端的3-和5-磷酸基 2) 對熱穩(wěn)定 2. 用途 1) 載體DNA的去磷酸化，防止自我連接，以增加重組頻率 2) 核酸末端標(biāo)記 二. 牛小腸堿性磷酸酶（CIP） 與BAP相同，只是CIP對熱敏感第六十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO P 5 3 HO 32P 5 I II 5 P OH3 5HO OH3 5 P OH 3 3HO P 5 3HO OH5 3HO P 5 磷酸酶(I)與磷酸激酶(II)活性 磷酸激酶的交換反應(yīng)第六十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三. T4 多聚核苷酸激酶

43、1.催化反應(yīng)類型 1)激酶活性（5-磷酸化酶）：可將ATP中的位的磷酸基轉(zhuǎn)移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5-羥基端，在這反應(yīng)過程中可有兩種方式進(jìn)行（pH7.5-8） .轉(zhuǎn)移反應(yīng)； .交換反應(yīng) 2) 3-磷酸酶活性（pH 5-6） 2. 用途 1) 5-端末端標(biāo)記 2) 分子克隆過程中以獲得5-磷酸基末端，便于連接酶反應(yīng)第六十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 四. 末端轉(zhuǎn)移酶（TdT） 1.反應(yīng)特點 底物：dNTP及衍生物，3個核苷酸，要求3-OH端，需要ss-DNA作為引物，以3-突起端的ds-DNA 為最高，亦可用于ds-DNA加尾 2. 核苷酸摻入速度 二甲基砷酸

44、鹽緩沖液和Mg2+可提高嘌呤核苷酸的摻入速度，而Ca2+可提高嘧啶摻入速度 3. 用途 3-加尾，便于兩DNA分子重組; 3-末端標(biāo)記 第六十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月五. 多聚腺嘌呤聚合酶 該酶是在RNA分子的3-端（OH）加上一個多聚A的尾巴，其用途可標(biāo)記RNA和 加尾的RNA，可用于cDNA的合成六. 煙草酸性焦磷酸酶 可除去mRNA帽子結(jié)構(gòu)中的焦磷酸: m7Gp-p-p-Xp-Yp-mRNA p-Xp-Yp-mRNA七. 鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶 1.催化類型 RNA三磷酸酶: pppN(pN)n ppN(pN)n + Pi 鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶: -32PGTP + ppN(pN)n

45、G32pppN(pN)n + PPi RNA甲基轉(zhuǎn)移酶: AdoMet + G(5)pppN(pN)n m7G(5)pppN(pN)n + AdoHCy2. 用途：標(biāo)記DNA第六十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第八節(jié) 其 它 酶 類 第六十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.原生質(zhì)體的制備酶類 制備原生質(zhì)體目的：外源DNA導(dǎo)入；核酸和蛋白質(zhì)的提取 溶菌酶， zymolyase，glusulase，NovoZyme，溶壁酶，纖維素酶 2.蛋白質(zhì)降解酶類 蛋白酶K 3.檢測酶類 抗生蛋白鏈素-半乳糖苷酶, 堿性磷酸酶, 辣根過氧化物酶 第六十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月練 習(xí) 題第六十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 一種DNA分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結(jié)果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1、3、6kb 將各限制酶位點繪制在DNA分子上。2.另一DNA分子經(jīng)相同處理后得如下結(jié)果，將各限制酶位點標(biāo)在DNA分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、