AFB1高效液相測定法衍生和未衍生的比較

1、HPLC柱前衍生法分析黃曲霉毒素B1黃曲霉毒素（AFT）對有機體具有致突、致癌、致畸性，被列為可能的人體致癌物質(zhì)。黃曲霉毒素在多種人類食物中被發(fā)現(xiàn)，如玉米、堅果、花生等等，以Bl、B2、Gl、G2的形式存在。AFTB1在動物體內(nèi)可轉(zhuǎn)變成兩種主要代謝產(chǎn)物-AFTM1和AFTQ,前者的毒性和致癌性與AFTB1相近，主要存在于動物的尿和乳汁中。黃曲霉毒素可使用正相和反相液相色譜法分離，反相色譜法操作較容易、流動相毒性也較低，被廣泛采用。使用反相液相色譜檢測時，可通過柱前衍生法或柱后衍生法，提高AFTB1、AFTG1的檢測靈敏度，使之與AFTB2、AFTG2在相近水平下檢測。柱前衍生法無需專用柱后衍生

2、反應(yīng)系統(tǒng)，方法簡單。本方法通過三氟乙酸（TFA）柱前衍生，HPLC檢測黃曲霉毒素B1。該方法可用于4種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2同時檢測，也可用于AFTM1檢測。樣品前處理取50pL黃曲霉毒素B1標(biāo)樣溶液（10ng/mL,溶劑苯-乙腈溶液（98:2v/v）,用氮氣吹干,加入200L正己烷和100L三氟乙酸，混勻1min，室溫下放置10min,氮氣吹干，用乙腈水溶液（乙腈/水85：15v/v）50L重新溶解，混勻30s，經(jīng)0.45m濾膜過濾，供液相色譜儀檢測用。LC分析條件儀器：ShimadzuLC-20A液相色譜系統(tǒng)（含LC-20AT二元泵、CTO-20A柱溫箱，RF-10AXL熒光檢測

3、器，LCsolution色譜工作站）色譜分析條件流動相：甲醇：乙腈:水=1:3:6流速:1.0mL/min色譜柱：Shim-packGVP-ODS（4.6mm*10mm）；Shim-packVP-ODS（4.6mm*150mm,5m）激發(fā)波長365nm發(fā)射波長425nm柱溫：40C進樣量：10L分析結(jié)果黃曲霉毒素B1（AFTB1）標(biāo)樣色譜圖及分析結(jié)果表1黃曲霉毒素B1分析結(jié)果標(biāo)樣濃度保留時間化合物(ng/mL)(min)峰面積峰高AFTB1衍生103.36832924637098AFTB1未衍生106.721126851024結(jié)論三氟乙酸柱前衍生法可用于AFTB1檢測，增強其熒光強度，提高檢測

4、靈敏度。通過以上實驗檢測AFTB1標(biāo)樣（10ng/mL），未經(jīng)衍生標(biāo)液的信噪比為42，衍生后信噪比提高至S/N=1434。圖1衍生后AFB1標(biāo)樣色譜圖2未衍生AFTBI標(biāo)樣色譜圖HPLC柱前衍生化法檢測中草藥中的黃曲霉毒素來源：醫(yī)學(xué)論文網(wǎng)- HYPERLINK 0引言黃曲霉毒素主要是由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素的衍生物1。黃曲霉毒素具有致癌性、致突變性及致畸性，可引起肝細胞變性、壞死2。隨著黃曲霉毒素限量的日益嚴格，對檢測方法在靈敏度、定量準(zhǔn)確度和自動化方面提出了新的要求。目前國際上測定

5、黃曲霉毒素常見的方法有生物鑒定法、薄層層析法(TLC)、酶聯(lián)免疫分析法、高效液相色譜法。生物鑒定法主要用于定性，方法專一性差，靈敏度低，一般只作為化學(xué)分析法的佐證；薄層色譜法操作繁瑣、污染大科技成果轉(zhuǎn)化、定量差、耗時長；而酶聯(lián)免疫法雖然操作簡單、靈敏度高，但特異性差，一般只能達到篩選的目的，不能作為常規(guī)定量檢測用3；熒光強度的目測精確性較差，特異性不強和安全性能較差，主要是半定量；高效液相色譜法(HPLC)的靈敏度高、分離能力強、特異性好、測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠4。因此建立一種利用高效液相色譜來分析中草藥提取物中黃曲霉毒素的方法,是十分必要的5。1材料和方法1.1材料1.1.1試劑水為三蒸水，甲醇(

6、色譜純，SKchemicals公司)，三氟乙酸(色譜純，天津市光復(fù)精細化工研究所)，乙腈(色譜純,MERCK公司)，正己烷(色譜純，Brudick&Jackson公司)。黃曲霉毒素B1(3pg/ml),B2(3pg/ml),G1(3pg/ml),G2(3pg/ml)(Sigma公司)1.1.2器材和儀器Waters1525高效液相色譜儀，Waters2475熒光檢測器；HYA-II恒溫搖床(中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠)；渦旋混合器(MS2Minishaker)；免疫親和柱(LCTechGmbHAflaCLEANTM)；超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ-500；DHG-9070A星電熱

7、恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；石英自動雙重純水蒸餾器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)1.1.3色譜條件色譜柱：SymmetryC18，5pm，4.6mmX250mm；流動相：乙腈，水；流速:1ml/min；熒光檢測器：激發(fā)波長入ex360nm;發(fā)射波長入em440nm；進樣量：20pl,洗脫條件見5。1.1.4標(biāo)準(zhǔn)液配制黃曲霉毒素混標(biāo)品的配制：吸取購買獲得的黃曲霉毒素對照品，用苯：乙腈(98:2)稀釋為巾g/ml作為儲備液。4C冰箱備用。移去黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液各100pl分別稀釋2倍(0.5pg/ml)，4倍(0.25pg/ml)，8倍(0.125pg/ml)，80倍(0.01

8、25g/ml)，800倍(0.00125g/ml)。1.1.5溶劑配制5mmol磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH7.2)配制1）稱取50.14gNa2HP04.12H20溶解于700ml水中。2）稱取9.66gNaH2P04.1H20溶解于350ml水中。3）將上述兩種溶液進行混合并加入42.5gNaCl,配制成pH7.25mmol磷酸鹽緩沖溶液1mmol磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（pH7.2）配制取200ml的5mmol磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）稀釋于800ml水中。4）磷酸鹽緩沖溶液（PBS）/吐溫（Tween-20）配制：取8ml吐溫-20稀釋于92mlpH7.2磷酸鹽緩沖溶液中1.2材料

9、1.2.1樣品提取精密稱取藥材粉末10g，加入甲醇-水（8:2）100ml和50ml正己烷，高速攪拌3小時，提取液靜置分層，收集下層溶液備用6。取7ml濾液加入43mlPBS/Tween-20溶液稀釋。1.2.2免疫親和柱凈化取50ml稀釋后的提取液上AflaCLEANTM柱。在凈化過程中可對柱子進行抽真空和加壓；但必須保證過柱流速不大于2ml/min。用10ml蒸餾水清洗柱子，抽真空除去柱子中的殘余的水，每次用1ml甲醇洗脫柱子，洗3次。第一次加入的甲醇需要保持5min時間，洗脫柱子，收集洗脫液。1.2.3樣品衍生化處理洗脫液經(jīng)緩和氮氣吹干，加入300pl（正己烷：三氟乙酸=2:1），渦旋混

10、合器混勻30秒，室溫下衍生15min，衍生液經(jīng)緩和氮氣吹干后，用200pl乙腈-水（20-80）溶液溶解，渦旋混合器混勻30秒，樣品經(jīng)0.22pml濾膜過濾后備用7。1.2.4樣品測定精密吸取上述衍生化的供試品溶液20pl進樣分析，外標(biāo)法計算結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1方法學(xué)考察2.1.1最低檢出限根據(jù)信噪比S/N23為該物質(zhì)的最低檢出限，G1最低檢測濃度0.13ug/kg，B1最低檢測濃度0.32ug/kg，G2最低檢測濃度0.32ug/kg，B2最低檢測濃度0.13ug/kg。2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線將黃曲霉毒素各標(biāo)準(zhǔn)品（不同濃度）分別進樣20pl,獲得的色譜峰峰面積對黃曲霉素的絕對量作回歸，得到以

11、下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.1.3日內(nèi)精密度實驗將衍生化后的對照品溶液每隔一個小時進樣1次，連續(xù)進樣6次，每次進樣20pl7。以衍生化生成的化合物的峰面積值進行計算，結(jié)果黃曲霉毒素G1,B1,G2,B2的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為5.0%，9.2%，4.3%,1.9%。2.1.4日間精密度實驗將衍生化后的對照品溶液每天進樣1次，連續(xù)進樣6天，每次進樣20pl7。以衍生化生成的化合物的峰面積值進行計算，結(jié)果黃曲霉毒素G1,B1,G2,B2的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為9.0%，5.9%，3.5%，7.0%。2.1.5回收率實驗本實驗采用人參藥材做回收率實驗8。本實驗添加標(biāo)準(zhǔn)品B1的濃度為0.6ug/ml

12、，B2的濃度為0.6ug/ml，G1的濃度為0.6ug/ml，G2的濃度為0.6ug/ml。樣品制備：精密稱取人參藥材粉末10.000g，添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加甲醇水溶液高速攪拌提取，余下操作同樣品中檢測黃曲霉素含量的操作相同。重復(fù)六次。2.2樣品測定運用此方法選取以下藥材進行黃曲霉毒素含量測定，結(jié)果見。3結(jié)論本文采用高效液相色譜法測定中草藥中的黃曲霉毒素，不僅克服了酶聯(lián)免疫分析法中易出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，同時也克服了薄層層析法的繁瑣步驟及對測定結(jié)果的干擾。該方法對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的中草藥及其提取物中黃曲霉毒素的測定，樣品的前處理、凈化、衍生是實驗成功的關(guān)鍵1。在樣品的前處理過程中，對過免疫親和柱

13、的樣品溶液pH值有特殊的要求，樣品溶液pH過高或過低，都會造成樣品中黃曲霉毒素的損失。樣品在氮氣吹干過程中，要求氮氣和緩，衍生化前樣品液體必須徹底干燥，否則，雜質(zhì)較多，影響樣品峰的分離，產(chǎn)生較多的雜峰；進行氮氣吹干時，如果干燥時間太長，會造成樣品中黃曲霉毒素損失，也會影響檢測結(jié)果。該方法簡單，靈敏度高，特異性強，加標(biāo)回收率好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠8，適合連續(xù)處理大量樣品。中國醫(yī)學(xué)論文網(wǎng)專業(yè)提供醫(yī)學(xué)論文發(fā)表服務(wù)，并提供大量中藥學(xué)論文，如有業(yè)務(wù)需求請咨詢網(wǎng)站客服人員！參考文獻(References)田隨安，張焱，翟志雷.食品中的黃曲霉毒素(B1B2G1G2)HPLC法測定探討J.醫(yī)藥論壇雜志，200&29

14、(12):28-29.馮靚，蔡增軒，譚瑩，等.HPLC同時測定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2J.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17(3):511-513乙小娟、劉麗萍，酶聯(lián)免疫法檢測可可豆中的黃曲霉毒素J.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志，2000,16(4):38-39何暉,張琳.高效液相色譜法測定飼料中的黃曲霉毒素J.福建畜牧獸醫(yī)，2009,31(2):23-24付成平，歐陽華學(xué)，劉瑜柱前衍生化高效液相色譜法測定中草藥提取物中的黃曲霉毒素B1J.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009,22(2):522-524.HiroshiAkiyama,YukihiroGoda.DeterminationofaflatoxinsB1,B2,G1andG2inspicesusingamultifunctionalcolumnclean-upJ.JournalofChromatographyA,2001(932):153-157.張雪輝，陳建民.免疫親合柱凈化HPLC柱后溴衍生化方法檢測中藥中黃曲霉毒素J.中國中藥