染料木素的抗誘變性檢測(cè)

1、染料木素的抗誘變性檢測(cè)染料木素是一種從大豆種子中發(fā)現(xiàn)的重要營(yíng)養(yǎng)成分， 屬于黃 酮類植物雌激素， 黃酮類植物雌激素是一類具有苯環(huán)與色酮環(huán)基 本結(jié)構(gòu)的化合物。 目前研究已發(fā)現(xiàn)黃酮類植物雌激素具有多種生 理活性作用，對(duì)激素依賴性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌 等有防治作用，同時(shí)還具有抗氧化、抗輻射和免疫調(diào)節(jié)等作用 1-2 。通過(guò)流行病學(xué)和動(dòng)物模型研究也發(fā)現(xiàn)，染料木素與一系 列潛在的有益健康的生理作用有關(guān)， 其中包括防治乳腺癌、 前列 腺癌、心血管疾病和絕經(jīng)后疾病等 3-5 。小鼠淋巴瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是一種用于初篩誘變劑和致癌物質(zhì)的體外實(shí)驗(yàn)。目前常用于檢測(cè)化合物抗誘變性的實(shí)驗(yàn)有Ames實(shí)驗(yàn)、彗星實(shí)驗(yàn)、微核

2、試驗(yàn)、 HPRT基因突變實(shí)驗(yàn)、染色體畸變實(shí) 驗(yàn)等，由于這些實(shí)驗(yàn)一般僅能檢測(cè)到單一的遺傳毒性效應(yīng)， 故通 常需要一組實(shí)驗(yàn)以全面評(píng)價(jià)受試物的遺傳毒性。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)不僅可以檢測(cè)出點(diǎn)突變、 小缺失、重組等小范圍的基因突變， 還能檢測(cè)出包括 tk 位點(diǎn)在內(nèi)的大的缺失、染色體畸變等大范圍 的損傷，因此將小鼠淋巴瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用于誘變性檢測(cè)具有高靈敏 性、檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。 目前關(guān)于小鼠淋巴瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用于化學(xué) 物的抗誘變性評(píng)價(jià)， 除本實(shí)驗(yàn)室已做過(guò)一些相關(guān)工作外， 其他的 研究報(bào)道尚不多見。 本研究利用小鼠淋巴瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)染料木 素的抗誘變性， 一方面為其開發(fā)和利用提供安全性依據(jù)， 另一方 面也可為將

3、小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)應(yīng)用于抗誘變性檢測(cè)累積更多 的資料。1 材料與方法細(xì)胞系L5178Y 3.7.2C tk+/- 細(xì)胞，由日本國(guó)立研究所本間正充提 供。細(xì)胞培養(yǎng)使用含10焙血清，200 u g/mL丙酮酸鈉，100 U/mL青霉 素和100 u g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)于 37C, 5%二氧化碳（CO2培養(yǎng)箱中。受試物染料木素購(gòu)于成都市藥品生物制品研究所， 使用時(shí)用二甲基 亞砜（DMSO將其溶解成不同濃度溶液。染料木素的抗誘變性檢測(cè)1.4.1試劑 甲基磺酸甲酯（MMS、絲裂霉素C（MMC、RPMI 1640培養(yǎng)基、馬血清、三氟胸苷（TFT）、丙酮酸鈉、二 甲基亞砜（DM

4、SO、次黃嘌呤、甘氨酸、甲氨蝶呤、胸腺嘧啶核 苷、維生素 C（VitC ）均購(gòu)于 Sigma 公司。1.4.2劑量設(shè)計(jì) 預(yù)實(shí)驗(yàn)中，利用 MM（作為誘變劑，采用同 時(shí)處理方式（MMCf染料木素同時(shí)作用 L5178Y細(xì)胞3 h）確定實(shí) 驗(yàn)劑量。當(dāng)染料木素為0.625 u g/mL時(shí)，相對(duì)懸浮生長(zhǎng)率（RSG 較小，為45%48%表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性。因?yàn)榭紤]在多數(shù)情況下，RSGRS上述處理情況下的 RS可能在10%- 20%勺理想范 圍內(nèi)，因此染料木素正式試驗(yàn)的劑量定為0.078、0.156、0.312、0.625卩g/mL（陽(yáng)性誘變組），另外再設(shè)一個(gè)陽(yáng)性誘變對(duì)照組 （MMS 5卩g/mL或MMC 0

5、.5卩g/mL）、溶劑對(duì)照組（0.5% DMSO和陰 性對(duì)照組（純水）以及抗誘變陽(yáng)性對(duì)照組 （VitC 100卩g/mL+ MMS 5 卩 g/mL 或 MMC 0.5 卩 g/mL）。清除自發(fā)突變 參照文獻(xiàn) 7 進(jìn)行。受試物處理細(xì)胞 將L5178Y細(xì)胞調(diào)至2X 105個(gè)/mL, 每瓶10 mLo在抗誘變實(shí)驗(yàn)中，采用前處理、同時(shí)處理和后處理3種處理方式，按1%加入不同濃度受試物（染料木素）和MM或MMC前處理時(shí)，先加入受試物處理3 h再加入MM或MM（處理3 h ;同時(shí)處理時(shí)，受試物和 MMS或 MM（同時(shí)處理細(xì)胞3 h ;后 處理時(shí)，先加入 MMS或 MM（處理3 h再加入受試物處理細(xì)胞 3

6、 h。 處理結(jié)束后，1000 r/min離心10 min，棄上清液，用 PBS緩沖 液洗滌細(xì)胞 2 次，重新懸浮細(xì)胞于含 10%馬血清的 RPMI 1640培 養(yǎng)液中，并調(diào)整細(xì)胞密度到 2X 105個(gè)/mLo1.4.5平板接種效率測(cè)定 將上述細(xì)胞梯度稀釋至 8個(gè)/mL, 按每孔0.2 mL接種96孔培養(yǎng)板，每一劑量接種1塊平板。于 37 C、5%CO飽和濕度條件下培養(yǎng)14 d后，計(jì)數(shù)每塊培養(yǎng)板有 集落生長(zhǎng)的孔數(shù), 計(jì)算第 0天的平板接種效率 （PE0）o“1.4.4 ” 中剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 2 d，每天計(jì)數(shù)并維持細(xì)胞密度在 1 X 106 個(gè)/mL以下。表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，按上述 PE0方法測(cè)定培

7、養(yǎng)2 d的平板接種效率（ PE2）1.4.6 表達(dá)培養(yǎng) 將“ 1.4.4 ”中的剩余細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為2X 105個(gè)/mL,表達(dá)培養(yǎng)2 d，同時(shí)每隔24 h計(jì)數(shù)1次，并 調(diào)整細(xì)胞密度為2X 105個(gè)/mL，計(jì)算相對(duì)懸浮生長(zhǎng)率（RSG。147總突變頻率（TMF測(cè)定取經(jīng)表達(dá)培養(yǎng)2 d的細(xì)胞， 將細(xì)胞密度調(diào)整為1X 104個(gè)/mL,按1%加入100X TFT,使其終 濃度為3卩g/mL,然后將細(xì)胞懸液加到 96孔板中，每孔加200 卩L,即每孔有2000個(gè)細(xì)胞。每個(gè)劑量組做 2個(gè)平行平板，在 5%CO2 37C飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 d后，肉眼計(jì)數(shù)每塊平板 的集落生長(zhǎng)孔數(shù)。148計(jì)算方法PE0和

8、PE2 （第0天、第2天平板效率）、 RS （相對(duì)存活率）、RSG RTG（相對(duì)總生長(zhǎng)率）、TMF等計(jì)算方 法和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn) 8 。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在英國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)指南推薦的Mutant （tm）軟件中，使用Dunnett t檢驗(yàn)對(duì)TMF進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以PMMC乍為誘變劑時(shí)，染料木素各劑量組 RS RSG和RTG高于陽(yáng)性誘變對(duì)照 組（MMG3.5卩g/mL）,表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，染料木素可拮抗 MMC勺細(xì)胞毒性作用。在前處理?xiàng)l件下，染料木素各劑量組與陽(yáng) 性誘變對(duì)照組比較TMF降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PGrzesiuk E. The role of mutation frequ

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