大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略課件

1、大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體及其性質(zhì) 在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見(jiàn)于生長(zhǎng)在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白

2、質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作 包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái)能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)： 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活

3、性，必須通過(guò)有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^(guò)30%包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作 如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體。事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體法的長(zhǎng)處所在包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作

4、C 共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動(dòng)力學(xué)原理：C1C2CnCUI 1I nNX1X2XnXAgAgAgAgI 有效變復(fù)性過(guò)程中的中間狀態(tài)X 脫離有效變復(fù)性過(guò)程而進(jìn)入集聚的中間狀態(tài)N 天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)U 變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)A 集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過(guò)程，因此永遠(yuǎn)成為無(wú)活性的蛋白質(zhì)。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進(jìn)行人工變性（解除共價(jià)修飾和驅(qū)散集聚體）復(fù)性操作包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的溶解與變性： 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。能有效促進(jìn)

5、包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清洗劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化 促溶劑 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā) 形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng) 混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng) 極端pH 廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）： 包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是：通過(guò)次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性將多肽鏈中被拆開(kāi)的游離巰基重新折疊包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作 包涵體復(fù)性操作

6、的方法包括：分段稀釋法，逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生一步稀釋法，蛋白復(fù)性與濃度無(wú)關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐酰化，蛋白帶負(fù)電，抑制集聚產(chǎn)物隔離法，將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表達(dá)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：二硫鍵形成在包涵體變性體系中，始終存在著還原劑，使多肽鏈中的巰基保持還原狀態(tài)，防化學(xué)氧化法（A）需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是二硫鍵交換（B）需要還原型和氧化型

7、谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵止二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致嚴(yán)重的集聚。在變性操作結(jié)束后，這些游離型的巰基必須重新配對(duì)形成二硫鍵，此時(shí)多肽鏈也重新發(fā)生折疊。形成二硫鍵的方式主要有： 隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 形成相對(duì)特異，因此適用性較廣，重折疊效果好HSHS S S+2e+2H+AHSHS S-S-R HS+BR-S-S-R S S2R-SH分泌型異源蛋白的表達(dá) 在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列的存在是蛋白質(zhì)分

8、泌的前提條件分泌型異源蛋白的表達(dá)以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn) 穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整 相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有 甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì) N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸 桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端 的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過(guò)程中被有效除去分泌型異源蛋白的表達(dá)以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)： 相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很

9、難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍分泌型異源蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感 分泌型異源蛋白的表達(dá)分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌到培養(yǎng)基中，這一過(guò)程嚴(yán)格依

10、賴于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)上的磷酸酯酶，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。 因此，只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適的質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型的受體細(xì)胞。此時(shí)，用另一種攜帶大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞，并使用相同性質(zhì)的啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄，則可實(shí)現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌。融合型異源蛋白的表達(dá) 除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開(kāi)放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過(guò)在DNA水

11、平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白融合型異源蛋白的表達(dá)以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)目的蛋白表達(dá)率高 與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件 胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段 行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲融合型異源蛋白的表達(dá)融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的

12、構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過(guò)于接近，融合蛋白的裂解工藝兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架 融合型異源蛋白的表達(dá)融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST） 維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白（TrxA） 維持良好空間構(gòu)象 pTrxFus麥芽糖結(jié)合蛋

13、白（MBP） 促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫親和層析 pRIT2T外膜蛋白（OmpF） 促進(jìn)分泌b-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫親和層析泛素蛋白（Ubi） 維持良好空間構(gòu)象融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收 融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種： 化學(xué)斷裂法 酶促裂解法 融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收 用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚

14、基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法化學(xué)斷裂法：融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶 Arg-C葡萄球菌蛋白酶 Glu-C假單孢菌蛋白酶 Lys-C豬胰蛋白酶 Arg-C Lys-C蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，同時(shí)每

15、種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來(lái)說(shuō)，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的Arg CNNC受體蛋白目的蛋白融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn) 為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來(lái)的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含

16、起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子X(jué)a的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)啟動(dòng)子受體基因接頭目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回

17、收融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)Pinpoint Xatac生物素結(jié)合肽編碼序列Xa因子識(shí)別位點(diǎn)編碼序列SP6T7AproriMCSATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGCXa-1Ile Glu Gly Arg GluATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG CXa-2ATC GAA GGT CGC GAA AAG CT

18、T CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GCXa-3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotIXa因子切割位點(diǎn)寡聚型異源蛋白的表達(dá) 從理論上講，外源基因的表達(dá)水平與受體細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)（即基因劑量）呈正相關(guān)。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外，還攜帶其它的可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標(biāo)記的抗生素抗性基因等。隨著重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的不斷增加，受體細(xì)胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝卻因能量不濟(jì)受到影響，因此通過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù)

19、提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。 另一種通過(guò)增加外源基因劑量而提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，即將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)的策略寡聚型異源蛋白的表達(dá)以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽在一定程度上改善表達(dá)量目的產(chǎn)物回收困難短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長(zhǎng)度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高寡聚短肽需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易

20、出現(xiàn)序列不均一性寡聚型異源蛋白的表達(dá)寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1 T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰(zhàn)略：寡聚型異源蛋白的表達(dá)寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建構(gòu)建舉例：PSDT1 T2EcoRIBamHIAATTCAGATCT GTCTAGAGCCTAGEcoRIBgl IIBamHIEcoRIBamHIBgl II GATCT AGCCTAGEcoRIBamHIBgl IIEcoRIBamHIBgl IIEcoRI + BamHIBgl II + BamHIBamHI整合型異源蛋白的表達(dá)以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的基因穩(wěn)

21、定表達(dá)整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒(méi)有選擇壓力存在下可以連續(xù)目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制，此時(shí)可通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理 在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機(jī)制，其可能的生物學(xué)功效是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類： 轉(zhuǎn)位因子依賴型同源序列依賴型整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理 轉(zhuǎn)位因子是指生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類無(wú)復(fù)制能力的DNA可移動(dòng)因

22、子，不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子，例如： 轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族噬菌體 G片段（G-Fragment） 原核細(xì)菌 插入順序（IS） 真核細(xì)菌 轉(zhuǎn)座子（Tn、Ty） 高等植物 可移動(dòng)因子（Ac、Ds） 高等動(dòng)物 跳躍基因（mobil gene） 整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)IS（1 kb）Ty（5 kb）Tn（2 - 20 kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉(zhuǎn)位酶基因識(shí)別位點(diǎn)阻遏基因IRIRIRIRISIS整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：整合形式整合型異源蛋白的表

23、達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理 在很多原核細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組，其頻率與細(xì)菌種類、兩個(gè)同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長(zhǎng)度、同源程度密切相關(guān)。一般地說(shuō)，距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。 同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個(gè)斷裂位點(diǎn)，而后者涉及兩個(gè)斷裂位點(diǎn)同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因整合位點(diǎn)染色體DNA整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因交換區(qū)域染色體DNAori標(biāo)記基因+蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 無(wú)論是在真核生物還是在原核細(xì)胞中，重組目的蛋白表達(dá)后都會(huì)面臨被降解的命運(yùn)，其穩(wěn)定性甚至還不如半衰期較短的受體細(xì)胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)。 在大多數(shù)情況下，重組目的蛋白的不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。然而越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明，重組目的蛋白在受體細(xì)胞內(nèi)的半衰期可以通過(guò)蛋白序列的人工設(shè)計(jì)以及受體細(xì)胞的改造加以調(diào)整和控制。蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶La和Ti降解的，兩者分別由lon和clp基因編碼，其蛋白水解活性依賴于ATP。lon基因由