3,5 - 二硝基水楊酸(DNS)法測定總糖和還原糖

1、實驗一 3, 5 - 二硝基水楊酸(DNS)法 測定總糖和還原糖 掌握還原糖和總糖測定的基本原理 掌握比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計的使用。實驗?zāi)康倪€原糖包括哪些糖？測試還原糖的方法有哪些？總糖包括哪些化合物？如何測定？3,5二硝基水楊酸(DNS)法的基本原理是什么？優(yōu)點？3,5二硝基水楊酸(DNS)法測定時為什么要設(shè)計空白管？思考題實驗原理還原糖與非還原糖還原性糖（Reducing sugar） 與斐林、土倫、本氏試劑呈正反應(yīng)的糖非還原性糖（Nonreducing sugar）無變旋、還原、成脎性質(zhì)在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化

2、合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。 本方法操作簡便，快速，雜質(zhì)干擾較少。試管和試管架 堿滴定管（50ml）鐵架臺 滴定管夾吸量管（1ml和2ml） 容量瓶（100ml）水浴鍋 玻璃漏斗和燒杯。三腳架 量筒白瓷板 玻璃棒 實驗器材762 分光光度計 756 分光光度計電子天平 恒溫水浴 3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.5g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氫氧化鈉溶液325ml，再加入45g丙三醇，搖勻，冷卻后定容

3、至1000ml。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸餾水溶解后，再定容至100ml，即含葡萄糖為1.0mg/ml。6 M HCl：取250ml濃HCl(3538%) 蒸餾水稀釋到500ml。碘-碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。6N NaOH：稱120g NaOH溶于500ml蒸餾水中。0.1% 酚酞指示劑。實驗材料 ：玉米粉實驗試劑 （一）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管號葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）蒸餾水（ml）最終濃度（mg/ml）OD540nm00.01.00.010.20.80.220.40.60.430.60.40.640.80.20.851.00.0

4、1.01. 取6個試管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水 實驗操作：2. 向各試管中分別加入DNS試劑1 ml，充分混合，放入沸水浴中加熱煮沸2 min進行顯色，取出試管放入盛有冷水的燒杯中迅速冷卻。3.向各管中分別加入8 ml蒸餾水，充分混合。4.以空白管（0號管）做對照，于540nm 波長下調(diào)0，然后測定各管的OD值。5.以光吸收值作為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果該直線不通過零點，必須重做。 （二）還原糖的制備1. 稱取2g玉米粉，把它放入一個100ml的三角瓶中，然后加入2030ml蒸餾水，攪拌均勻。2. 把三角瓶放于一個50水浴中保溫 30 min，不時

5、攪拌。3. 拿出三角瓶，將三角瓶內(nèi)含物轉(zhuǎn)入50ml的容量瓶中：過濾，定溶，充分混合，濾出液即為還原糖提取液。(三) 樣品總糖的水解和提取 1. 取1g玉米粉，放在100ml三角瓶中，加15ml水溶解，再加10ml 6mol/L 鹽酸，混勻。2. 將三角瓶置于沸水浴中加熱煮沸30 min。3.取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍色。 4.拿出三角瓶，冷卻，過濾，濾出液即為總糖提取液。5.加入3-5滴酚酞指示劑，混勻，用6mol/L的NaOH中和至溶液呈微紅色。將中和后的溶液轉(zhuǎn)入100 ml的容量瓶中定容。（四）樣品中含糖量的測定1. 取5支試管，編號，按下表向每支試管中加入試劑。2. 用管1做對照，測定每管在540nm下的OD值。將結(jié)果記錄在表中。試 劑管 號12345還原糖抽提液（ml）0.00.50.50.00.0總糖抽提液（ml）0.00.00.00.50.5DNS（ml）0.50.50.50.50.5加熱在沸水浴中加熱2分鐘，然后冷卻之。蒸餾水（ml）4.54.04.04.04.0OD540 3. 根據(jù)還原糖和總糖的OD值，使用葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算還原糖和總糖