高效液相色譜法測定蔬菜與水果中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量

1、高效液相色譜法測定蔬菜與水果中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量摘要： 本實驗采用超聲分散，液相萃取，柱子吸附分離技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜法測 定蔬果中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的含量可以取得較滿意的結(jié)果。此方法操作便捷可廣泛應(yīng)用于蔬果中農(nóng)藥含量的測定。關(guān)鍵詞： 擬除蟲菊酯 高效液相色譜 農(nóng)藥含量引言農(nóng)藥是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用于防治病、蟲、雜草對農(nóng)作物危害不可缺少的物質(zhì)，對促進農(nóng)業(yè)增產(chǎn)有極重要的作用。隨著農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，化學(xué)農(nóng)藥的品 種和數(shù)量 不斷增加，已成為防治病蟲害 的主要手段。農(nóng)藥施用到農(nóng)作物上以后，一部分因多種原因 而轉(zhuǎn)移到環(huán)境水 體中，對人、畜產(chǎn) 生一定 的危 害。鑒于此，為保障我國人民的身體健康、有效對農(nóng)藥

2、在環(huán)境水體中的殘留量進行監(jiān)控，大力開展農(nóng)藥殘留量檢測技術(shù) 以及相關(guān)的前處理技術(shù)的研究是非 常必要的。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有高效、低毒以及生物降 解快的特點，廣泛用于蔬菜、茶葉等農(nóng)作物種植 中害蟲的 防治。已報道 的擬除蟲 菊酯類農(nóng)藥殘 留量 測定方法主要有氣相色譜法(GC) 1-43，由于一些擬 除蟲菊酯具有熱不穩(wěn)定性，而G C法需要較高的汽 化溫度，它們會發(fā)生一定的分解，從而對分析產(chǎn) 生影響。因此，我們考慮采用高效液相色 譜 法(HP L C )分析擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。在我國制定的蔬果中擬除蟲菊酯類的農(nóng)藥最高殘留量國家標(biāo)準(zhǔn)為：氯氰菊酯 0.2mg/kg(GB 4829.4-1994); 氰戊菊酯

3、 0.2mg/kg (GB 14928.5-1994 );溴氰菊酯 0.2mg/kg (GB4828.4-1994 )本實驗直接采集新鮮的的蔬菜與水果樣品，樣品經(jīng)過制備提取，凈化和 濃縮等預(yù)處理過程制備成為樣品測試液以后，用液相色譜外標(biāo)法(標(biāo)準(zhǔn)曲線法)測定以上三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留量。正文1實驗部分1.1儀器高效液相色譜儀，馬弗爐，剪刀，電子天平，超聲波提取器，離心機，恒溫水浴槽。1.2試劑1）有機溶劑：丙酮（農(nóng)殘級），正己烷（農(nóng)殘級）。2）層析劑：無水硫酸鈉（A. R.），層析中性氧化鋁（A. R.）,60100 目佛羅里（Florisil）硅藻土，玻璃棉。以上層析劑均在650C馬弗爐中

4、灼燒4h后保存在干燥器中備用。3）農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品與純度：氯氰菊酯（cypermethrin） 96% 氰戊菊酯（fenvalerate ）94. 3%,溴氰菊酯（deltamethrin）97.5%。4）農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。單標(biāo)準(zhǔn)儲備液：以市售的氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品以正己烷為溶劑配制成適當(dāng)濃度的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液。單標(biāo)準(zhǔn)中間液：用正己烷將單標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成適當(dāng)濃度的單標(biāo)準(zhǔn)中間液。單標(biāo)準(zhǔn)使用液：用正己烷分別將 3個單標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋成含氯氰菊酯200卩g/mL。氰戊菊醋100卩g/mL和溴氰菊酯200卩g/mL的單標(biāo)準(zhǔn)使用液。混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：用正己烷將3個單標(biāo)準(zhǔn)中間液混合稀釋成含氯氰菊酯2

5、0.0卩g/mL,氰戊菊酯10.0卩g/mL和溴氰菊酯20. 0卩5g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。1.3實驗步驟1.3.1樣品的制備與提取稱取經(jīng)剪刀絞碎的新鮮蔬菜與水果樣品10g于50mL帶蓋塑料離心管中，根據(jù)樣品含水量多少加入適量的無水硫酸鈉除水。然后向離心管樣品中加入 13mL丙酮：正己烷（3:10，體積比）混合溶劑，混勻后在超聲波提取器中提取大于10min,將離心管上層提取液轉(zhuǎn)移至l00mL燒杯中。逐次向離心管樣品殘渣中加入5mL,3mL混合提取劑，重復(fù)以上萃取、離心分離操作兩次， 合并離心管上層提取液至同一燒杯中。若合并提取液中還存在水分，再加適量無水硫酸鈉除水。1.3.2柱層析凈化與濃縮

6、在30cm（長）X lcm（內(nèi)徑）玻璃管層析柱底部加少許玻璃棉按順序分別裝上無水硫酸鈉、中性氧化鋁和60100目佛羅里硅藻土各約1. 0cm高度，輕輕敲實（也可在實驗之前預(yù)先做好）先用3 mL丙酮預(yù)洗層析柱，棄掉淋洗液。再將燒杯中的祥品提取液全部轉(zhuǎn)移至柱內(nèi)用 3mL丙酮:正己烷（1:2，體積比）混合洗脫劑洗脫3次，收集洗脫液于接液管中。將接液管置于50C恒溫水浴中用氮氣吹脫至洗脫液體積少于0. 30mL,再轉(zhuǎn)移濃縮后的洗脫液至2ml的樣品瓶中，用正己烷定容至1mL,加蓋密封，置于冰箱（04C）中保存。（如 果時間比較緊的話，低溫保存這一步可以省略）1.3.3測定1）色譜操作條件色譜柱 ODS-

7、C18 （250mm*4.6mm,5”L ）檢測波長230nm流動相乙腈流速 1ml/mi n進樣20并且設(shè)位置好其它工作條件還有如柱溫，進樣口溫度，檢測其溫度，升溫速度等。2）操作方法?儀器開機預(yù)熱運行穩(wěn)定后你，在色譜工作站上設(shè)置色譜儀參數(shù)空運行一次，待色譜 基線平穩(wěn)后即可進樣測定。?外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）系列溶液的測定在實驗前先準(zhǔn)備三個標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測定數(shù)據(jù)，在實驗時，再測定本次實驗的數(shù)據(jù)， 記下對應(yīng)時間下的積分面積。?搖勻待測液體，先用待測液清洗進樣器，用進樣器吸取10卩L的待測液，待色譜就緒后，打開進樣閥，將進針頭插入進樣閥，穩(wěn)定均勻進樣后，拔出針頭，扳下進樣閥，待繪 制完整的色譜圖。3

8、）注意事項新鮮蔬菜與水果樣品的含水量較大，因此預(yù)處理過程中要注意除水，切不可將含水 分的樣品制備液進樣。在開啟色譜儀之前，要先開通載氣幾分鐘。實驗結(jié)束后要先關(guān)儀器，再關(guān)閉載氣。2結(jié)果與討論2.1數(shù)據(jù)記錄與處理濃度 /10A-7mol/L保留時間/min峰面積/A工作曲線10A51.13126309.9氯氰菊酯10A31.1081825.10472正己烷溶液101.14678.71239根據(jù)上表繪制氯氰菊酯（正己烷溶液）的工作曲線施藥次數(shù)及用藥濃度、農(nóng)藥安全間隔期，才不會對蔬菜和水果造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)、污染。本氯氟菊酈（正己曉溶液）的工作曲線e 40000120000aoooo-200001000

9、000500Q 10000 1SOCO_2000025000 -300002000060000系列1線性漂列1）根據(jù)上圖可知氯氰菊酯（正己烷溶液）的工作曲線方程 y=3.9117x-31182.2樣品數(shù)據(jù)記錄保留時間min峰面積A1.1241200.5由工作曲線作圖得出線性方程再代入本次試驗所得積分面積求得蔬菜中擬除蟲菊酯的含量為1.578*10A-4mol/L。（氯氰菊酯分子量：416.32）2.3小結(jié)經(jīng)計算，樣品中氯氰菊酯的含量為0.0657mg/kg，與我國制定的蔬菜中得氯氰菊酯的最高殘留量的國家標(biāo)準(zhǔn)：氯氰菊酯0.20mg/kg（GB 4829.4-1994）相比較，實驗測得的樣品中的農(nóng)

10、藥殘留量小于國家標(biāo)準(zhǔn)值。所以本次實驗所用的蔬菜殘留量沒有超標(biāo)， 符合國家食品安全規(guī)我們組的實驗得蔬菜中擬除蟲菊酯的含量較其他組高，是因為實驗中，我們?nèi)〉慕醵际撬谋砥?，而果肉取的較少。樣品的預(yù)處理非常重要，其農(nóng)藥殘留物的提取效率直接影響到最后測定結(jié)果的準(zhǔn)確度，比如新鮮蔬菜的含水量較大，因此預(yù)處理過程中要注意除水。且凈化盡量充分。3結(jié)論本實驗采用高效液相色譜法測定蔬菜中得擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，且利用線性回歸擬合方式處理數(shù)據(jù)，實驗方法方便快捷，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。雖然氯氰菊酯分解快，殘留少，但在使用時也應(yīng)該嚴(yán)格執(zhí)行農(nóng)藥準(zhǔn)則規(guī)定的施藥量、實驗僅就部分蔬菜中氯氰菊酯殘留量進行測定，其他地區(qū)、其他

11、蔬菜和農(nóng)藥殘留是否存在健康危害，還需要大范圍的采樣調(diào)研和評估才能確定。 蔬菜、水果管理部門應(yīng)加強對外調(diào)水果 的質(zhì)量監(jiān)測，經(jīng)分析有農(nóng)藥超標(biāo)的果蔬應(yīng)禁止調(diào)運，確保食用者安全。4思考題1、樣品預(yù)處理過程非常重要，其農(nóng)藥殘留物的提取效率直接影響到最后測定結(jié)果的準(zhǔn) 確度，應(yīng)該怎樣來評估農(nóng)藥殘留物的提取效率？答 首先實驗所用的時間不能太長，所制得的待測液，顏色應(yīng)該比較淺，因為純粹的該類農(nóng)藥溶液是無色的， 顏色越多說明混入的雜質(zhì)的量越多，雖然大家可能認(rèn)為只是葉綠素騙多了，但事實上葉綠素的偏多可以間接證明實驗操作并不規(guī)范，一定還有很多雜質(zhì)混入， 這對結(jié)果的影響是很大的，結(jié)果圖譜中在相應(yīng)的時間所出的峰越獨立，如

12、尖峰是比較好的， 如果是沒有很多雜質(zhì)峰連在一起的鋸齒狀峰，則所造成的誤差就很大了。 須知，農(nóng)藥的含量本身就是微量，如果與雜質(zhì)峰相連，那么誤差一定很大！ 這對于要求十分嚴(yán)格的農(nóng)藥測定來說 是非常不符要求的。所以操作前提一定要嚴(yán)謹(jǐn)！2、 用外標(biāo)法一標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蔬菜與水果中菊酷類農(nóng)藥殘留量，應(yīng)特別注意哪些事項？答 外標(biāo)法一標(biāo)準(zhǔn)曲線法須配制一組不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測出它們的吸收度，然后以標(biāo)準(zhǔn)濃度（C）為橫座標(biāo)，以吸收度（A）為縱座標(biāo)，即可繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如符合朗巴-比爾定 律，則工作曲線為一通過原點的直線。供試品亦經(jīng)過同樣處理，測出它的吸收度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品的濃度，再由稀釋倍數(shù)或樣品重量

13、求出樣品中被測組分的含量。適用于常規(guī)分 析工作（因工作曲線繪成后，可以較長時間使用在此期間內(nèi)測定樣品時，無需再配制標(biāo)準(zhǔn)溶 液）.并且朗白-比爾定律只適用于稀溶液，濃度較大時，吸收度的濃度不成正比。一般情況下， 只要工作曲線的重現(xiàn)性好，測定結(jié)果較吸收度法準(zhǔn)確3、 如果農(nóng)藥殘留物的色譜峰有重疊不能完全分開，可以通過調(diào)節(jié)哪些參數(shù)來改善色譜分 離效果？答 峰連在一起的原因有：儀器來來不及檢測，相鄰的物質(zhì)性質(zhì)十分相似等。除了基本的儀器與處理操作外，可以通過設(shè)置擴大進樣延遲的時間，降低升溫速度，在某一處分比較集中地區(qū)域設(shè)置停止升溫的緩沖時間（程序升溫），降低流動速度，降低柱壓，另外還有一些非參數(shù)調(diào)節(jié)如更換

14、流動相，換極性不同的管子等。參考文獻：宋玉峰，高磊等 蔬菜中氯氰菊酯殘留的風(fēng)險評估研究農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報 2010,29（ 12）:2293-2298余正萍 水果中氯氰菊酯殘留量的測定化學(xué)工程與裝備2009： 11.范志金，劉豐茂，錢傳范。氯氰菊酯的名稱和組成及光學(xué)異構(gòu)體J.農(nóng)藥科學(xué)與管理，1999,20 ( 2): 9-11，17.國家技術(shù)監(jiān)督局中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14929.4-94食品中氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯殘留量測定方法邵華，劉肅，楊錨，等石墨化碳黑分散固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定蔬菜中農(nóng)藥多殘留J.農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，2008, (3) : 43-45. 呂進鋒.GC/MS外標(biāo)法檢測蔬菜中農(nóng)藥多殘留的實驗研究J.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006,16(8) : 937-938.董靜，潘玉香，朱莉萍，等.果蔬中54種農(nóng)藥殘留的QuECh氐S/GC- MS快速分析J.分 析測試學(xué)報，2008, 27(1)