CliniMACS介紹

1、 美天旎細(xì)胞治療平臺CliniMACS系統(tǒng)簡介第一部分、德國美天旎生物技術(shù)有限公司及MACS細(xì)胞分離技術(shù)介紹第二部分、CliniMACS系統(tǒng)在臨床細(xì)胞治療中的應(yīng)用一、CliniMACS細(xì)胞分選儀及其配件介紹二、CliniMACSCD34系統(tǒng)的安全性德國美天旎生物技術(shù)有限公司上海市仙霞路319號遠(yuǎn)東國際廣場A棟2301室200051電話：（8621）62351005傳真：（8621）62350953服務(wù)熱線：8008202606北京市東城區(qū)朝陽門內(nèi)大街銀河SOHOD座50723室100010電話：（8610）64107101傳真：（8610）64100990 HYPERLINK rMAC9Mil

2、tenyiBiotec第一部分德國美天旎生物技術(shù)有限公司及MACS細(xì)胞分離技術(shù)介紹德國美天旎生物技術(shù)有限公司(MiltenyiBiotecGmbH)是一個以細(xì)胞分選技術(shù)為主、擁有多樣化產(chǎn)品的生物技術(shù)公司。開發(fā)研制并銷售世界上最先進(jìn)的細(xì)胞分選、細(xì)胞生物學(xué)、相關(guān)分子生物學(xué)產(chǎn)品和技術(shù)，尤其在干細(xì)胞分選、DC細(xì)胞分選與分析、細(xì)胞因子分泌細(xì)胞分選與分析、免疫治療、再生醫(yī)學(xué)方面占有極大的優(yōu)勢，CD133、BDCA-2(CD303)、BDCA-4(CD304)單抗為我公司專利產(chǎn)品。我公司總部位于德國科隆，在科隆和德國北部羅斯托克均有cGMP生產(chǎn)機(jī)構(gòu)。我們的產(chǎn)品有免疫磁珠、特異性細(xì)胞及蛋白質(zhì)或者DNA/RNA

3、分選用的MACS分選設(shè)備、單克隆抗體、無菌溶液、基礎(chǔ)和特殊培養(yǎng)基、血液/血漿治療用的生物學(xué)吸附劑、LIFE18血漿分離機(jī)、流式細(xì)胞儀及相關(guān)耗材。MACS技術(shù)已成為細(xì)胞分選的標(biāo)準(zhǔn)方法，從實(shí)驗室到臨床，從小規(guī)模到大規(guī)模，從常見細(xì)胞到稀有細(xì)胞和復(fù)雜的細(xì)胞亞群，從人類和小鼠細(xì)胞到其它種系的細(xì)胞，MACS技術(shù)提供了可在每個實(shí)驗室進(jìn)行高品質(zhì)細(xì)胞分選的方法。MACS技術(shù)原理MACS技術(shù)為德國美天旎生物技術(shù)有限公司的專利產(chǎn)品，是一種集合了免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、磁力學(xué)等知識于一體的高度特異性細(xì)胞分選技術(shù)，其高度特異性來自抗體對抗原的特異性識別。主要組成成分為MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。MACS微

4、珠是與高度特異性單克隆抗體相偶聯(lián)的超順磁化微粒。MACS分選柱置于一個永久性磁場一MACS分選器中，可以將磁力增強(qiáng)1000倍，足以滯留僅標(biāo)記極少量微珠的目的細(xì)胞。用緩沖液沖洗分選柱，所有未標(biāo)記的細(xì)胞被沖洗掉。分選柱離開磁場，即可獲得被標(biāo)記的細(xì)胞組分。所有的操作在2.530分鐘內(nèi)即可完成，得到的細(xì)胞可立即用于后繼實(shí)驗。MACS技術(shù)優(yōu)點(diǎn)1、穩(wěn)定、高質(zhì)量的分選使用MACS技術(shù)，可獲得高純度(90-99%)、高回收率的分選細(xì)胞群。2、對細(xì)胞無損傷50nm微珠和MACS分選柱均無毒性，對細(xì)胞無損傷，可以純化有活力和功能活性的細(xì)胞而不影響其活性。3、操作簡便、快速M(fèi)ACS技術(shù)操作簡單，消毒方便。磁珠孵育時

5、間很短，僅需15分鐘。手動分選可在30分鐘內(nèi)完成，autoMACS分選可在2.5-10分鐘之內(nèi)完成。4、從實(shí)驗室到臨床MACS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)從105到1011個細(xì)胞分選。如果使用頻率高，可選用autoMACS；密閉系統(tǒng)內(nèi)無菌分選細(xì)胞，可選用CliniMACSo5、分選后細(xì)胞適用于后續(xù)實(shí)驗一一流式細(xì)胞術(shù)、顯微鏡分析和分子生物學(xué)研究顯示MACS分選對細(xì)胞沒有任何影響。分選后細(xì)胞適用于細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗。此外，分選得到的標(biāo)記和未標(biāo)記細(xì)胞組分均可回收利用。6、從細(xì)胞到分子分選一一MACS技術(shù)不僅可以分選各種細(xì)胞，還可以分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞、亞細(xì)胞物質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、RNA及mRNAoMACS分選策略有兩種基本

6、的分選策略：陽性分選和去除分選。復(fù)合分選策略是將兩種基本分選策略相結(jié)合或者聯(lián)合使用多選微珠，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞亞群的分選。1、陽性分選策略(Positiveselectionstrategy)陽性分選中，目的細(xì)胞被磁性標(biāo)記后，作為陽性標(biāo)記組分直接分選出來。分選后的細(xì)胞不必去除MACS微珠，可立即用于培養(yǎng)或者后續(xù)操作。該方法可以將磁性標(biāo)記的靶細(xì)胞富集10000倍。陽性分選策略優(yōu)點(diǎn)：純度高，回收率高，操作迅速、簡便。MiltenyiBiotec2、去除分選策略(Depletionstrategy)去除分選是把非目的細(xì)胞磁性標(biāo)記后從細(xì)胞混合物中去除的方法，即未磁性標(biāo)記的細(xì)胞為目的細(xì)胞。MACS分選柱技術(shù)加

7、上強(qiáng)磁性標(biāo)記可以去除高達(dá)4個對數(shù)級的細(xì)胞。去除分選策略適用范圍：去除不需要的細(xì)胞；缺乏針對目的細(xì)胞的特異性抗體(如腫瘤細(xì)胞)；不需要抗體和目的細(xì)胞結(jié)合，即細(xì)胞不被激惹rMAC9MiltenyiBiotec（如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞功能分析）；復(fù)合分選的一部分。3、復(fù)合分選策略：聯(lián)合使用兩種以上分選策略，主要用于細(xì)胞亞群的分選或者得到高純度非常稀有的細(xì)胞。（1）去除后再陽性分選（Depletionfollowedbypositiveselection）細(xì)胞亞群的分選，可以先磁性標(biāo)記非目的細(xì)胞，去除分選后對陰性組分再行磁性標(biāo)記和陽性分選。適用范圍：在細(xì)胞懸液中，非目的細(xì)胞也表達(dá)用來陽性選擇目的細(xì)

8、胞的抗原，就需要先去除這群非目的細(xì)胞；如果要分選非常稀有細(xì)胞，先從細(xì)胞懸液中去除非目的細(xì)胞，在富集細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)行陽性分選，可獲得高純度目的細(xì)胞。（2）多重分選策略（MultiSortStrategy）MACS多重分選是一種根據(jù)多種表面標(biāo)志磁性分選細(xì)胞的技術(shù)。多重分選中，首先用MACS多選微珠標(biāo)記目的細(xì)胞，進(jìn)行第一參數(shù)陽性分選。然后細(xì)胞與多選解離試劑共同孵育，后者可以將微珠從抗體上酶性解離下來。接著使用針對另一細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體一微珠復(fù)合物磁性標(biāo)記陽性分選細(xì)胞。二次標(biāo)記的細(xì)胞可以再次進(jìn)行陽性分選或者去除分選。MACS多重分）斑&示禽圖MACS選做珠磁性標(biāo)記目的細(xì)胞第一次陽性分選解離陽性分選細(xì)

9、胞表面刖橙珠對分選后細(xì)胞進(jìn)行針對第二標(biāo)志的磯性標(biāo)記二次分選（陽性分選或者去際分選） MiltenyiBiotec第二部分、細(xì)胞分離技術(shù)在臨床細(xì)胞治療中的應(yīng)用一、CliniMACSPlus細(xì)胞分選儀及其配件介紹1.CliniMACSPlus細(xì)胞分選儀4丨V卩I1CliniMACSPlus（產(chǎn)品號:155-01,見圖）是一臺密閉的全自動的電動機(jī)械儀器，聯(lián)合CliniMACS試劑，如CliniMACSCD34試劑（產(chǎn)品號:171-01）、CliniMACS管道（如產(chǎn)品號:161-01）和CliniMACSPBS/EDTA緩沖液（產(chǎn)品號:700-25）,臨床上用于從人體混合細(xì)胞群體中分選出特定的細(xì)胞亞

10、群。CliniMACSPlus是一應(yīng)用MACS技術(shù)的自動細(xì)胞分選儀。它是一封閉的無菌系統(tǒng)，可應(yīng)用于臨床治療所需的大容量細(xì)胞的純化或非需要細(xì)胞的祛除。此分選儀的主要組成包括完整的計算機(jī)系統(tǒng)、磁性分選單位、蠕動泵和各種操作閥。計算機(jī)系統(tǒng)控制儀器內(nèi)所有其它部件，指導(dǎo)系統(tǒng)按設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行，執(zhí)行各種重復(fù)性的程序。磁性分選單位包括一可移動的永久磁鐵和分選柱支架。蠕動泵控制整個管道內(nèi)的液體流速，并和操作閥一起控制緩沖液和細(xì)胞懸液的流速。結(jié)構(gòu)組成及原理先在細(xì)胞準(zhǔn)備袋內(nèi)用細(xì)胞特異性抗體磁性標(biāo)記靶細(xì)胞，標(biāo)記后，洗滌細(xì)胞以去除多余的抗體。然后，含標(biāo)記靶細(xì)胞細(xì)胞的準(zhǔn)備袋與管道連接，后者依次連接CliniMACS緩沖液

11、袋和細(xì)胞收集袋。分選程序開始后，此分選儀運(yùn)行時使細(xì)胞自動通過分選柱，隨后進(jìn)行一系列洗滌步驟，最后靶細(xì)胞從分選柱洗脫并收集。CliniMACSPlus分選儀和CliniMACS細(xì)胞分選系統(tǒng)的其他產(chǎn)品提供了高純度和高回收率的大劑量細(xì)胞的分選。CliniMACS細(xì)胞分選系統(tǒng)包括CliniMACSPlus分選儀，CliniMACS管道，CliniMACS試齊U，和CliniMACS緩沖液。預(yù)期用途CliniMACSPlus分選儀和CliniMACS細(xì)胞分選系統(tǒng)是在歐洲通過CE認(rèn)證的醫(yī)療儀器，可用于臨床各類人體細(xì)胞的分選。CliniMACS試劑包括用于分選干細(xì)胞，單核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞（DC），NK細(xì)胞，

12、B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群。預(yù)期治療內(nèi)容：血液系統(tǒng)惡心腫瘤：白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤等血液系統(tǒng)非惡性腫瘤：再生障礙性貧血、小兒地中海貧血等自身免疫性疾?。篠LE、MSc等神經(jīng)系統(tǒng)疾病：小兒腦癱、脊髓損傷、腦出血后遺癥等心臟缺血性疾病：心肌梗塞、缺血性心肌病、不穩(wěn)定性心絞痛等外周血管閉塞性疾?。褐巳毖?、糖尿病足等國外的分類在歐洲國家，加拿大，和澳州,CliniMACSPlus分選儀和CliniMACS細(xì)胞分選系統(tǒng)有關(guān)rMACSMiltenyiBiotec產(chǎn)品均在醫(yī)療器械法規(guī)下注冊，并分類如下：-CliniMACSplus分選儀-第二類b醫(yī)療器械CliniMACSPBS/EDTA緩

13、沖液-第二類a醫(yī)療器械CliniMACS管道-第二類b醫(yī)療器械CliniMACS試劑-第三類醫(yī)療器械在美國，CliniMACSPlus分選儀和CliniMACS細(xì)胞分選系統(tǒng)允許在研究藥物研究申請（IDE）或研究儀器豁免申請（IND）核準(zhǔn)下使用?？晒﹨⒖嘉墨I(xiàn)舉列一些國內(nèi)外發(fā)表的論文以印證CliniMACSPlus分選儀和CliniMACS細(xì)胞分選系統(tǒng)的細(xì)胞分選有效性和分選不同靶細(xì)胞的臨床應(yīng)用如下：2.CliniMACS細(xì)胞分選儀配套設(shè)備介紹:1）低速大容量離心機(jī)（Sorvall,RC3型號或相當(dāng)產(chǎn)品）要求：離心杯足夠大適合放入裝600ml的血袋，離心能控制在1925C，制動可以調(diào)節(jié)（即低速大容量

14、離心機(jī)，一般血庫可能會有）。2）無菌操作臺。3）可以調(diào)零的電子顯示秤（精確至1克，最大稱量為1000-2000克）4）軟管熱封口器（即熱合器，Baxter公司，或類似產(chǎn)品）5）血漿分離夾（血庫一般有此設(shè)備）6）非間斷電源：如果醫(yī)院有可能停電則必需準(zhǔn)備要求：最低180VA，持續(xù)90min（APC,Smart-UPS1400I）7）搖床：（Lab-line,Model4635或相當(dāng)產(chǎn)品）要求：轉(zhuǎn)速25rpm（抗體標(biāo)記時用，用手搖替代也可）二、CliniMACSCD34系統(tǒng)的安全性CliniMACSCD34系統(tǒng)TheCliniMACSCD34系統(tǒng)包含CliniMACSCD34試劑、CliniMACS

15、管道、CliniMACSLS管道、CliniMACSPBS/EDTA緩沖液和CliniMACSplus儀器（CliniMACS軟件程序CD34SELECTION1和CD34SELECTION2用于體外從不同種類的造血干細(xì)胞群中富集人CD34陽性細(xì)胞。TheCliniMACSCD34試劑是一次性使用的、無菌的、有生物相容性的CD34抗原特異性試劑；用于磁性標(biāo)記和富集CD34+細(xì)胞。TheCliniMACS管道和CliniMACSLS管道是一次性使用的、無菌的、有生物相容性的管道，包含有細(xì)胞分選柱，保證自動的細(xì)胞分選在密閉、無菌的液體通道中進(jìn)行。TheCliniMACSPBS/EDTA緩沖液是無菌

16、、有生物相容性的等張緩沖液，用于體外細(xì)胞分選時的細(xì)胞洗滌和液體運(yùn)輸。CliniMACSplus儀器是軟件控制的設(shè)備，操縱體外的細(xì)胞分選過程。CliniMACS軟件程序CD34SELECTION1配合CliniMACS管道，或CD34SELECTION2配合CliniMACSLS管道使用。然而，用于體外富集人CD34+細(xì)胞的CliniMACSCD34系統(tǒng)對于分選的細(xì)胞和臨床治療無任何建議。人類細(xì)胞的制造和使用必需遵循國家的法律法規(guī)。結(jié)果1.2.1.R&D內(nèi)部結(jié)果 fMAC9MiltenyiBiotec研發(fā)部門在常規(guī)的研發(fā)過程中進(jìn)行了96次CliniMACSCD34分選。分選樣本不同于臨床應(yīng)用的樣

17、本，所用的細(xì)胞是從志愿者中采集的未動員的白細(xì)胞采集物，極少部分使用的是志愿者經(jīng)G-CSF/GM-CSF動員后的全血白細(xì)胞采集物。因此，所得的數(shù)據(jù)(純度、回收率)不能直接當(dāng)作臨床數(shù)據(jù)，但是可以用于分析分選過程。與臨床志愿者動員后的細(xì)胞分選結(jié)果相似，CD34回收率的上、下限范圍非常大，平均回收率(除外樣本準(zhǔn)備過程)75.0%，沒有明顯增減。CD34平均純度78.0%，因為樣本不同，不能直接比作臨床數(shù)據(jù)。內(nèi)部CD34起始頻度比臨床細(xì)胞的頻度低。最終的純度取決于儀器操作和數(shù)據(jù)輸入(尤其是CD34起始頻度)。相反，被動去除非CD34細(xì)胞(“-logP”)只是分選程序的一個功能，平均被動去除非CD34細(xì)胞

18、3.6log.沒有明顯增減。1.2.2.臨床結(jié)果文獻(xiàn)來源于同級評審的PubMed上的刊物、發(fā)表于stemcelltransplantation上的摘要，以及1997年后，CliniMACSCD34系統(tǒng)上市后的血液學(xué)會議；主要包括歐洲血液和骨髓移植年會(EBMT),國際細(xì)胞治療會議(ISCT,以前稱作ISHAGE)，德國輸血醫(yī)學(xué)會和血液免疫會議(DGTI)，德國、奧地利血液和腫瘤學(xué)會(DGHO)，以及美國血液學(xué)年會(ASH)。只有清晰地表明了CliniMACSCD34系統(tǒng)細(xì)胞分選的文章才是完整的。結(jié)論被分成以下幾種，見表1。通常表中的數(shù)據(jù)指的是n次細(xì)胞分選的中位數(shù)。表1臨床分選結(jié)果的均值A(chǔ)ppl

19、icationPurity(%)Yield(%)Viability(%)DepletionTcells(log)DepletionBcellsnAutologousPESO96.162.596.72.46287AllogeneicPBSC976598455331090Cordblood73639549Bonemarrow97.565.195418SeparationperformancePBSC(mixedapplications)96.256999531000Rangeofvalues30-99.815.2309.853-1001.31-7.911.11-6.082448Rangeofmed

20、ians90-99.646.28695-993.7-52.46-3.6524481.3.安全性評估CliniMACSCD34試劑的生物相容性用Amgen細(xì)胞分選儀(MiltenyiBiotecGmbH也有Amgen的技術(shù)資料)進(jìn)行抗體研發(fā)的臨床前計劃中，設(shè)備的生物相容性檢測按照EN30993和ISO10993標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。以下檢測遵循ISO10993的第一部分。.細(xì)胞毒性MiltenyiBiotecCliniMACSCD34試劑的細(xì)胞毒性檢測是通過確定被試劑標(biāo)記、通過CliniMACSCD34系統(tǒng)分選的CD34+細(xì)胞的活性來進(jìn)行的。用臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性。第一個數(shù)據(jù)是Amgen細(xì)胞分選儀評估報告

21、的總結(jié)。30例分選后純化的CD34+細(xì)胞中位活性達(dá)96%。亞慢性毒性亞慢性毒性的研究用于評估獼猴靜脈內(nèi)一次性輸入CliniMACSCD34試劑14天后的安全性。劑量分別為0,0.6,6.0和60.0卩g/kg/天。0.6卩g/kg/天的低劑量代表了CliniMACSCD34試劑回收率100%情況下的臨床回輸極限劑量，中等劑量和大劑量分別是預(yù)估臨床劑量的10倍和100倍。每日給予上述劑量沒有導(dǎo)致死亡，且對體重、進(jìn)食、opthalmoscopy、尿分析、血液或任何觀察到的臨床征象都沒有影響。大劑量處理的猴子中，組織病理學(xué)檢查顯示肝臟和生發(fā)中心的Kupffer細(xì)胞呈現(xiàn)棕色，脾臟成紅色果漿樣。染色的成

22、分是鐵，主要是由于CliniMACSCD34試劑含鐵成分。急性靜脈激惹本研究的目的是確定新西蘭白兔一次性靜脈注射CliniMACSCD34試劑的激惹能力。試劑給予組CliniMACSCD34試劑的劑量為0.01mg,對照組給予10mM生理鹽水/EDTA緩沖液。動物觀察8天，未發(fā)現(xiàn)死亡或臨床不良反應(yīng)。所有兔子耳靜脈注射部位進(jìn)行組織病理學(xué)檢測，無異常發(fā)現(xiàn)。白兔一次性靜脈注射CliniMACSCD34試劑后無激惹現(xiàn)象。兔子的給予劑量大約是人的50倍（大約3.3卩g/kg）。血液相容性CliniMACSCD34試劑的溶血檢測用于確定試劑的溶血能力。實(shí)驗樣本為新鮮的人血和血漿，與未稀釋的CliniMAC

23、SCD34試劑的比例為1：1,PBS/EDTA緩沖液作為介質(zhì)。EDTA濃度比分選緩沖液的濃度高5倍。檢測樣本在37C孵育45分鐘，然后離心5分鐘。上清液中的血紅蛋白用氰化正鐵血紅蛋白法定量。CliniMACSCD34試劑與人血在1：1的情況下是不溶血的，1:1的比率對CliniMACSCD34試劑來說是最大的了?？贵w交叉反應(yīng)研究本研究目的是確定鐵/氫氧化物/右旋糖酐氧化物包被的鼠單克隆CD34抗體的特異性和可能的交叉反應(yīng)。CliniMACSCD34試劑的特異性和可能的交叉反應(yīng)是依據(jù)一組37個冰凍切片來評估的。CD34+KG1作為陽性對照的細(xì)胞。CD34抗體有2種濃度（2.5和0.5聘蛋白/ml

24、稀釋在游離右旋糖酐鐵中）.該研究條件下，CliniMACSCD34試劑特異性地與所有組織中的內(nèi)皮細(xì)胞和許多組織包括真皮、宮頸粘膜、淋巴結(jié)的結(jié)締組織和胸腺中的纖維細(xì)胞/基質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)，這并不意外，因為眾所周知，CD34抗原表達(dá)在這些細(xì)胞的表面。該反應(yīng)表明了CliniMACSCD34試劑的高度特異性。心血管安全性的研究該研究是按照美國FDA目前有效的GLP標(biāo)準(zhǔn)（21CFR,Part58）和SBiSOP標(biāo)準(zhǔn)及其協(xié)議進(jìn)行的此外，還遵循ECD的GLP原理。該研究中，逐漸增加靜脈給予的CliniMACSCD34試劑量。研究目的是評估恒河猴心血管參數(shù)對CliniMACSCD34試劑的急性反應(yīng)。實(shí)驗樣本和介

25、質(zhì)（磷酸鹽緩沖液/EDTA緩沖液）通過靜脈緩慢輸入（3-6分鐘），CliniMACSCD34試劑的劑量逐漸增加，分別為0.6,6.0,和60.0卩g/kg。CliniMACSCD34試劑靜脈給予量逐漸增加，對平均動脈壓、平均右心室壓、心輸出量、ECGs、呼吸和心率無藥物相關(guān)的影響。動物給予的總劑量比人每公斤體重極限量多100倍。CliniMACSCD34在靶細(xì)胞上的殘余量 MiltenyiBiotecJII在CD34+細(xì)胞表面殘存的未結(jié)合的CliniMACSCD34試劑會增加對患者的不良反應(yīng)。在用CliniMACSCD34系統(tǒng)進(jìn)行CD34富集的過程中，每次抗體標(biāo)記后都要進(jìn)行洗滌。洗滌時，細(xì)胞懸

26、液離心，去除上清液。因此，未結(jié)合的CliniMACSCD34試劑和所有膠質(zhì)及溶液都能夠被洗掉。不過，上清液中和靶細(xì)胞上未結(jié)合的試劑可忽略不計。為評估上清液和靶細(xì)胞上結(jié)合的殘存CliniMACSCD34試劑量，可用ICPAES方法確定殘存的鐵盒IgG濃度。結(jié)果顯示如表2，進(jìn)一步的數(shù)據(jù)可參考MiltenyiDR00022和DR00046.表2靶細(xì)胞上殘存的CliniMACSCD34試劑CellSampleTotalinfusible(Cells+Supernatant)Ironinpg/2.5x10cellsIronpg/2.5x10BcellsIgGpg/2.5x10acellsIgGpg/kg

27、Mean(n=4)110.0250.5212530.25Max197.40306.1815.310.31Dosageof2.&x10scells/50kgbodyweight如生物相容性研究（1.3.1章）所概述的，CliniMACSCD34試劑是生物相容性的物質(zhì)，即使劑量達(dá)到0.6,6.0和60.0Mg/（a按照ICPAES方法，比殘存的試劑量高200倍），也未觀察到全身毒性和心血管的副作用。右旋糖酐鐵CliniMACSCD34系統(tǒng)的反應(yīng)機(jī)制是以MACS（磁性細(xì)胞分選）技術(shù)為基礎(chǔ)的。有過9年的CD34+祖細(xì)胞臨床分選經(jīng)驗，CliniMACSCD34系統(tǒng)被證明是可靠、安全、有效的體外細(xì)胞分選系

28、統(tǒng)。CliniMACSCD34試劑作為CliniMACSCD34系統(tǒng)的一部分，包含鼠抗原特異性IgG單克隆抗體，共價結(jié)合了超順磁右旋糖酐鐵顆粒。這些顆粒含有低分子右旋糖酐聚合物，及Fe2+/Fe3+氧化物/氫氧化物核心.CliniMACSCD34系統(tǒng)富集的CD34+細(xì)胞可殘留有這些右旋糖酐鐵顆粒。因此，用于制造CliniMACS試劑的右旋糖酐鐵的安全性得到了詳盡的文獻(xiàn)評估（見MiltenyiDR01673）。文獻(xiàn)回顧了用于治療缺鐵綜合癥的各種胃腸外鐵復(fù)合制劑，鐵復(fù)合制劑的基本成分是低分子或高分子右旋糖酐鐵，蔗糖鐵和葡萄糖鐵。鑒于鐵復(fù)合制劑和鐵復(fù)合制劑直接釋放出的活性鐵可引起過敏和過敏導(dǎo)致的嚴(yán)重

29、副反應(yīng)，低分子右旋糖酐鐵是最安全和穩(wěn)定的成分。低分子右旋糖酐鐵的商品名是CosmoFer,種藥品，胃腸外給藥劑量最大1400mg。CosmoFer類似于用于制造CliniMACSCD34試劑的低分子右旋糖酐鐵成分，因此可以預(yù)見用于制造CliniMACSCD34試劑的低分子右旋糖酐鐵的潛在副作用在很大程度上來說是非常低的，因為給患者回輸后，殘存的右旋糖酐鐵劑量估計比胃腸外給藥的CosmoFer的極限量低3400倍。用于制造CliniMACSCD34試劑的右旋糖酐鐵的安全性經(jīng)過9年的CliniMACSCD34系統(tǒng)的市場經(jīng)驗總結(jié)得到進(jìn)一步證實(shí)，未見右旋糖酐鐵所致的副作用報道。然而，所有CliniMA

30、CSCD34系統(tǒng)的客戶必需通過CliniMACSCD34系統(tǒng)的詳細(xì)產(chǎn)品說明文件了解任何潛在的副作用。HAMA眾所周知，HAMA反應(yīng)是用鼠和嵌合的單克隆抗體進(jìn)行治療后的副作用，輸入鼠抗體后可能發(fā)生過敏反應(yīng)?；颊呓?jīng)過富集的CD34+細(xì)胞治療后可能會發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)出針對少量殘余的鼠抗體（如：CD34抗體）的抗體。不可能發(fā)生IgE反應(yīng)，因為使用CliniMACSCD34試劑后，沒有任何臨床單位報道過過敏反應(yīng)或相關(guān)的其它副作用。使用CD34試劑的研究（MiltenyiDR00533andDR00593）也未指向HAMA。為 MiltenyiBiotec安全起見，回輸經(jīng)CliniMACSCD34系統(tǒng)富集

31、的CD34+細(xì)胞后，應(yīng)該監(jiān)測HAMA的發(fā)生。CliniMACSCD34試劑包裝內(nèi)的說明書和CliniMACS用戶手冊都標(biāo)明了HAMA反應(yīng)的危險性。1.3.5.CliniMACSCD34系統(tǒng)的人類健康風(fēng)險評估CliniMACSCD34系統(tǒng)的毒理學(xué)風(fēng)險評估由SafeBridgeConsultantsInc.的DABT首席毒理學(xué)家AllanW.Ader博士執(zhí)行。風(fēng)險評估的基礎(chǔ)是廣泛的文獻(xiàn)回顧，評估內(nèi)容如下：危害鑒定暴露評估劑量相關(guān)性評估風(fēng)險描述本研究鑒定了回輸一定量殘存CliniMACSCD34試劑（成分為右旋糖酐鐵和CD34單克隆抗體）的患者發(fā)生的若干危害，以及這些成分的預(yù)估量。CliniMACS

32、CD34試劑成分的預(yù)估量如下：鐵：200-300昭/人（2.7-4.0卩g/kg）右旋糖酐:200-300昭/人（2.7-4.0gg/kg）CD34mAb:10-15gg/人（0.13-0.20gg/kg）（體重75kg）CD34單克隆抗體雖然單獨(dú)的CD34單克隆抗體的特異性數(shù)據(jù)很少，相關(guān)的其它產(chǎn)品如：Isolex磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)（BaxterHealthCorp.）或Bexxar（IgG2a碘131標(biāo)記的CD20抗體）有重要的臨床應(yīng)用、安全性和有效性的報道。另外，有充分證據(jù)（如生物相容性）支持肯定的風(fēng)險-利益評估。右旋糖酐鐵文獻(xiàn)報道因50mg/天右旋糖酐鐵用于治療貧血而發(fā)生的典型的危害（如：

33、心血管、皮膚、胃腸道、血液、神經(jīng)、泌尿等系統(tǒng)的危害），在因使用CliniMACSCD34試劑而輸入殘存的右旋糖酐鐵時是不大可能發(fā)生的，因為后者比前者的右旋糖酐鐵量最多低250倍。而且，本研究還證實(shí)與使用CliniMACSCD34試劑相關(guān)的、極低的殘存右旋糖酐鐵量與增加的腫瘤發(fā)生率無因果關(guān)系。結(jié)論作為CliniMACSCD34系統(tǒng)一部分的CliniMACSCD34試劑處理過的細(xì)胞重新回輸給患者，患者將同時獲得低劑量的鐵、右旋糖酐鐵和單克隆抗體。根據(jù)文獻(xiàn)報道，這種劑量不可能引起任何副作用，包括致癌。用作為CliniMACSCD34系統(tǒng)一部分的CliniMACSCD34試劑處理過的細(xì)胞進(jìn)行治療的患者

34、都患有血液系統(tǒng)腫瘤，且病情嚴(yán)重。他們通常接受多種藥物治療和醫(yī)學(xué)輔助治療，這些都與后來的風(fēng)險和副作用相關(guān)。根據(jù)許多患者的經(jīng)驗，除免疫耐受情況外，CliniMACSCD34試劑不是接受體外分選干細(xì)胞治療的患者發(fā)生毒性反應(yīng)的直接作用因素；事實(shí)上，這種治療在許多病例中被證實(shí)是有益的。作為CliniMACSCD34系統(tǒng)一部分的CliniMACSCD34試劑的好處包括：目的細(xì)胞的高回收率，無需大量采集細(xì)胞即可達(dá)到回輸?shù)陌屑?xì)胞量，造血成分的快速植入。準(zhǔn)備做干細(xì)胞移植的患者通?；加懈鞣N致命的疾病，作為CliniMACSCD34系統(tǒng)一部分的CliniMACSCD34試劑的使用為這些患者提供了另外一種治療手段，并

35、具有潛在的治療效果（見第1.4.2章）。因而，作為CliniMACSCD34系統(tǒng)一部分的CliniMACSCD34試劑的使用也會在某些患者中導(dǎo)致抗體反應(yīng)。但是利明顯大于弊。MACMiltenyiBiotec1.3.6.風(fēng)險處理我們已經(jīng)建立詳細(xì)的風(fēng)險處理程序，且還在完善中，上市之前評估所有與CliniMACSCD34系統(tǒng)相關(guān)的可能的風(fēng)險，通過MiltenyiBiotecGmbH臨床部門建立的后市場監(jiān)測程序鑒定并評估任何更深入的風(fēng)險。每年回顧并修訂風(fēng)險處理報告。1.4.CD34+細(xì)胞的潛在臨床應(yīng)用CD34+細(xì)胞的一般背景TheCD34抗原是重糖基化的單體細(xì)胞表面抗原，分子量約116kDa.CD34

36、抗原主要表達(dá)在早期淋巴造血干、祖細(xì)胞表面，小血管內(nèi)皮細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞和一些胎兒、成人的神經(jīng)組織內(nèi)也有表達(dá)JCD34的表達(dá)在最早期的祖細(xì)胞上達(dá)最高水平，隨著成熟度的加深而降低其表達(dá)。在正常人組織中，CD34的表達(dá)僅限淋巴造血細(xì)胞，唯一的例外是毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞oCD34抗原的腫瘤表達(dá)傾向于在正常表達(dá)之后，意味著從本質(zhì)上來說，所有的非造血淋巴樣腫瘤是CD34陰性的。相反，大量的急性白血病是CD34陽性的：大約40%的急性髓細(xì)胞性白血病,60%的急性B淋巴細(xì)胞性白血病和1-5%的急性T淋巴細(xì)胞性白血病。與正常淋巴造血細(xì)胞的CD34早期特異性表達(dá)相一致，慢性淋巴細(xì)胞性白血病和淋巴瘤均為CD34陰性。CD34陽性細(xì)胞的臨床適應(yīng)癥CliniMACSCD34系統(tǒng)上市后在自體干細(xì)胞移植中用于去除腫瘤細(xì)胞，在異基因移植中用于去除非目的異源性T淋巴細(xì)胞。骨髓瘤患者大量的隨機(jī)研究顯示：通過富集CD34+細(xì)胞而去除腫瘤細(xì)胞在大多數(shù)患者中沒有臨床效果。HLA相和異基因移植中，HLA的精細(xì)配型和免疫抑制劑應(yīng)用的進(jìn)展使得異基因移植無需去T也可耐受GVHD的風(fēng)險?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，CD34富集的2個主要適應(yīng)癥是：HLA不和的異基因干細(xì)胞移植和難治性自身免疫病患者自體干細(xì)胞移植中去除自體反應(yīng)的細(xì)胞。不相和的異基因干細(xì)胞移植半相和(供者是父母，受者是子女)或組織抗原中一個或幾個位點(diǎn)不和的親屬成為需要干細(xì)胞移植而又