根癌農(nóng)桿菌介導水稻成熟胚及抗褐飛虱基因植株的獲得

1、根癌農(nóng)桿菌介導水稻成熟胚及抗褐飛虱基因植株的 獲得近年來，褐飛虱遷入中國的蟲量大，由于目前大多數(shù)水稻( Orvza sativa L. )品種不抗蟲，尤其是一些主要的雜交稻品 種，對褐飛虱等蟲害還有“超感蟲性”( hyper-susceptibility)。目前，水稻褐飛虱已經(jīng)成為一種爆發(fā)力強、 對水稻危害性極大的蟲害。 由于褐飛虱的危害多發(fā)生在 水稻成熟灌漿期， 此時若大量使用殺蟲劑， 對水稻的污染會非常 嚴重，這也是中國水稻生產(chǎn)中迫切需要解決的重要問題。 研究證 明，利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中經(jīng) 濟有效的方法。 通過轉(zhuǎn)基因技術與常規(guī)育種技術相結(jié)合培育抗褐 飛虱水稻品

2、種， 有效控制褐飛虱的發(fā)生與危害， 可確保中國水稻 生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展和國家糧食安全。 根癌農(nóng)桿菌( Agrobacterium tumefaciens )介導的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是對天然載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的一種模 仿，已在水稻轉(zhuǎn)基因育種及功能基因組研究中被廣泛應用， 1994 年以后，由于技術上的突破。相繼在不同水稻品種中獲得成功， 轉(zhuǎn)化效率也大大提高，如粳稻的轉(zhuǎn)化率一般在30%左右，最高可達到 64.6%。本研究以育種上應用的典型秈型兩系恢復系M5274和晚粳稻不育系N55S為材料，利用根癌農(nóng)桿菌介導法對褐飛虱 抗性基因 Bph14、Bphi008A 、Osgl 進行遺傳轉(zhuǎn)化，目的是通過 3 個抗褐飛虱基因

3、的導入， 探索水稻抗褐飛虱育種的新途徑， 以期提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。材料與方法植物受體材料兩系恢復系M5274晚粳稻不育系N55S由湖北省農(nóng)業(yè)科學 院糧食作物研究所選育。農(nóng)桿菌菌株與質(zhì)粒載體根癌農(nóng)桿菌菌株 EHA105質(zhì)粒PCAMBIA13O0勺T-DNA區(qū)含 有潮霉素抗性基因（Hygr），抗褐飛虱基因Bph14 Bphi008A、 Osgl 由武漢大學提供。材料勺處理及接種選取健康飽滿無病斑勺成熟種子，除去穎殼，用75%乙醇浸泡1min，然后將種子置于新配制的 0.1%氯化汞溶液中，攪拌 10-12min 。滅菌后用無菌水沖洗 4-5 次，最后將種子取出置于無 菌濾紙上， 待種子表面干燥后， 以

4、平擺法將其接種于各自不同的 誘導培養(yǎng)基上，每瓶 12-14 粒。每個品種接 30 瓶。水稻組織培養(yǎng)粳稻組織培養(yǎng)培養(yǎng)基見表 1,秈稻組織培養(yǎng)基為LY培養(yǎng)基， 購自武漢博遠生物科技 XX公司。將成熟胚表面按“1.3 ”的方法 消毒后接種于愈傷組織的誘導培養(yǎng)基上。農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及其介導的水稻轉(zhuǎn)化 根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及其介導的轉(zhuǎn)化過程參照 Hiei 等的方法。1）劃菌：取轉(zhuǎn)化后經(jīng)檢測有所需載體的農(nóng)桿菌保存菌液5-10卩L,至YEB（加入濃度為100mg/L的卡那霉素）的固體培 養(yǎng)基上涂板，30C黑暗培養(yǎng)，直到長出單菌落。將單菌落二次劃 線培養(yǎng)農(nóng)桿菌24-36h，刮菌體于懸菌培養(yǎng)基中，30C 180r/mi

5、n 搖菌3-4h，調(diào)整菌液OD600nn至所需值。2）侵染：用懸浮培養(yǎng)基稀釋菌液，直到OD6OOnm為0.1-0.9 , 將含農(nóng)桿菌菌液倒入已放好愈傷的培養(yǎng)瓶中，根據(jù)菌液濃度在30C搖床上侵染5-30min。倒掉菌液，用滅菌的濾紙將菌液吸干， 用鑷子把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，20C黑暗培養(yǎng)48-72h 。3）洗菌：把共培養(yǎng)基上的愈傷組織轉(zhuǎn)入滅菌三角瓶中，用 無菌水清洗 5-6 次，直到水不再渾濁。然后加入滅菌水（含有 500mg/L 頭抱霉素）120r/min28 C搖菌 15-20min。4）晾干愈傷：把水倒掉，把愈傷組織轉(zhuǎn)移到放有滅菌濾紙 的培養(yǎng)皿中，在超凈臺吹 40-50nin 。

6、5）把晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)， 分別進行一輪和兩輪篩選培養(yǎng)。 每輪 25d 左右，比較篩選的有效 性。6）把篩選出的抗性愈傷組織進行預分化、 分化和生根培養(yǎng)。1.6轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR鑒定1.6.1轉(zhuǎn)基因植株總DNA的提取 按CTAB法從水稻新鮮葉片 中提取總 DNA。162潮霉索抗性基因的PCR僉測 根據(jù)轉(zhuǎn)化載體中Hygr基 因DNA片段的序列設計引物進行 PC新增，PCR引物為Primerl (5-GCCTGACCTATTG-CATCTCC)-3、 Primer2(5-CCTCGCTCCAGTCAAT-GACC-3 PCR反應體系：總體系為 20txL , DNA模

7、板 50ng, 10 xbuffer2 , 0卩 L, 2mmol/L dNTP1.5y L, 25mmol/L MgCI22.0 卩 L, 10 mol/L 引物各 0.4 卩 L, Taq 酶 1U。 加滅菌ddH2O至 20卩L。PCR反應程序：94C變性3min： 94C變 性 1min, 56C退火 1min, 72C延伸 1.5min , 35 個循環(huán)：72C延 伸5min。1.6.3 目的基因Bph14的檢測 根據(jù)Bph14基因序列設計引物，檢測水稻的基因組 DNA中是否含有該基因。PCR 擴增引物：正向 5 -GGCAGATCATCACCAACTCC-反向5 -GGCGACTG

8、CGAATGCTAT-產(chǎn)物大小為 566bp。PCF反應體 系：總體系為 20卩 L, DNA模 板 50ng, 10X buffer2.0 x L。 2mmoI/LdNTP1? 5卩 L, 25mmoI/LMgCI22.0X L,10 卩 mol/L 引物各0.4 a L, Taq酶1U,加滅菌ddH2O至 20卩L。PCR反應程序： 94C。變性 5min： 94C，變性 1min。58C退火 1min, 72C延伸 1min, 35 個循環(huán)：72C延伸 5min。結(jié)果與分析2.1粳稻N55s轉(zhuǎn)基因植株的獲得根癌農(nóng)桿菌介導粳型稻N55S只進行第一輪篩選后，分化生根，獲得轉(zhuǎn)Bph14基因的總

9、苗數(shù)為40株，陽性株數(shù)21株，陽性 植株比率為 52.5%：獲得轉(zhuǎn) Bphi008A 基因的再生苗 16 株，其中抗性植株 5株，陽性植株比率為 31.3%：獲得轉(zhuǎn) Osgl 基因的再 生苗 35 株，其中陽性植株 12 株。陽性植株比率為 34.3%。進行 兩輪篩選后。分化生根。獲得轉(zhuǎn) Bph14基因總苗數(shù)為45株，其 中陽性植株 27株，陽性植株比率為 60.0%：獲得轉(zhuǎn) Bphi008A 基 因總苗數(shù) 22 株，其中陽性株數(shù)為 8 株，陽性植株比率為 36.4%： 獲得轉(zhuǎn) Osgl 基因總苗數(shù) 94株，其中陽性植株 36 株，陽性植株 比率為38v3%（表2）。根癌農(nóng)桿菌介導粳型稻 N5

10、5S轉(zhuǎn)抗褐飛虱 基因的結(jié)果表明，不論是一輪篩選還是兩輪篩選，Bph14基因轉(zhuǎn)化效率最高，Bphi008A基因轉(zhuǎn)化效率最低，Osgl基因轉(zhuǎn)化效率 居中，但 Bphi008A 基因與 Osgl 基因轉(zhuǎn)化效率相差不大。2.2秈稻M5274轉(zhuǎn)基因植株的獲得根癌農(nóng)桿菌介導秈型稻 M5274經(jīng)第一輪篩選后，分化生根， 獲得轉(zhuǎn)Bph14基因總苗數(shù)46株，陽性株數(shù)35株，陽性植株比率 為 76.1%：獲得轉(zhuǎn) Bphi008A 基因 26株轉(zhuǎn)基因苗，其中抗性植株 2株，陽性植株比率為 7.7%；獲得轉(zhuǎn) Osgl 基因 19株轉(zhuǎn)基因苗， 陽性植株 6株，陽性植株比率為 31.6%。第二輪篩選后，獲得轉(zhuǎn) Bph14

11、基因再生苗數(shù)為67株，其中陽性植株55株。陽性植株比 率為 82.1%：獲得轉(zhuǎn) Bphi008A 基因再生苗數(shù) 8株，其中陽性株 數(shù)為 2 株。陽性植株比率為 25.0%：獲得轉(zhuǎn) Osgl 基因再生苗 97 株，其中陽性植株 35株，陽性植株比率為 36.1%（表 3）。與前 面結(jié)果類似，根癌農(nóng)桿菌介導秈型稻 M5274轉(zhuǎn)抗褐飛虱基因試驗 中，增加篩選可以提高獲得陽性再生苗的比例，且Bph14基因轉(zhuǎn) 化效率最高。其次是 Osgl 基因， Bphi008A 基因轉(zhuǎn)化效率最低。2.3 PCR 檢測 為了獲得轉(zhuǎn)基因的直接證據(jù)，提取了轉(zhuǎn)基因植株的葉片總DNA除了進行了 PCRT增檢測潮霉索抗性基因 H

12、ygr夕卜。部分轉(zhuǎn) 化Bph14基因的材料還檢測了目的基因。 結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株 中均能擴增到566bp潮霉素抗性基因Hygdr的DNA條帶，呈陽性 反應，而未轉(zhuǎn)基因植株則沒有擴增到 DNA條帶（圖1），從而證 明目的基因已整合到轉(zhuǎn)基因植株中。討論農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化技術是水稻基因轉(zhuǎn)化的首選方式。 農(nóng) 桿菌介導轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)點是轉(zhuǎn)化效率高。 轉(zhuǎn)基因重排比例少， 插 入拷貝數(shù)少。 單拷貝數(shù)植株比例高。 影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素 有菌株類型、水稻基因類型、 培養(yǎng)基成分組成、 組織培養(yǎng)條件等。 不同水稻品種需要不同的轉(zhuǎn)化條件， 愈傷組織經(jīng)過多代培養(yǎng)后易 產(chǎn)生體細胞突變，不利于轉(zhuǎn)化體的篩選：同時，多代培養(yǎng)后愈傷 組織衰老死亡， 轉(zhuǎn)化效率降低。 作者曾將未經(jīng)繼代培養(yǎng)的愈傷組 織進行轉(zhuǎn)化， 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率也很低， 這說明細胞的周期狀態(tài)影響 轉(zhuǎn)化效率。已有研究表明，當愈傷組織處于細胞周期S期和G2期的比例最高時，轉(zhuǎn)化效率最高，S期是細胞DNA復制期。此時轉(zhuǎn)化有利于轉(zhuǎn)入的T-DNA鏈轉(zhuǎn)變成雙鏈，增加遺傳和整合的穩(wěn)定 性。黃紅梅等研究結(jié)果表明，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng) 6-7d 后轉(zhuǎn) 化率高達 95%，