實驗六-凝膠過濾層析法-分離生物大分子

1、實驗六凝膠過濾層析法分離生物大分子 層析也稱之色譜，基本原理是分析樣品作為流動相流過固相時，由于樣品中的各個成分與固相相互作用不同使得樣品中的各個成分通過固相的速率產生了差別，從而達到分離樣品中各個成分的目的。 層析因固相介質不同又分為:離子交換層析分子篩層析吸附層析層析原理 凝膠層析是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠過濾、分子篩層析或排阻層析。 單個凝膠珠本身象“篩子”。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。凝膠過濾層析帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠小分子進入葡聚糖珠內大分子不能進入珠內，經珠之間縫隙流出凝膠過濾層析過程示意圖層析法分離生物大分子的一般步驟：將作為固相成分的不溶性基質，例如葡聚糖凝膠

2、、纖維素、樹脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。然后加樣品，再用適當?shù)娜軇┫疵?。樣品中各種成分通過柱子取決于與固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脫出來，達到將各個成分分離的目的。被分離的樣品有：藍色葡聚糖2000，分子量為2000kDa，藍色血紅蛋白A，分子量為17kDa，紅色2,4-二甲基苯酚（DNP）-天門冬氨酸，分子量500Da，黃色本實驗的固相載體是葡聚糖凝膠G-50，它適用于分子量范圍在1,500-20,000 Da之間的多肽與蛋白質的分離。被分離的樣品有：藍色葡聚糖2000，分子量為2,000,000Da血紅蛋白A，分子量為17,000Da2,4-二甲基苯酚（DNP）-天門冬氨酸，

3、分子量500Da實驗試劑:玻璃層析柱 125cm交聯(lián)葡聚糖 G-50 (Sephadex G-50)洗脫液 1）預裝層析柱(示教,注意：不要干柱)2）柱的平衡 洗脫緩沖液持續(xù)低速過柱，直至凝膠均勻壓縮，約20cm高（不要干柱）。3）上樣 控制液面，使其恰好平床表面，關閉出口，用吸管小心把樣品沿管壁加入，打開出口，讓樣品液面降低至床表面（不要干柱） 。 實驗操作4）洗脫與收集 先加少量洗脫液洗下管壁樣品，進入層析柱，然后加入洗脫液洗脫，進行洗脫的同時開始收集樣品，每管收集20滴。 層析法的相關概念1.層析法:（色譜法）是指利用待分離的樣品中各組分的理化性質（吸附力、分配系數(shù)、電荷、分子量、親和力

4、等）的差異，使其在流動相的作用下通過固定相時的移動速度不同，從而達到相互分離的目的。 固定相：固定不移動的一相，一般是指支持物中所含的水分。阻止所分離的樣品向前移動（阻力）流動相： 洗脫時所用的溶劑，也叫洗脫液。不斷地前移，并帶動所分離的樣品向前移動（動力）洗 脫：用洗脫液沖洗曾析柱，使樣品中不同組分得以分離的過程。洗脫曲線：以洗脫的體積為橫坐標，組分的濃度為縱坐標作圖所得的曲線。 層析法分類1.根據(jù)分離原理：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析。2.根據(jù)流動相不同：液相層析（液-液層析，液-固層析）、氣相層析（氣-液層析，氣-固層析）3.根據(jù)固定項（支持物）的裝填方式：柱層析

5、、薄層層析、紙層析、薄膜層析紫外分光光度法檢測DNA分光光度技術是利用物質特有的吸收光譜對其進行定性、定量分析的實驗技術。分光光度技術特點 靈敏度高：測定下限可達105106mol/L 準確度能夠滿足微量組分的測定要求： 相對誤差25 （12）操作簡便快速應用廣泛 吸光光度法是基于被測物質的分子對光具有選擇性吸收的特性而建立起來的分析方法。光學光譜區(qū)遠紫外近紫外可見近紅外中紅外 遠紅外（真空紫外）10nm200nm200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m氫燈 復合光(陽光及鎢燈)發(fā)射光譜紅 橙 黃 綠 青 藍 紫單色光三棱鏡可

6、見光分光光度計光源紫外分光光度計光源有關光學原理吸收光譜 在光源和棱鏡之間放上某種物質的溶液，光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜。DNA的吸收峰Solar ultraviolet radiation effects on biological systemsB L Diffey Regional Medical Physics Department, Dryburn Hospital, Durham DH1 5TW, UK/docs/001-503/001-503.html光吸收基本定律: Lambert-Beer定律A=lg(I0/It)=

7、kbcItI0bdxII-dIs朗伯定律(1760) A=lg(I0/It)=k1b比爾定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介質厚度(cm)Lambert-Beer定律 A或DK C L 吸光度 摩爾消光系數(shù) 吸收物質的光徑（cm） 溶液濃度（mol/L） dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù)（單位為g /ml） 分光光度計的基本部件1. 光源分光光度計上常用的光源有兩種： 近紫外光區(qū) 可見光區(qū) 鎢絲燈 近紅外光 紫外光區(qū)氫燈、氘燈 光電2. 單色器單色器是把混合光波分解為單一波長光的裝置。 棱鏡光波通過棱鏡時，不同波長的光折射率不同，折射率與波長成負相關。 衍射光柵在石英

8、或玻璃的表面刻劃許多平行線，通過光的干涉和衍射，形成光譜。吸收池（或稱比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃或石英制成注意：a. 與光束垂直；b. 規(guī)格相同；c. 清潔5. 檢測器光電，并逐級放大6. 測量裝置電流表、記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元 吸光度與濃度的關系 A = bc 吸光度0.00光源檢測器 吸光度0.22光源檢測器b 吸光度0.42光源檢測器b微量測量方法舉例：NanoDrop 2000c Spectrophotometer, Thermo Scientific/video/2891/-advertisement（備用：/us/201839016/66272639.shtml）用分光光

9、度計法定量DNA稀釋樣品：取2l提取的質粒DNA，加入98l蒸餾水對待測DNA樣品做1:50 (根據(jù)實際情況確定稀釋倍數(shù));蒸餾水作為空白,在波長260nm、280nm處調節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)至零。實驗操作（一）加入DNA稀釋液，測定260nm 的吸收值。 260nm 讀數(shù)用于計算樣品中核酸的濃度：OD260值為1相當于約50g /ml雙鏈DNA公式： dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù) （單位為g /ml）4. 測定280nm的吸收值。 可根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)的比值（OD260/OD280）估計核酸的純度。一般DNA的純品，其比值為1.8，低于此值說明有蛋白質或其它雜

10、質的污染。實驗操作（二）/resources/articles/nucleic-acid-purity-a260a280.htmlNucleic Acid Purity Assessment Using A260/A280 Ratios紫外吸收測定蛋白質含量利用經驗公式直接計算樣本蛋白質含量（P130）蛋白質的吸收峰Solar ultraviolet radiation effects on biological systemsB L Diffey Regional Medical Physics Department, Dryburn Hospital, Durham DH1 5TW, UK

11、/docs/001-503/001-503.html【原理及說明】蛋白質中的酪氨酸和色氨酸含有共軛雙鍵吸收高峰在280nm處。在此波長范圍內，蛋白質含量與吸光值成正比。操作簡便、樣品溶液可回收，同時可估計蛋白質含量。OD值應在0.05-1.0之間。公式計算時也應注意各種蛋白質和各種核酸在280nm及260nm處的光吸收值也不盡相同，不同蛋白質中的酪氨酸和色氨酸含量有差異，故計算結果有一定誤差。如果設定標準管，則應與測定管的蛋白質氨基酸組成應相似，以減小誤差。 操作步驟適當稀釋蛋白質樣本（根據(jù)實際情況），在280nm和260nm兩處波長分別測得光密度值、再按下列公式計算。 1、OD2800D2601.5時，用Lowry-Kalokar公式： 樣本蛋白質含量(mgml) =1.5OD2800.75OD2602、OD280OD2601.5時，用Lamber-Beer定律計算： 樣本蛋白質含量(mgml)=OD280（KL） K：克