基因重組工程ppt課件

1、第十七章 基因重組與基因工程 (genetic recombination and genetic engineering)基因重組 是指在體外用酶學(xué)方法將不同來(lái)源的DNA進(jìn)行切割、連接，組成一個(gè)新的DNA分子的過(guò)程，又稱DNA重組。基因克隆 將重組DNA分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其擴(kuò)增和繁殖，以獲得大量的同一DNA分子，稱此為基因克隆、DNA克隆或分子克隆?；蚬こ?實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法和相關(guān)工作，統(tǒng)稱為重組DNA技術(shù)或基因工程。 重要的工具酶 基因克隆常用的載體 重組DNA基本原理 重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥 工業(yè)中的應(yīng)用第一節(jié) 重要的工具酶工具酶 基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和

2、RNA分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。一、限制性核酸內(nèi)切酶(RE) 是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識(shí)別雙鏈DNA中的特定堿基序列、并水解該點(diǎn)磷酸二酯鍵 的核酸內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱限制酶或切割酶。 根據(jù)限制酶的作用特性，一般分為三類： 、和型， 其中常用的是型限制酶。 限制酶（型）識(shí)別及切割位點(diǎn) 特異識(shí)別及切割48個(gè)bp長(zhǎng)度且具有回文序列的DNA片斷，主要產(chǎn)生3種缺口： 5粘性末端 3粘性末端 平端或鈍端 回文序列 是指該部位的核苷酸序列呈180O旋轉(zhuǎn)對(duì)稱; 粘性末端 是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5末端突出或3末端突出的堿基序列相互具有互補(bǔ)性。 產(chǎn)生5-粘性末端 產(chǎn)生3-粘性末端 產(chǎn)生

3、平(頭末)端/鈍端其它特殊性質(zhì)的型限制酶同裂酶（異源同工酶）同尾酶可變酶同裂酶 又稱異源同工酶。指來(lái)源不同，但具有相同的識(shí)別序列。 在切割DNA時(shí)，其切割點(diǎn)可以是相同的，產(chǎn)生平頭末端，稱為同識(shí)同切； 切割點(diǎn)也可以是不同的，產(chǎn)生3或5粘性末端，稱為同識(shí)異切。 同裂酶同識(shí)同切同裂酶同識(shí)異切同 尾 酶 同尾酶 指來(lái)源不同，但識(shí)別與切割順序有一定的相關(guān)性的一類酶。它們作用后產(chǎn)生相同的粘性末端?？勺兠缚勺兠?識(shí)別順序中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的，并且識(shí)別順序往往超過(guò)6個(gè)堿基對(duì)。 如， Bstp，其識(shí)別順序?yàn)镚GTNACC。 常用限制性核酸內(nèi)切酶的特性微生物名稱酶名稱識(shí)別順序同裂酶同尾酶Bacillus a

4、myloliquefaciens H解淀粉芽孢桿菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢桿菌Bgl ACATCTEscherichia coli RY13大腸桿菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌Hind AAGCTTHsuProvidencia stuartii 164普羅威登細(xì)菌PstCTGCAGSalpStreptomyces albusSubspecies pathocidicus白色鏈球菌SalGTCGACAvaXho二、DNA聚合酶 （最常用的DNA聚合酶有以下4種） DNA聚合酶 DNA聚合酶大片

5、段Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌體DNA聚合酶 DNA聚合酶 E.Coli DNA聚合酶（DNA pol ） 是一個(gè)具有3 種酶活性的多功能性酶。包括： 53DNA 聚合酶活性 53核酸外切酶活性 35核酸外切酶活性 DNA pol 應(yīng)用 催化DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性DNA 探針； 第二條cDNA鏈的合成； 對(duì)DNA3突出末端進(jìn)行標(biāo)記； DNA序列分析。E. coli DNA pol. 催化切口平移 Klenow片段（DNA pol.大片斷） Klenow片段用途 補(bǔ)齊雙鏈DNA的 3末端； 用標(biāo)記堿基補(bǔ) 齊3末端 ； 在cDNA克隆中， 用于第二股鏈 的合成； D

6、NA序列分析。 Taq DNA pol（耐熱DNA聚合酶） 作用特點(diǎn)1） Taq DNA pol催化DNA合成的最適溫度范圍 70 75，2） 95以上高溫，半小時(shí)不失活， 3） 最適合用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。 第一課件網(wǎng)在線網(wǎng)站 三、逆轉(zhuǎn)錄酶 特點(diǎn) 逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下3種酶活性： 以單鏈RNA 為模板， 催化合成cDNA單鏈 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的 RNA 以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。 逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用： 將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)； 補(bǔ)平和標(biāo)記5-末端突出的DNA片段； 代替Klenow酶用于DNA序列分析

7、； 制備雜交探針等。四、DNA連接酶(DNA ligase) DNA連接酶可以 催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈DNA中一條鏈的3OH與另一條鏈的5PO3H2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構(gòu)成一條完整的DNA長(zhǎng)鏈。 DNA連接酶的用途（1） 兩個(gè)雙鏈DNA片段連接起來(lái)5- ACG AATTCGT-3 T4DNA連接酶 5-ACGAATTCGT-33- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2） 修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈DNA分子T4DNA連接酶五、堿性磷酸酶 堿性磷酸酶(BAP) 能夠催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基團(tuán)。用途 制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理去除載體分子 5端磷酸

8、基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提高重組效率。 用32P標(biāo)記5-端前，去除5-P，再通過(guò)激酶作用把放射性核苷酸加到5-端進(jìn)行標(biāo)記。六、末端 （脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶(TdT) 作用 將標(biāo)記或未標(biāo)記的dNTP加到DNA的3OH末端；也可催化載體分子或待克隆的DNA片斷上加上互補(bǔ)的同聚尾，便于進(jìn)一步連接。應(yīng)用 探針標(biāo)記 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接重要的工具酶工具酶 活性 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異序列，切割DNA T4 DNA連接酶 催化DNA5-磷酸與3-羥基 形成磷酸二酯鍵 DNA聚合酶 以DNA為模板合成D

9、NA 逆轉(zhuǎn)錄酶 以RNA為模板合成DNA 堿性磷酸酶 切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶 催化核酸5-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 催化3-端合成同聚體尾第二節(jié) 基因克隆常用的載體載體(vector) 是將外源DNA(目的DNA)片斷引入宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA 。 本節(jié)主要內(nèi)容 載體必須具備的基本條件 載體的種類 常用的載體一、載體必須具備的基本條件 有自身的復(fù)制子，能獨(dú)立復(fù)制 具備多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn)) 具有遺傳表型或篩選標(biāo)記 有足夠的容量以容納外源DNA片段。 表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng) 子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。 載體DNA中均有一段非必需區(qū)

10、，將外源基因插入 該非必需區(qū)，而載體本身不受影響。二、載體的種類*（一） 克隆載體 用來(lái)克隆和擴(kuò)增DNA片段的載體，具有3點(diǎn)共性： 能夠在受體細(xì)胞復(fù)制； 帶有藥物抗性基因，便于篩選； 可導(dǎo)入受體細(xì)胞。（二）表達(dá)載體 除具有克隆載體所具有的性質(zhì)外，還帶有表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須的DNA順序。三、常用的載體 （一） 質(zhì)粒 (plasmid)： 是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)： 1. 分子量相對(duì)較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)， 有較高的拷貝數(shù) 2. 具有1個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選 3. 具有多克隆位點(diǎn) 總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量較小、

11、高拷貝的“松弛型”質(zhì)粒，且具有一個(gè)以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒： pBR32質(zhì)粒、pUC系列等 pBR322質(zhì)粒 4363 bp 含一個(gè)復(fù)制點(diǎn)含一個(gè)抗氨卞青霉素標(biāo) 記(ampR) 一個(gè)抗四環(huán)素標(biāo)記 (tetR) ampR和tetR基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入 當(dāng)外原基因插入抗藥基因位點(diǎn)時(shí)，AmpRAmp敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS).pUC系列質(zhì)粒 由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；（1） 2674bp；（2） 有ampr和與M13噬菌體 相同的多克隆位點(diǎn)（MCS）（3）有一個(gè)來(lái)自大腸桿菌的LacZ操縱子的DNA片斷,

12、編碼半乳糖苷酶 (二)噬菌體 組成特點(diǎn)： 雙鏈線狀DNA分子， 全長(zhǎng)50kb， 含65個(gè)基因， 在其分子兩端各含有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點(diǎn)。 噬菌體感染細(xì)菌后的溶菌性生長(zhǎng)和溶源性生長(zhǎng) 溶菌性生長(zhǎng)（lytic pathway） 噬菌體感染細(xì)菌后，借助其2個(gè)COS位點(diǎn)互補(bǔ)成環(huán)，在宿主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來(lái)的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。 溶源性生長(zhǎng)(lysogenic pathway) 噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身DNA整合到細(xì)菌的染色體中去，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解 。THANK YOUSUCC

13、ESS7/26/202237可編輯 噬菌體兩種生長(zhǎng)途徑（示意圖） 第三節(jié) 重組DNA基本原理 （DNA重組基本程序包括下列過(guò)程） 分獲取目的基因和載體 接目的基因與載體的連接 轉(zhuǎn)重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 篩重組DNA的篩選與鑒定1、獲取 DNA重組基本過(guò)程2、重組3、轉(zhuǎn)化4、篩選5、克隆/s/blog_130027d700102x0b0.html/s/blog_130027d700102x0b5.html/s/blog_13002e7ab0102x4vo.html/s/blog_13002e7ab0102x4vp.html/s/blog_130027d700102x0hb.html/s/blog

14、_130027d700102x0hc.html/s/blog_13002e7ab0102x51a.html/s/blog_13002e7ab0102x51b.html/s/blog_130027d700102x0jf.html/s/blog_130027d700102x0jg.html/s/blog_130027d700102x0jh.html/s/blog_13002e7ab0102x52s.html/s/blog_13002e7ab0102x52u.html/s/blog_13002e7ab0102x52x.html/s/blog_130027d700102x0ke.html/s/blog

15、_130027d700102x0kf.html/s/blog_130027d700102x0kg.html/s/blog_13002e7ab0102x53y.html/s/blog_13002e7ab0102x53z.html/s/blog_13002e7ab0102x540.html/s/blog_130027d700102x0lo.html/s/blog_130027d700102x0lp.html/s/blog_130027d700102x0lq.html/s/blog_13002e7ab0102x550.html/s/blog_13002e7ab0102x551.html/s/blog

16、_13002e7ab0102x552.html/s/blog_130027d700102x0n5.html/s/blog_130027d700102x0n6.html/s/blog_130027d700102x0n7.html/s/blog_13002e7ab0102x55v.html/s/blog_13002e7ab0102x55w.html/s/blog_13002e7ab0102x55x.html/s/blog_130027d700102x0og.html/s/blog_130027d700102x0oh.html/s/blog_130027d700102x0oi.html/s/blog

17、_13002e7ab0102x574.html/s/blog_13002e7ab0102x575.html/s/blog_13002e7ab0102x576.html/s/blog_130027d700102x0q6.html/s/blog_130027d700102x0q7.html/s/blog_130027d700102x0q9.html/s/blog_13002e7ab0102x59s.html/s/blog_13002e7ab0102x59t.html/s/blog_13002e7ab0102x59u.html/s/blog_130027d700102x0ru.html/s/blog

18、_130027d700102x0rv.html/s/blog_130027d700102x0rw.html/s/blog_13002e7ab0102x5bf.html/s/blog_13002e7ab0102x5bg.html/s/blog_13002e7ab0102x5bh.html6、表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物分離純化/s/blog_130027d700102x0tu.html/s/blog_130027d700102x0tv.html/s/blog_130027d700102x0tw.html/s/blog_13002e7ab0102x5dh.html/s/blog_13002e7ab0102x5di

19、.html/s/blog_13002e7ab0102x5dj.html/s/blog_130027d700102x0vo.html/s/blog_130027d700102x0vp.html/s/blog_130027d700102x0vq.html/s/blog_13002e7ab0102x5fr.html/s/blog_13002e7ab0102x5ft.html/s/blog_13002e7ab0102x5fw.html/s/blog_130027d700102x0 xf.html/s/blog_130027d700102x0 xg.html/s/blog_130027d700102x0

20、 xh.html/s/blog_13002e7ab0102x5hx.html/s/blog_13002e7ab0102x5hy.html/s/blog_13002e7ab0102x5hz.html/s/blog_130027d700102x0zd.html/s/blog_130027d700102x0ze.html/s/blog_130027d700102x0zf.html/s/blog_13002e7ab0102x5ka.html/s/blog_13002e7ab0102x5kb.html/s/blog_13002e7ab0102x5kc.html/s/blog_130027d700102x

21、12u.html/s/blog_130027d700102x12w.html/s/blog_130027d700102x12x.html/s/blog_13002e7ab0102x5o0.html/s/blog_13002e7ab0102x5o1.html/s/blog_13002e7ab0102x5o2.html/s/blog_130027d700102x144.html/s/blog_130027d700102x145.html/s/blog_130027d700102x146.html/s/blog_13002e7ab0102x5pp.html/s/blog_13002e7ab0102x

22、5pq.html/s/blog_13002e7ab0102x5ps.html/s/blog_130027d700102x15k.html/s/blog_130027d700102x15l.html/s/blog_130027d700102x15m.html/s/blog_13002e7ab0102x5u3.html/s/blog_13002e7ab0102x5u4.html/s/blog_13002e7ab0102x5u6.html/s/blog_130027d700102x17i.html/s/blog_130027d700102x17j.html/s/blog_130027d700102x

23、17k.html一、目的基因的獲?。ǚ郑┠康幕?是指所要研究或應(yīng)用的基因，也是需要克隆或表達(dá)的基因。 目的基因來(lái)源 1） 制備基因組DNA 2） 制備cDNA 3） 聚合酶鏈反應(yīng) 4） 人工合成基因（一）制備基因組DNA（基因文庫(kù)）分離、純化基因組DNA 條件：溫和，在EDTA或SDS等存在下 RE 用蛋白酶K消化細(xì)胞、酚抽提大小不同酶切片段 片段分離：常用蔗糖梯度或電泳分離 分別與同樣RE消化的載體連接 常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體 DNA連接酶連接。 導(dǎo)入細(xì)胞 進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增。 篩選鑒定 用分子雜交、凝膠電泳 等方法鑒定。 （二）制備cDNA （cDNA文庫(kù)）（1）合成cDNA第一條

24、鏈 反應(yīng)體系只有mRNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、4種dNTP、引物。引物是與mRNA3端 polyA互補(bǔ)的寡聚dT（1218dT片段）（2）合成cDNA第二條鏈 RNase去掉模板mRNA（3）構(gòu)建cDNA文庫(kù)cDNA兩端加接頭或銜接頭接頭是人工合成的雙鏈寡核苷酸兩端平頭，含有限制酶切位點(diǎn)。銜接頭是另一種人工合成的雙鏈寡核苷酸一端平頭，另一端為粘性末端。cDNA與載體相連。導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆，這些菌體內(nèi)保存cDNA集合體便是cDNA文庫(kù)。（二）制備cDNA （cDNA文庫(kù)） 分離目的基因 的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA單鏈 水解去除mRNA， 合成cDNA雙鏈 水解回折處單鏈得到平端雙鏈cDNA導(dǎo)入宿主細(xì)

25、胞克隆,構(gòu)建cDNA文庫(kù)（三）聚合酶鏈反應(yīng)( PCR) 在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等條件下，體外經(jīng)94變性、54退火及72延伸3個(gè)步驟的反復(fù)多次循環(huán)（2530次），擴(kuò)增目的基因（見(jiàn)18章）。 （四）人工合成基因 引用DNA測(cè)序儀測(cè)出某一基因的堿基序列，或根據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸組成反推核苷酸序列，再用DNA合成儀通過(guò)化學(xué)合成原理合成目的基因。 一般先合成短片斷DNA，然后再拼接成長(zhǎng)片段。 二、 目的基因與載體的連接（接） （主要有以下4種連接方式） 1) 粘性末端連接 2） 平頭末端連接 3） 人工接頭法 4） 同源多聚尾連接法 （一） 粘性末端連接 將目的基因和載體用同一

26、種限制酶酶切，產(chǎn)生 相同粘性末端，再通過(guò)DNA連接酶作用將兩者連接起來(lái)，構(gòu)成重組DNA分子。 （二）平頭末端連接 某些限制酶只能將目的基因和載體DNA切割成平端，此時(shí)在T4DNA連接酶的作用下同樣能連接起來(lái)。（三） 人工接頭法 合成連接子與DNA平頭末端連接限制酶切割,產(chǎn)生粘性末端連接，構(gòu)建重組DNA。/s/blog_13002e7ab0102x5w1.html/s/blog_13002e7ab0102x5w2.html/s/blog_13002e7ab0102x5w3.html/s/blog_13002e7ab0102x5xm.html/s/blog_13002e7ab0102x5xn.ht

27、ml/s/blog_13002e7ab0102x5xo.html/s/blog_130027d700102x19g.html/s/blog_130027d700102x19h.html/s/blog_130027d700102x19i.html/s/blog_13002e7ab0102x5z6.html/s/blog_13002e7ab0102x5z7.html/s/blog_13002e7ab0102x5z8.html/s/blog_130027d700102x1am.html/s/blog_130027d700102x1an.html/s/blog_130027d700102x1ao.ht

28、ml/s/blog_13002e7ab0102x64g.html/s/blog_13002e7ab0102x64h.html/s/blog_13002e7ab0102x64i.html/s/blog_130027d700102x1de.html/s/blog_130027d700102x1df.html/s/blog_130027d700102x1dg.html/s/blog_13002e7ab0102x67d.html/s/blog_13002e7ab0102x67e.html/s/blog_13002e7ab0102x67f.html/s/blog_130027d700102x1ge.ht

29、ml/s/blog_130027d700102x1gf.html/s/blog_130027d700102x1gg.html/506029614.html/506029642.html/506029650.html/506029663.html/506029681.html/506029694.html/506032992.html/506033005.html/506033019.html/506033033.html（四）同源多聚尾連接法三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)） 無(wú)性繁殖 體外重組后的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，形成轉(zhuǎn)化子。然后隨受體細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，使重組DNA發(fā)生復(fù)制、擴(kuò)增，這一過(guò)程稱為

30、無(wú)性繁殖。克隆 從上述無(wú)性繁殖細(xì)胞中進(jìn)一步篩選出含目的DNA的重組體分子即為無(wú)性繁殖系或克隆。宿主細(xì)胞 進(jìn)行無(wú)性繁殖時(shí)所采用的受體細(xì)胞. 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)化 以質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程；轉(zhuǎn)染 以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程；轉(zhuǎn)導(dǎo) 以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。 感受態(tài)細(xì)胞 用特殊方法處理后，受體細(xì)胞才具備接受外源DNA的能力， 這種細(xì)胞稱感受態(tài)細(xì)胞。 感受態(tài)細(xì)胞有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。 四、重組DNA的篩選與鑒定（篩）（篩選含重組體的陽(yáng)性菌落，一般有下列幾種方法） 1） 平板篩選 2） 限制酶切圖譜篩選 3） PCR篩選重組體 4）

31、 原位雜交技術(shù)插入失活藍(lán)白篩選/506033049.html/506036439.html/506036465.html/506036527.html/506036566.html/506036577.html/506047173.html/506047181.html/506047193.html/506047212.html/506047221.html/506050712.html/506050732.html/506050739.html/506050744.html/506050751.html/506053356.html/506053383.html/506053400.html

32、/506053419.html/506053439.html/506057246.html/506057253.html/506057265.html/506057272.html/506057278.html/506060989.html/506061001.html/506061011.html/506061018.html/506061026.html/506064514.html/506064555.html/506064562.html/506064573.html/506064585.html/506068248.html/506068260.html/506068273.html

33、/506068290.html/506068295.html（一） 平板篩選 是指利用載體的遺傳性標(biāo)記直接篩選的方法。 如，具有抗藥性標(biāo)記的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)；未轉(zhuǎn)化的則不能生長(zhǎng)。 插入失活 當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。第一課件網(wǎng)在線網(wǎng)站 抗生素平板篩選（插入失活）（2）藍(lán)-白篩選 它是一種利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑的篩選方法，篩選含有編碼-半乳糖苷酶的基因。 載體：編碼-半乳糖 宿主： 編碼-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列 -互補(bǔ)細(xì)菌表達(dá)： -半乳糖苷酶活性蛋白

34、5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） 形成藍(lán)色菌落 當(dāng)在質(zhì)粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能與宿主-半乳糖苷酶的C端進(jìn)行-互補(bǔ)產(chǎn)生白色菌落。 （IPTG 存在下） 藍(lán)白篩選示意圖2. 限制性內(nèi)切酶圖譜鑒/506071552.html/506071591.html/506071601.html/506071603.html/506071611.html/506074656.html/506074672.html/506074702.html/506074716.html/506074731.html/506078207.html/506078224.html/506078232

35、.html/506078247.html/506078281.html/506081786.html/506081822.html/506081842.html/506081855.html/506081868.html/506085877.html/506085887.html/506085903.html/506085920.html/506085942.html/506090282.html/506090297.html/506090314.html/506090325.html/506090336.html/506093491.html/506093495.html/506093500

36、.html/506093511.html/506093515.html/506096258.html/506096266.html/506096297.html/506096324.html/506096361.html/506099652.html/506099683.html/506099695.html/506099713.html/506099729.html3. PCR篩選重組體 抽提少量重組DNAPCR擴(kuò)增電泳鑒定序列分析。4. 原位雜交技術(shù)/infoview12664430.html/infoview12664456.html/infoview12664559.html/info

37、view12665452.html/infoview12665471.html/infoview12665452.html/infoview12667935.html/infoview12667952.html/infoview12667998.html/infoview12670338.html/infoview12670349.html/infoview12670976.html/infoview12670984.html/infoview12671012.html/infoview12673185.html/infoview12673189.html/infoview12673200.h

38、tml/infoview12674409.html/infoview12674404.html/infoview12674409.html/infoview12675690.html/infoview12675694.html/infoview12675704.html/infoview12676492.html/infoview12676501.html/infoview12676504.html/infoview12678880.html/infoview12678907.html/infoview12678933.html/infoview12680265.html/infoview12

39、680296.html/infoview12680374.html/infoview12681789.html/infoview12681755.html/infoview12681789.html/infoview12682866.html/infoview12682881.html/infoview12682889.html/infoview12685020.html/infoview12685052.html/infoview12685060.html/infoview12686483.html/infoview12686514.html/infoview12686539.html/in

40、foview12687665.html/infoview12687678.html/infoview12687689.html/infoview12689108.html/infoview12689126.html/infoview12689148.html/infoview12690570.html/infoview12690586.html/infoview12690606.html/infoview12691264.html/infoview12691283.html 五、重組體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控 基因工程的最終目的是通過(guò)載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價(jià)值的

41、蛋白質(zhì)產(chǎn)品。 克隆基因表達(dá)有三個(gè)條件 基因的編碼區(qū)不能被插入序列所中斷; 基因轉(zhuǎn)錄要有啟動(dòng)子，而啟動(dòng)子必須能被宿主 細(xì)胞的RNA聚合酶有效地識(shí)別; mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外 源蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解。第四節(jié) 重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn) 1990年美國(guó)科學(xué)家首先啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃（HGP），計(jì)劃歷時(shí)15年，至2005年完成； 2001年2月12日由Since和Nature雜志同時(shí)向世界宣布，人類基因組3X109bp的最新圖譜，約含34萬(wàn)個(gè)基因； 整個(gè)人類基因組的全部核苷酸序列不久即將完成。但要揭示人類4萬(wàn)個(gè)基因功能的任務(wù)將更為艱巨。 人類基因組圖譜的初步完成，不僅為全部基因的定位建立了一個(gè)開(kāi)放框架，而且為分離、鑒定人類疾病相關(guān)基因提供了參照模板。 如，已知人類遺傳性疾病約有3000種，推測(cè)可能是由于某些基因結(jié)構(gòu)異?；蚧蛭灰频韧蛔兯?。如果利用分子生物學(xué)技術(shù)，將患者疾病基因與正?；驁D譜作對(duì)照分析，必將有助于闡明遺傳病的分子機(jī)制，這對(duì)遺傳病的基因治療將起到不可估量的推動(dòng)作用