熒光光度法測定維生素B

1、實驗、熒光光度法測定維生素B2一、實驗?zāi)康?.掌握熒光光度分析的基本原理。2.掌握熒光光 度計的基本結(jié)構(gòu)及操作技術(shù)。了解熒光光度計的應(yīng)用。二、實驗原理某些物質(zhì)經(jīng)紫外光照射能發(fā)出比原激發(fā)光的頻率低，波長長的 可見光，這種光稱為熒光。各種物質(zhì)經(jīng)紫外光激發(fā)后能發(fā)出的熒光 特性與物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。在激發(fā)光強度和所通過的溶液厚度不 變時，在一定濃度范圍內(nèi)該物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光強度可用下式表示： b5E2RGbCAPIF =2.3 K KbcI0 當(dāng) I0 一定時，IF =Kc式中K取決于熒光效率，回是熒光分子的摩爾吸光系數(shù)，b是 液梢厚度，c是熒光物質(zhì)的濃度。由此可見光在一定條件下，熒光 強度與物質(zhì)的濃度

2、呈線性關(guān)系。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)與待測樣品同樣 操作，通過測定熒光強度 F),按前述的標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)對照 法，求得待測物質(zhì)的濃度。plEanqFDPw維生素B2,又叫核黃素，是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶。維生素 B2 易溶于水而不溶于乙醍等有機溶劑。在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光 照易分解，對熱穩(wěn)定。DXDiTa9E3d維生素B2水溶液在470nm或紫外光照射下會發(fā)生綠色熒光，熒 光峰在520nm 在pH 57的溶液中熒光強度最大，在 pH 11的堿 性溶液中熒光消失。多維葡萄糖中含有維生素B1, B2, C, D2及葡萄糖均不干擾維生素 B2的測定。由于維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光 線照射，會發(fā)生光分解而

3、轉(zhuǎn)化為光黃素，后者的熒光比核黃素的熒 光強的多。因此，測量維生素 B2的熒光時，溶液要控制在酸性范圍 內(nèi)，且須在避光條件下進行。RTCrpUDGiT 三、儀器和試劑.熒光分光光度計2. 40 wg/mL維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取10.0mg維生素B2,用 熱蒸儲水溶解后，轉(zhuǎn)入 250mL棕色容量瓶中，冷卻后加蒸儲水至標(biāo) 線，搖勻，置于暗處保存。5PCzVD7HxA 四、實驗步驟.激發(fā)光譜的測定及最佳激發(fā)波長的選擇固定檢測發(fā)射）波長520nm用400 - 500 nm的光激發(fā)，找 出最佳激發(fā)波長.熒光光譜曲線的測定于50mL容量瓶中，加入40區(qū)g/mL維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液 2.00mL,加水至標(biāo)

4、線，搖勻。在熒光分光光度計上，用 1cm熒光比 色皿，激發(fā)波長470nm發(fā)射波長為480 - 580nm 范圍內(nèi)，測量溶 液的熒光強度，并繪制熒光光譜曲線。jLBHrnAILg 3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制于6只50mL容量瓶中，分別加入40g/mL維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、5.00mL,加水至標(biāo)線，搖勻。在熒光分光光度計上，用 1cm熒光比色皿于激發(fā)波長 440nm發(fā)射波 長520nm處，測量標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強度 ，并繪制標(biāo)準(zhǔn)（工作 曲 線。xHAQX74J0X4.未知維生素B2溶液的分析五、數(shù)據(jù)處理以相對熒光強度為縱坐標(biāo)，熒光發(fā)射波長為橫坐標(biāo)繪制熒光光譜曲

5、線。以相對熒光強度為縱坐標(biāo)，維生素 B2的質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制各標(biāo) 準(zhǔn)曲線。未知溶液的分析。五、實驗數(shù)據(jù)處理一）維生素 B2的激發(fā)光譜圖 固定發(fā)射波長為 520nm用400-500nm的光激發(fā)）Wavelength (nm)由圖知，維生素B2的最佳激發(fā)波長約為450nm以改波長作為之后熒光光譜的激發(fā)波長；二）熒光光譜曲線的繪制熒光光譜測定的實驗條件如下:Instrument:RF-5301Spectrum Type: EMScan Range:480.0nm to 580.0nmEX Wavelength:450.0nmLDAYtRyKfESample Pitch:1.0Slit Width:EX

6、:3.0nmEM:5.0nmScan Speed:SuperSensitivity:HighResponse Time: Auto Shutter:Manual, Open以下熒光光譜曲線為濃度為1.6 pg/mL的維生素B2溶液的曲線三）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制發(fā)光強度選定波長為520nm有1-5號溶液的濃度與熒光強度如下表12345濃度0.40.81.21.62.0/ug/mL熒光強度221.433429.134602.881834.8721016.057繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:標(biāo)準(zhǔn)曲線12001000y = 498.75x + 22.38 = 0.9985濃度/ug/mL由曲線可求得，在實驗條件下，維生素B2的熒光強度與濃度的關(guān)系的方程式為，I=498.75c+22.38四）未知維生素B2溶液的分析實驗測得未知維生素B2溶液在上述實驗條件下的，在 520n碗的熒光強度為446.839;