2021年《化妝品微生物標準檢驗方法》

1、*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07、總則歐陽光明(2021.03.07)GeneralPrinciple1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學檢驗總則。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存、供檢樣品制備。儀器和設備天平。高壓滅菌器。振蕩器。三角瓶。玻璃珠。玻璃棒?？潭任堋Ｑ欣?。均質器。恒溫水浴箱。2.11采樣用具：不銹鋼勺，剪刀，開罐器等。培養(yǎng)基和試劑生理鹽水成分：氯化鈉8.5g蒸餾水加至1000mL溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶內，每瓶90mL，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌。SCDLP液體培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z成分：酪蛋白胨17g

2、大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐溫807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調pH為7.2一7.3,分裝，103.43kPa(151b)20min高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25U左右使用。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨,也可用多胨代替。滅菌液體石蠟。*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07滅菌吐溫80。樣品的采集及注意事項所采集的樣品，應具有代表性，一般視每批化妝品數量大小，隨機抽取相應數量的包裝單位。檢驗時，應分別從兩個包裝單位以上的樣品中共取10g或10mL。包裝量小于20g

3、的樣品，采樣量應適量增加，其總量應大于16g。供檢驗樣品，應嚴格保持原有的包裝狀態(tài)，進口產品應為市售包裝。容器不應有破裂，在檢驗前不得打開，防止樣品被污染。接到樣品后，應立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求盡快檢驗。如不能及時檢驗，樣品應放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。若只有一份樣品而同時需做多種分析，如微生物、毒理、化學等，應先做微生物檢驗，再將剩余樣品做其它分析。在檢驗過程中，從打開包裝到全部檢驗操作結束，均須防止微生物的再污染和擴散，所用采樣用具、器皿及材料均應事先滅菌，全部操作應在無菌室內進行，或在相應條件下，按無菌操作規(guī)定進行。供檢樣品的制備液體樣品水溶性的液體樣品，量取10mL

4、加到90mL滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1:10檢液。5.1.2油性液體樣品，取樣品10mL，先加_mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80，在40C44C水浴中振蕩混合10min,加入滅菌的生理鹽水75mL（在40C44C水浴中預溫），在40C44C水浴中乳化，制成1:10的懸液。膏、霜、乳劑半固體狀樣品5.2.1親水性的樣品，稱取10g,加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。取其上清液作為1:10的檢液。5.2.2疏水性樣品，稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10mL滅菌液體石蠟,研磨成粘稠狀,再加入10mL滅菌吐溫80,研磨待溶解后，加70m

5、L滅菌生理鹽水，在40C44C水浴中充分混合，制成1:10檢液。5.3固體樣品，稱取10g,加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻,使其分散混懸,靜置后,取上清液作為1:10的檢液。如有均質器,上述水溶性膏、霜、粉劑等,可稱10g樣品加入90mL滅菌生理鹽水，均質1min2min;疏水性膏、霜及眉筆、口紅等,稱10g樣品,加10mL滅菌液體石蠟,10mL滅菌吐溫80,70mL滅菌生理鹽水，均質3min5min。二、菌落總數AerobicBacterialCount范圍*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數的檢驗方法。本規(guī)范適用于化妝品菌落總數的測定。定義本規(guī)范采用下

6、列定義菌落總數(aerobicbacterialcount)是指化妝品檢樣經過處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH值、需氧性質等)，lg(lmL)檢樣中所含菌落的總數。所得結果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長的嗜中溫的需氧性菌落總數。測定菌落總數便于判明樣品被細菌污染的程度，是對樣品進行衛(wèi)生學總評價的綜合依據。儀器和設備三角瓶。量筒。pH計或精密pH試紙。高壓滅茵器。試管。平皿：直徑9cm?？潭任埽?0mL、2mL、1mL。酒精燈。恒溫培養(yǎng)箱。放大鏡。培養(yǎng)基和試劑生理鹽水：見總則中3.1。卵磷脂、吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z成分：蛋白胨20g牛

7、肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分(除瓊脂外)加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調pH值為7.1一7.4,加入瓊脂，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌，儲存于冷暗處備用。0.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenylterazoliumchloride,TTC)成分：TTC0.5g蒸餾水100mL溶解后過濾,103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌,裝于棕色試劑瓶，置4C冰箱備用。操作步驟5.1用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL,分

8、別注入到兩個滅菌平*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07皿內，每皿ImL。另取ImL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻，制成1:100檢液。吸取2mL,分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿ImL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000,1:10000,等，每種稀釋度應換支吸管。5.2將融化并冷至45C50C的卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內，每皿約15mL，隨即轉動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置37C培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48h。另取一個不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,待瓊脂凝固后,翻轉平皿,

9、置37C培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48h,為空白對照。5.3為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有細菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色,而化妝品的顆粒顏色無變化。菌落計數方法先用肉眼觀察，點數菌落數，然后再用放大5一10倍的放大鏡檢查,以防遺漏。記下各平皿的菌落數后,求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數。若平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時,該平皿不宜計數。若片狀菌落不到平皿中的一半,而其余一半中菌落數分布又很均勻,則可將此半個平皿菌落計數后乘以2,以代表全皿菌落數。菌落計數及報告方法7.1首先選取平均菌落數在30一300個之間的平皿，作

10、為菌落總數測定的范圍。當只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時,即以該平皿菌落數乘其稀釋倍數（見表1中例1）。7.2若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在30一300個之間，則應求出兩菌落總數之比值來決定,若其比值小于或等于2,應報告其平均數,若大于2則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數（見表1中例及例3）。若所有稀釋度的平均菌落數均大于300個,則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中例4）。若所有稀釋度的平均菌落數均小于30個,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1例5）。7.5若所有稀釋度的平均菌落數均不在30一300個之間，其中一個稀釋度大于300個,而相鄰的另

11、一稀釋度小于30個時,則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中例6）。若所有的稀釋度均無菌生長,報告數為每g或每mL小于10CFU。菌落計數的報告,菌落數在10以內時,按實有數值報告之,大于100時,采用二位有效數字,在二位有效數字后面的數值,應以四舍五入法計算。為了縮短數字后面零的個數,可用10的指數來表示（見表1報告方式欄）。在報告菌落數為“不可計”時,應注明樣*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07品的稀釋度。表1菌落計數結果及報告方式例次不同稀釋度平均菌落數兩稀釋

12、度菌數之比菌落總數CFU/mL或CFU/g扌報告方式CFU/mL或CFU/g10-110-210-311365164201640016000或1.6x10422760295461.63800038000或3.8x10432890271602.22710027000或2.7x1044不可計4650513513000510000或5.1x105527115270270或2.7x1026不可計305123050031000或3.1x1047000VIx10V10火CFU:菌落形成單位。三、糞大腸菌群FecalColiforms1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗方法。本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸

13、菌群的檢驗。2定義本規(guī)范采用下列定義糞大腸菌群(Fecalcoliforms)系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5培養(yǎng)24h48h能發(fā)酵乳糖產酸并產氣。該菌來自人和溫血動物糞便，是重要的衛(wèi)生指示菌。儀器3.1恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44C0.5C。溫度計。顯微鏡。載玻片。接種環(huán)。電爐。三角瓶。試管。小倒管。3.10pH計或pH試紙。高壓滅茵器。刻度吸管：10mL、2mL、1mL。平皿。培養(yǎng)基和試劑雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z成分：蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g0.4%溴甲酚紫水溶液5mL*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.0

14、7*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解于蒸餾水中，調pH到7.4，加入0.4%溴甲酚紫水溶液5mL，混勻，分裝試管(每支試管中加一個小倒管)。68.95kPa(10lb)20min滅菌。4.2伊紅美蘭(EMB)瓊脂TOC o 1-5 h z成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2%伊紅水溶液20mL0.5%美藍水溶液13mL蒸餾水1000mL制法：先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀、蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補足至1000mL。校正pH值為7.2一7.4,分裝于三角瓶內，103.43kPa(15lb

15、)15min高壓滅菌備用。臨用時加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60C左右無菌操作加入滅菌的伊紅美藍溶液，搖勻。傾注平皿備用。蛋白胨水(作靛基質試驗用)成分：蛋白胨(或胰蛋白胨)20g氯化鈉5g蒸餾水1000mL制法：將上述成分加熱融化，調pH值為7.07.2，分裝小試管，103.43kPa(15lb)15min高壓滅菌。靛基質試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。試驗方法：接種細菌于蛋白胨水中，于440.5C培養(yǎng)24h。沿管壁加柯凡克試劑0.30.5mL，輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白胨應含有豐富的色氨酸,每批蛋白胨買來后,應先用

16、已知菌種鑒定后方可使用。革蘭氏染色液：染液制備結晶紫染色液：TOC o 1-5 h z結晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液80mL將結晶紫溶于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液：碘1g碘化鉀2g*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07蒸餾水加至300mL將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。脫色液：95%乙醇。復染液：a.沙黃復染液：TOC o 1-5 h z沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。b.稀石碳酸復紅液：稱取堿性復紅10g，研細，加95%乙醇lOOmL，放置過夜，濾紙過濾。取該

17、液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復紅液。再取此液10mL加水90mL，即為稀石碳酸復紅液。染色法4.521將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染lmin，水洗。4.522滴加革蘭氏碘液，作用1min,水洗。4.523滴加95%乙醇脫色，約30s，或將乙醇滴滿整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s,水洗。4.5.2.4滴加復染液，復染1min,水洗，待干，鏡檢。染色結果革蘭氏陽性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1:10稀釋石碳酸復紅染色液作復染,復染時間僅需10s。操作步驟5.1取10mL1:10稀釋的檢液，加到10mL雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置4

18、4C0.5C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h，如不產酸也不產氣，則報告為糞大腸菌群陰性。5.2如產酸產氣，劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置37C培養(yǎng)18h24h。同時取該培養(yǎng)液12滴接種到蛋白胨水中，置44C0.5C培養(yǎng)24h。經培養(yǎng)后,在上述平板上觀察有無典型菌落生長。糞大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色,圓形,邊緣整齊,表面光滑濕潤,常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色,不帶或略帶金屬光澤,或粉紫色,中心較深的菌落,亦常為糞大腸菌群,應注意挑選。挑取上述可疑菌落,涂片作革蘭氏染色鏡檢。5.4在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質試劑約0.5mL，觀察靛基質反應。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應液面

19、呈試劑本色。檢驗結果報告根據發(fā)酵乳糖產酸產氣,平板上有典型菌落,并經證實為革蘭氏陰性短桿菌,靛基質試驗陽性,則可報告被檢樣品中檢出糞大腸*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07菌群。四、綠膿桿菌PseudomonasAeruginosa1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中綠膿桿菌的檢驗方法。本規(guī)范適用于化妝品中綠膿桿菌的檢驗。2定義本規(guī)范采用下列定義。綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42C條件下能生長。該菌對人有致病力，可使傷處化膿，引起敗血癥等。3儀器3.13.23.33.43.5

20、3.63.73.83.9恒溫培養(yǎng)箱：37C、42C。三角瓶。小、八試管。平皿?？潭任埽?0mL、2mL、1mL。顯微鏡。載玻片。接種針、接種環(huán)。電爐。高壓滅茵器。培養(yǎng)基和試劑SCDLP液體培養(yǎng)基見總則中3.2。十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g十六烷基三甲基溴化銨0.3g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調pH為7.47.6,加入瓊脂，68.95kPa(10lb)20min滅菌后，制成平板備用。乙酰胺培養(yǎng)基成分：乙酰胺10g氯化鈉5g無水磷酸氫二鉀1.39g無水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂(MgSO47H2O)0.5g酚紅0.01

21、2g(1.2%溶液1mL)*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂和酚紅外，將其它成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌后，制成平板備用。綠膿菌素測定用培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油(化學純)10g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使其溶解，調pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內，68.95kPa(10lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆?。明膠培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨5g明膠120g蒸餾水1000mL

22、制法：取各成分加到蒸餾水中浸泡20min,隨時攪拌加溫使之溶解，調pH至7.4，分裝于試管內，經68.95kPa(10lb)20min滅菌后,直立制成高層備用。硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0.5g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中,加熱使之溶解,調pH為7.2,煮沸過濾后補足液量,加入硝酸鉀和亞硝酸鈉,溶解混勻,分裝到加有小倒管的試管中,68.95kPa(10lb)20min滅菌后備用。普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調pH為7.27.4,加

23、入瓊脂,加熱溶解,分裝試管,103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌后,制成斜面?zhèn)溆谩?歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07操作步驟增菌培養(yǎng)：取1:10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37C培養(yǎng)18h24h。如有綠膿桿菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍綠色。分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷基三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37C培養(yǎng)18h24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴散有水溶性色素，此培養(yǎng)基選擇性強，大腸艾希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。在

24、缺乏十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基時也可用乙酰胺培養(yǎng)基進行分離，將菌液劃線接種于平板上，放37C培養(yǎng)24h,綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其它菌不生長。染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加滴新配制的1%二甲基對苯二胺試液，在15s30s之內，出現粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗陰性。綠膿菌素試驗：取可疑菌落23個，分別接種在綠膿菌素測定培養(yǎng)基上，置37C培養(yǎng)24h,加

25、入氯仿3mL5mL，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內，待氯仿提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移到另試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。硝酸鹽還原產氣試驗：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37C培養(yǎng)24h，觀察結果。凡在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基內的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。明膠液化試驗，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內，置37C培養(yǎng)24h,取出放冰箱10min30min,如仍呈溶解狀時即為明膠液化試驗陽性

26、；如凝固不溶者為陰性。42C生長試驗：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在4142C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h48h，綠膿桿菌能生長,為陽性,而近似的熒光假單胞菌則不能生長。檢驗結果報告被檢樣品經增菌分離培養(yǎng)后,在分離平板上有典型或可疑菌落生長,經證實為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者,即可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌；如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42C生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07五、金黃色葡萄球菌StaphylococcusAureus1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中金黃金色葡萄球菌的檢

27、驗方法。本規(guī)范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗。2定義本規(guī)范采用下列定義金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。該菌是葡萄球菌中對人類致病力最強的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴重時可導致敗血癥。3.13.23.33.43.53.63.7儀器和設備顯微鏡。恒溫培養(yǎng)箱。離心機?？潭任埽?mL、5mL、10mL。小、八試管。載玻片。酒精燈。培養(yǎng)基和試劑SCDLP液體培養(yǎng)基見總則中3.2。BairdParker氏培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰(LiC

28、l6H2O)5g瓊脂20g蒸餾水950mLpH7.00.2增菌劑的配制：30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內。制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，校正pH。分裝每瓶95mL，103.43kPa高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂培養(yǎng)基，每95mL加入預熱至50C的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL,搖勻后制成平板。培養(yǎng)基應是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h。血瓊脂培養(yǎng)基成分：營養(yǎng)瓊脂100mL脫纖維羊血(或兔血)10mL*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07制法：將營養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至50C左右無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平板，置冰

29、箱內備用。甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨10gTOC o 1-5 h z氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍溶液12mL蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調PH7.4，加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kPa(101b)20min滅菌備用。兔(人)血漿制備取3.8%檸檬酸鈉溶液，103.43kPa(15lb)30min高壓滅菌，1份加兔(人)全血4份，混勻靜置；2000rpm3000rpm離心3min5min。血球下沉，取上面血漿。無菌液體石蠟。操作步驟5.1增菌：取1:10稀釋的樣品10mL接種到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，

30、置37C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。5.2分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取12接種環(huán)，劃線接種在BairdParker平板，如無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置37C培養(yǎng)24h48h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdParker平板上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑為2mm3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置37C培養(yǎng)24h。染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌

31、為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5卩mlym。甘露醇發(fā)酵試驗：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入2mm3mm的滅菌液體石蠟，置37C培養(yǎng)24h，金黃色葡萄球菌應能發(fā)酵甘露醇產酸。5.5血漿凝固酶試驗：吸取1:4新鮮血漿0.5mL，放入滅菌小試管中，加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL?；靹颍?7C恒溫箱或恒溫水浴中，每半小時觀察一次，6h之內如呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5mL，分別加入滅菌1:4血漿0.5mL，混勻，作為對照。檢驗結果報告經增菌培養(yǎng)后，在分離平板上有典型或可疑菌落生長，經染色鏡*歐陽光明*創(chuàng)編2021