胰蛋白酶分離純化與動力學(xué)研究

1、0北京理工大學(xué)珠海，學(xué)院ZH UHAI CAMPU S.BEI JING IHSIITUTE OF TECHh OLD GY實驗論文胰蛋白酶的分離純化及動力學(xué)研究學(xué)院：化工與材料學(xué)院專生物工程姓名：學(xué) 號：班指導(dǎo)老師：中國珠海二O六年四月誠信承諾書本人鄭重承諾：本人承諾呈交的畢業(yè)設(shè)計胰蛋白酶的分離純化及動 力學(xué)研究是在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下，獨(dú)立開展研究取得的成果，文中 引用他人的觀點(diǎn)和材料，均在文后按順序列出其參考文獻(xiàn)，設(shè)計使用 的數(shù)據(jù)真實可靠。本人簽名：日期：年一月一日胰蛋白酶的分離純化及動力學(xué)研究摘要本實驗通過用有機(jī)溶劑沉淀法和離心法提取胰蛋白酶的專一性抑制劑-雞卵類粘蛋白（CHOM）作為親和

2、配基，運(yùn)用了 Bradford法定量測定蛋白質(zhì)濃度再利用親和層析法 對胰蛋白酶進(jìn)行分離純化，然后通過用抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響來了解酶促反應(yīng)，掌 握其規(guī)律，為了最大限度地實現(xiàn)酶促反應(yīng)的高效率、尋找最有利的反應(yīng)條件以及了解酶 在代謝中的作用和某些藥物的作用機(jī)理等，都需要掌握酶促反應(yīng)速度的規(guī)律。最后通過 聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行酶純度檢驗以及其相對分子量的測定。關(guān)鍵詞：胰蛋白酶；雞卵粘蛋白；親和層析法；米氏常數(shù)；酶促反應(yīng)動力；聚丙烯酰胺凝膠電泳I / 31Trypsin of isolation and purification and dynamic researchAbstractThis ex

3、periment through with organic solvent precipitation method and centrifugal method extraction trypsin of specific sex inhibitors-chicken eggs class stick protein (CHOM) as Affinity distribution base, using has Bradford method quantitative determination protein concentration again using affinity chrom

4、atography method on trypsin for separation purification, then through with inhibitors on enzyme reaction speed of effect to understand enzyme promoting reaction, master its law, to maximum to achieved enzyme promoting reaction of efficient, and To find the most favorable conditions and the role of t

5、he enzyme in the metabolic mechanism and effect of certain drugs, needs to master the law of speed of enzymatic reactions. Finally, polyacrylamide gel electrophoresis of enzyme purity test and the determination of its molecular weight.Key words: trypsin; egg protein; affinity chromatography;-Menten

6、constant; enzymatic reaction force; Polyacrylamide gel electrophoresisII / 31目錄 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 摘要IIAbstractI.LLL目錄LLLLII1前言11 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 研究背景1.1. HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 胰蛋白酶簡要介紹 1.11.3蛋白分離純化方法綜述 沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法.蛋白

7、質(zhì)沉淀齊I聚乙二醇沉淀作用選擇性沉淀法1.1.1.1.錯誤!未定義書簽。錯誤！未定義書簽。2.2錯誤!未定義書簽。錯誤！未定義書簽。2.22.2 HYPERLINK l bookmark24 o Current Document 吸附層析22吸附柱層析 錯誤!未定義書簽。錯誤！未定義書簽薄層層析錯誤!未定義書簽。錯誤！未定義書簽聚酰胺薄膜層析 錯誤!未定義書簽。錯誤！未定義書簽 HYPERLINK l bookmark30 o Current Document 離子交換層析 33 HYPERLINK l bookmark32 o Current Document 凝膠過濾33 HYPERLIN

8、K l bookmark34 o Current Document 親和層析 33 HYPERLINK l bookmark36 o Current Document 聚焦層析 44 HYPERLINK l bookmark38 o Current Document 氣相色譜44 HYPERLINK l bookmark40 o Current Document 高效液相色譜 .44 HYPERLINK l bookmark42 o Current Document 1.4胰蛋白酶研究進(jìn)展 .44 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 2實驗原理6

9、6 HYPERLINK l bookmark46 o Current Document 胰蛋白酶的親和配基-雞卵粘蛋白的分離與定量 66 HYPERLINK l bookmark48 o Current Document 蛋白質(zhì)沉淀66鹽析66 HYPERLINK l bookmark50 o Current Document 蛋白質(zhì)定量66 HYPERLINK l bookmark52 o Current Document 親和層析法分離純化胰蛋白酶 66 HYPERLINK l bookmark54 o Current Document 親和層析法的各項要素 66 HYPERLINK l

10、bookmark56 o Current Document 親和層析法介紹7.7 HYPERLINK l bookmark58 o Current Document 胰蛋白酶活性測定77 HYPERLINK l bookmark60 o Current Document 酶動力學(xué)研究88米氏方程88 HYPERLINK l bookmark62 o Current Document 抑制動力學(xué)88 HYPERLINK l bookmark64 o Current Document 聚丙烯酰氨凝膠電泳88PAGE凝膠的組成 88 HYPERLINK l bookmark66 o Current

11、Document 電泳的濃縮作用88PAGE染色及干燥 99 HYPERLINK l bookmark68 o Current Document 3實驗材料（設(shè)備）1010 HYPERLINK l bookmark70 o Current Document 3.1實驗材料.1010III / 31 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark72 o Current Document 實驗原料1010實驗原料來源 1010凝膠配置 1010Disc/SDS分離膠(T=12%,C=3%)配方1010Disc/SDS濃縮膠(T=5%Acrylamide,C=3% )配方 1

12、.0.10 HYPERLINK l bookmark74 o Current Document .實驗試劑 10 10 HYPERLINK l bookmark76 o Current Document 實驗主要設(shè)備與儀器 1111 HYPERLINK l bookmark80 o Current Document 4實驗方法12.12 HYPERLINK l bookmark78 o Current Document 實驗流程示意圖 12 12 HYPERLINK l bookmark82 o Current Document 胰蛋白酶的親和配基-雞卵粘蛋白的分離與定量1 313有機(jī)溶劑沉淀

13、法 1.3 13TCA 沉淀法13 13 HYPERLINK l bookmark86 o Current Document 高速離心法1313 HYPERLINK l bookmark88 o Current Document 4.2.1蛋白質(zhì)鹽脫13134.2.1 Bradford法定量蛋白質(zhì) 1313 HYPERLINK l bookmark90 o Current Document 親和層析法分離純化胰蛋白酶 1313N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)法1313 HYPERLINK l bookmark94 o Current Document 酶動力學(xué)研究14 14雙倒數(shù)作圖法(

14、Lineweaver-Burk)測定 Km1414聚丙烯酰氨凝膠電泳 1.4 14 HYPERLINK l bookmark98 o Current Document 蛋白質(zhì)相對分子量的測定 1414 HYPERLINK l bookmark100 o Current Document 5實驗結(jié)果與分析討論 1515 HYPERLINK l bookmark102 o Current Document 胰蛋白酶的親和配基-雞卵粘蛋白的分離與定量1 515 HYPERLINK l bookmark104 o Current Document 親和層析法分離純化胰蛋白酶 1616 HYPERLIN

15、K l bookmark106 o Current Document 酶動力學(xué)研究18 18聚丙烯酰氨凝膠電泳 1.9 19 HYPERLINK l bookmark112 o Current Document 7結(jié)論2121 HYPERLINK l bookmark114 o Current Document 參考文獻(xiàn)2222 HYPERLINK l bookmark116 o Current Document 附錄2323IV / 311刖言研究背景蛋白質(zhì)分離純化是用生物工程下游技術(shù)從混合物之當(dāng)中分離純化出所需要得目的 蛋白質(zhì)的方法。是當(dāng)代生物產(chǎn)業(yè)當(dāng)中的核心技術(shù)。該技術(shù)難度、成本均高。膜逐

16、漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液中析出。 / 31蛋白質(zhì)在細(xì)胞和生物體的生命活動過程中(包括催化代謝反應(yīng)、物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)、興奮的傳導(dǎo)、生長發(fā)育的控制等)起著重要的作用，因此，蛋白質(zhì)是生命科學(xué)極為重要的研 究對象。蛋白質(zhì)的分離純化是蛋白質(zhì)研究中不可缺少的環(huán)節(jié)，只有了解蛋白質(zhì)的分子量、溶解性、等電點(diǎn)以及穩(wěn)定性等基本性質(zhì)，才能達(dá)到有效分離。2酶促反應(yīng)動力學(xué)(kinetics enzyme-catalyzed reactions.)主要研究各種理化因素對酶 促反應(yīng)速度的影響。在酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及酶作用機(jī)理的研究中，需要動力學(xué)研究 提供實驗證據(jù)。為了最大限度地實現(xiàn)酶促反應(yīng)的高效率、尋找最有利

17、的反應(yīng)條件以及了 解酶在代謝中的作用和某些藥物的作用機(jī)理等，都需要掌握酶促反應(yīng)速度的規(guī)律。因此,酶促反應(yīng)動力學(xué)是酶學(xué)研究中的一個既具有重要理論意又具有實踐意義的課題。影響酶促反應(yīng)速度的因素主要有底物的濃度、酶的濃度、溫度、 pH值、酶的激活劑及抑制劑胰蛋白酶簡要介紹胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme)為蛋白酶的一種，EC 3.4.4.4,是從牛、羊、豬的胰 臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是作為 酶的前體胰蛋白酶原而被合成的。作為胰液的成分而分泌，受腸激酶，或胰蛋白酶的限 制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的

18、竣 基側(cè)切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、竣肽酶原、磷脂酶 原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列 中，它成為不可缺少的工具1蛋白分離純化方法綜述沉淀法沉淀法也稱溶解度法。其純化生命大分子物質(zhì)的基本原理是根據(jù)各種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差 異性來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致有效成分的溶解度發(fā)生變化。鹽析法鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當(dāng)鹽濃 度增高到一定數(shù)值時，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；具 二、有機(jī)溶

19、劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。蛋白質(zhì)沉淀劑蛋白質(zhì)沉淀劑僅對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和 重金屬等。聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酊硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。選擇性沉淀法根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子作用下穩(wěn)定性不同的特點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)倪x擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中，從而達(dá)到純化有 效成分的目的。吸附層析吸附柱層析吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動相構(gòu)成柱的一種 層析方法。薄層層析薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析

20、方法是把吸附劑等物質(zhì)涂布于載體上形成薄層，然后按紙層析操 作進(jìn)行展層。聚酰胺薄膜層析聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強(qiáng)2 / 31弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在 聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、 解吸附、再吸附、再解吸附的連續(xù)過程，就能導(dǎo)致分離物質(zhì)達(dá)到分離目的。離子交換層析離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交 換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的 反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或借助離子交換劑上

21、電荷基團(tuán)對溶液中離子或離子化合 物的吸附作用進(jìn)行。凝膠過濾凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部, 而大分子物質(zhì)卻被排除在外部。當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質(zhì)就 按不同分子量篩分開了。親和層析親和層析的原理與眾所周知的抗原-抗體、激素-受體和酶-底物等特異性反應(yīng)的機(jī)理 相類似，每對反應(yīng)物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應(yīng)中，特異的底物（S） 才能和一定的酶（E）結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物（E-S） 一樣。在親和層析中是特異的配體才能 和一定的生命大分子之間具有親和力，并產(chǎn)生復(fù)合物。而親和層析與酶-底物反應(yīng)不同的是，前者進(jìn)行反應(yīng)時，配體（類似底物）

22、是固相存在；后者進(jìn)行反應(yīng)時，底物呈液相 存在。實質(zhì)上親和層析是把具有識別能力的配體 L （對酶的配體可以是類似底物、抑制 劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團(tuán)的基質(zhì) M （如活化瓊脂糖等）上，制 成親和吸附劑M-L ,或者叫做固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質(zhì)的能力。 因此，當(dāng)把固相載體裝人小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體積）后，讓欲分離的樣品液 通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質(zhì) S就可借助靜電引力、范德瓦爾力，以及 結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質(zhì)則被起始緩沖 液洗滌出來，并形成了第一個層析峰。然后，恰當(dāng)?shù)馗淖兤鹗季彌_液的pH值、或增加離

23、子強(qiáng)度、或加入抑制劑等因子，即可把物質(zhì)S從固相載體上解離下來，并形成了第M 個層析峰。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質(zhì)滿意地分離開。如果樣品液 中存在兩個以上的物質(zhì)與固相載體具有親和力（其大小有差異）時，采用選擇性緩沖液 進(jìn)行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經(jīng)再生處理后，可以重復(fù)使用。上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析 法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復(fù)雜的生命大 分子物質(zhì)（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具有較強(qiáng)的吸附選擇性和較大的結(jié)合 力。而后者的配體則一般為簡單的小分子物質(zhì)（如金屬、染料，以及氨基酸

24、等），它成 本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率。3 / 31聚焦層析聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動 相為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。聚焦層析原理可以從pH梯度溶液的形成、蛋白質(zhì)的行為和聚焦效應(yīng)三方面來闡述。氣相色譜多種組分的混合樣品進(jìn)入色譜儀的氣化室氣化后呈氣態(tài)。當(dāng)載氣流入時，氣化的物 質(zhì)被帶人色譜柱內(nèi)，在固定相和流動相中不斷地進(jìn)行分配.在理想狀態(tài)下，溶質(zhì)于氣 液兩相間的分配可用分配系數(shù) Kg描述。當(dāng)分配系數(shù)小時，溶質(zhì)在柱中就停留時間短， 也即滯留因子（Rf）大，所以它將首先從色譜柱流出而進(jìn)入鑒定器， 經(jīng)放大系統(tǒng)放

25、大后， 輸出訊號便在記錄儀中自動記錄下來，這時呈現(xiàn)的圖形為色譜圖，亦稱色譜峰；當(dāng)分配 系數(shù)大時，溶質(zhì)在柱中停留時間就長，其色譜圖在記錄儀上后出現(xiàn)。由于不同物質(zhì)有不 同的分配系數(shù)，所以將一混合樣品通過氣-液色譜柱時，其所含組分就可得到分離。氣相色譜柱效率高、分辨率強(qiáng)的重要原因是，理論塔板數(shù)（N）大。毛細(xì)管氣相色譜的N可達(dá)1056）o增加理論塔板數(shù)和降低樣品組分的不同分子在展層中擴(kuò)展程度（速 率理論），就可明顯地提高柱效。高效液相色譜高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相 高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類 型。用不同類型

26、的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應(yīng)的普通液 相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且 須在色譜儀中進(jìn)行。高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)， 下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。1.4胰蛋白酶研究進(jìn)展胰蛋白酶為蛋白質(zhì)水解酶，能選擇地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的竣基所構(gòu)成 的肽鏈，能消化溶解變性蛋質(zhì)，對未變性的蛋白質(zhì)無作用，因此，能使膿、痰液、血凝 塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創(chuàng)面凈化，促進(jìn)肉芽組織新生，此外還有抗炎癥 作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘦管等所產(chǎn)生的局部水月

27、中、 血月中及膿月中等。噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。還常用于動物細(xì) 胞培養(yǎng)前對組織的處理。胰蛋白酶不僅是一種重要的消化酶， 而且對胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶前體的活性化 等其重要作用。胰蛋白酶也是一種重要的工具酶，特別在生物化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞4 / 31 生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，利用胰蛋白酶可將大分子蛋白質(zhì)酶解成小分子多肽片段以用于質(zhì)樸分析、動物細(xì)胞培養(yǎng)、制備人胰島素等 。蛋白質(zhì)間的專一性吸引 力，已成為最近生物化學(xué)探討的重要主題。5 / 312實驗原理胰蛋白酶的親和配基-雞卵粘蛋白的分離與定量蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)變性后，疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融匯相互纏繞繼而聚集

28、，從溶液中析出沉 淀。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性(如鹽析法沉淀)。鹽析在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽(如硫酸俊、硫酸鈉、氯化鈉等)，破壞蛋白 質(zhì)的膠體穩(wěn)定性(蛋白質(zhì)脫去水化膜)，使蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀。鹽析法不引起蛋白質(zhì)變性，只需經(jīng)透析除去鹽分，即可得到較純的保持原活性的蛋 白質(zhì)。蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)定量是最基本的生化操作，方法很多，但其原理都還是基于蛋白質(zhì)分子的基 本構(gòu)造。早先使用Biuret method,是根據(jù)蛋白質(zhì)骨架與銅離子結(jié)合，利用所產(chǎn)生的還原 力顯色；而 Lowry method是以Biuret method為基礎(chǔ)，再加上蛋白質(zhì)中 Trp側(cè)基的顯 色，使得分析更

29、為靈敏。最近則使用染料Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBG);當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與CBG結(jié)合之后，CBG由茶色變成藍(lán)色，顯色濃淡與蛋白質(zhì)量成正比，稱為 Bradford method。親和層析法分離純化胰蛋白酶親和層析法的各項要素配體Ligand(A)B(3)偶聯(lián)反應(yīng)Coupling Reaction(4)溶離Elution(1)專一性結(jié)合4bSpecific BindingSubstance(B)圖親和層析法的各項要素6 / 31親和層析法介紹X X Washing (2)用 B Elution(3)圖親和層析法的作用機(jī)理A+B=AB,K d=約在 10-4 至 10

30、-8胰蛋白酶活性測定在動物胰臟中，胰蛋白酶是以無活性的酶原狀態(tài)存在的。在生理條件下，胰蛋白酶原隨胰液分泌至十二指腸后，在小腸上腔有 Ca2+的環(huán)境中，為腸激酶或胰蛋白酶所 激活，其肽鏈N-端的賴氨酸與異亮氨酸之間的一個肽鍵被水解，失去一個酸性 6肽， 其分子構(gòu)象發(fā)生一定的改變后轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写呋鞍踪|(zhì)水解活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原分子量約為24,000,其等電點(diǎn)為pH 8.9;胰蛋白酶的分子量約為23,400, 具等電點(diǎn)為pH 10.8。胰蛋白酶在pH 3.0時最穩(wěn)定，具濃溶液可貯存于冰箱（0C以下） 數(shù)周而活性無顯著喪失。pH5時，胰蛋白酶易自溶。胰 蛋白酶催化活性的最適 pH為7.67.8。重

31、金屬離子、有機(jī)磷化合物和反應(yīng)產(chǎn)物都能抑制胰蛋白酶的活性。胰臟、卵清和大 豆中也含有一些蛋白質(zhì)對胰蛋白酶活性具有抑制作用。胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對于由堿性氨基酸（如精氨酸、賴氨酸）的竣基與 其他氨基酸的氨基所形成的肽鍵具有高度的專一性。止匕外，胰蛋白酶也能催化由堿性氨 基酸的竣基所形成的酰胺鍵和酯鍵，有高度的專一性仍表現(xiàn)為對堿性氨基酸竣基一側(cè)的 選擇。對此等化學(xué)鍵的催化水解活性的敏感度為：酯鍵酰胺鍵肽鍵。因此，可以利 用含有這些化學(xué)鍵的酰胺或脂類化合物作為底物來測定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲7 / 31酰-DL-精氨酸-對硝基苯胺（簡稱 BAPA或BAPNA , Cas:911-77-

32、和苯甲酰-DL-精 氨酰-&蔡胺（簡稱BANA, Cas:913-04-2）測定酰胺酶活力。用N-苯甲酰基-L-精氨酸乙 酯（簡稱 BAEE, Cas:2645-08-1）和 N-對甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯（簡稱 TAME, Cas:1784-03-8）測定酯酶活力。酶活力單位的規(guī)定因底物及測定方法而異。酶動力學(xué)研究米氏方程式米氏方程抑制動力學(xué)作用特征無抑制劑競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制與I結(jié)合的組分EE、ESES動力學(xué)參數(shù)表觀KmKm增大/、艾減小最大速度V max/、艾降低降低林-貝氏作圖斜率Km/V max增大增大/、艾縱車雌距1/V max/、艾增大增大橫車雌距-1/Km增大/

33、、艾減小聚丙烯酰氨凝膠電泳PAGE凝膠的組成a）單體（monomer）:丙烯酰胺（acrylamide, Acr） , CH2 = CHCOCH2。b）交聯(lián)劑（cross linker） : N,N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）, 可將兩個丙烯酰胺單體分子連結(jié)在一起，可形成分叉點(diǎn)，以構(gòu)成立體結(jié)構(gòu)。c）加速劑：四甲基二乙胺（tetramethylenediamine, TEMED ）幫助 AP生成硫酸自 由基。d）化學(xué)聚合催化劑：過硫酸?。╝mmonium persulfate, AP）或riboflavin （即維生 素B2）在TEMED催化下產(chǎn)生

34、自由基（S2O82-2SO4- ）;產(chǎn)生的硫酸自由基激活 Acr 單體。電泳的濃縮作用圖A:上述電泳的五個部分中，只有凝膠的緩沖液含氯離子，沒有 Gly;然而樣品8 / 31溶液中含Gly,沒有氯離子。再看樣品溶液-濃縮膠-分離膠三段的pH是不連續(xù)的，其pH分別為8.3-6.9-8.9,注 意Gly的pl恰為6.9。圖B:當(dāng)電泳一開始時，Gly進(jìn)入濃縮膠，立刻變成不帶電的分子(白點(diǎn))，泳動率變??；同時氯離子則很快的往正極泳動，因此在氯離子與Gly之間有一段缺乏離子的空間，電壓變得很高。然而兩電極之間，一定要有負(fù)離子來帶動電流，此時只有利用蛋白質(zhì)分子來傳遞，而濃 縮膠中的孔隙有較疏，于是蛋白質(zhì)分

35、子在此離子缺乏空間，快速往正極泳動，一直碰到 氯離子的尾端，而聚集于此，形成一薄層。圖C: Gly分子慢慢通過濃縮膠，又變回負(fù)離子，離子缺乏空間瓦解；樣品蛋白質(zhì) 泳動到分離膠，膠體為正常濃度，依其分子量、電荷等因素泳動。ABC濃縮膠分 離 膠PAGE染色及干燥凝膠在電泳后要進(jìn)行染色，才能看到樣品蛋白質(zhì)所呈現(xiàn)的條帶。下面介紹兩種常用 的染色方法?？捡R斯亮藍(lán)染色法：Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR)是最常用的染色法，快 速而方便，靈敏度中等。利用 CBR上的芳香基團(tuán)與蛋白質(zhì)的非極性區(qū)結(jié)合，以及所帶 負(fù)電與蛋白質(zhì)的正電基團(tuán)結(jié)合。注意染色用的Coomassie B

36、rilliant Blue為R-250,不要誤用G-250,后者用于蛋白質(zhì)定量。硝酸銀(ammoniacal silver)染色法：以銀氨錯離子形式與蛋白質(zhì)結(jié)合，銀離子再 還原成金屬銀的深褐色。其靈敏度比CBR染色法高十至百倍，但步驟較復(fù)雜。凝膠的干燥保存：大部分的凝膠經(jīng)過脫水處理做成干膠均可長期保存。干燥好的凝 膠，可用掃描儀掃描，再與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相比較則可定量。9 / 313實驗材料（設(shè)備）實驗材料實驗原料新鮮雞蛋，胰臟抽提液實驗原料來源北京理工大學(xué)珠海學(xué)院化工與材料學(xué)院生物工程實驗室凝膠配置Disc/SDS分離膠(T=12%,C=3% )配方H2O 3.3mL,30%Acrylamide

37、4.0mL,1.5M Tris-HCl 2.5mL,10%SDS 0.1mL,TEMED0.006mL,10%過硫酸錢 0.1mLDisc/SDS濃縮膠(T=5%Acrylamide,C=3% )配方H2O 3.4mL,30%Acrylamide 0.83mL,1.0M Tris-HCl 0.63mL,10%SDS 0.05mL,TEMED0.010mL,10%過硫酸錢 0.05mL.實驗試劑表3-1主要試劑及其生產(chǎn)廠家藥品、試劑廠家藥品、試劑廠家丙酮實驗室提供甲殼素實驗室提供考馬斯亮藍(lán)G-250試劑實驗室提供親和柱平衡液實驗室提供BAEE底物溶液實驗室提供0.05M , pH8.0Tris-

38、HCl 緩沖液實驗室提供標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液實驗室提供親和柱洗脫液實驗室提供蒸儲水實驗室提供分離膠緩沖液實驗室提供濃縮膠緩沖液實驗室提供10%SDS實驗室提供電泳緩沖液實驗室提供考馬斯亮藍(lán)染色脫色液實驗室提供考馬斯亮藍(lán)G-250染色實驗室提供自來水實驗室提供10 / 31實驗主要設(shè)備與儀器表3-2主要儀器及其型號型號超凈工作臺ZHJH-C1115B上海智誠蠕動泵驅(qū)動器BT100-2JLongerPump架盤藥物天平JYT-2上海光正醫(yī)療儀器有限公司臺式離心機(jī)SC-3610科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司低速離心機(jī)SC-3612安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司離心機(jī)TDL-408Anke酸度計PHS-3C雷磁

39、可調(diào)高速勻漿機(jī)FSH-2A透析袋MD77Solarbio微量移液器（10.00）DU32080DRAGON-MED微量移液器（ 1000）DS06805DRAGON-MED微量移液器（200.0）DS06605DRAGON-MED11 / 314.1實驗流程示意圖X3v CHOM分離與分析沉淀離心法X4Trypsin的純化親和層析法4實驗方法圖4-1實驗流程示意圖1812 / 31胰蛋白酶的親和配基-雞卵粘蛋白的分離與定量有機(jī)溶劑沉淀法當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液加入大量有機(jī)溶劑，水分子濃度被稀釋，蛋白質(zhì)的溶解度便迅速下降, 而沉淀下來。但有機(jī)溶劑與水混合后會產(chǎn)生熱，易造成蛋白質(zhì)變性，需在極低溫下操作。 常用

40、有機(jī)溶劑有丙酮或甲醇，在沉淀后也常用乙醴來帶走丙酮，以加速干燥。 1TCA沉淀法另外，三氯乙酸(trichloroacetic,TCA)是很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，許多蛋白質(zhì)遇到 TCA都會變性沉淀，無法恢復(fù)原態(tài)。TCA對皮膚有很強(qiáng)的腐蝕性，不小心接觸后要馬 上沖水。通常TCA并不被用在純化蛋白質(zhì)的步驟中，而是用來沉淀或移除大部分非目 的蛋白。2高速離心法離心是分離固態(tài)與液態(tài)最方便的方法，因此蛋白質(zhì)以上述方式沉淀下來后，接著便 可用高速離心法，把形成固態(tài)或半固態(tài)的蛋白質(zhì)分離出來。這樣的離心都要在低溫下進(jìn) 行，以免離心時產(chǎn)生高溫，導(dǎo)致目的蛋白變性。在實驗室中，高速離心機(jī)是較危險的儀 器，一定要注意離心

41、管是否正確平衡，離心轉(zhuǎn)速是否設(shè)定正確。3蛋白質(zhì)鹽脫透析袋是最長常用的方法，透析袋有各種大小不同的網(wǎng)目，可以分離分子量不同的 大小分子。透析袋一般使用前需經(jīng)前處理。Bradford法定量蛋白質(zhì)Bradford dye-binding method 是利用 Coomassic Brilliant Blue G-250 (CBG)可與蛋 白質(zhì)結(jié)合而變色的特性來定量；若樣品中蛋白質(zhì)量較多，則結(jié)合到蛋白質(zhì)而變色的CBG也多，因而顯色較深。本實驗就是以一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為對象，制作一條蛋白質(zhì)與光吸收 值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后求得所測樣品的蛋白質(zhì)含量。親和層析法分離純化胰蛋白酶N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)法

42、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)在波長253 nm下的紫外光吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于 N-苯甲 酰-L-精氨酸(BA) , benzoyl-L-arginine的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下， BAEE隨 著酯鍵的水解，水解產(chǎn)物 BA逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外光吸收亦隨之相應(yīng)增加，以13 / 31AA253計算胰蛋白酶的活性。胰蛋白酶的BAEE單位定義為：以BAEE為底物，在一定反應(yīng)條件下，每分鐘使AA253增加0.001的酶量為一個 BAEE單位。酶動力學(xué)研究15. TJ 的雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk)測定Km式米氏方程的倒數(shù)式以作圖得到一條直線，將直線延伸至橫、縱坐標(biāo)軸，其橫截

43、距為 -,縱截 距為，斜率為，由此求出 Km和V。雙倒數(shù)作圖法為實驗室常用方法， 但缺點(diǎn)是低底物濃度下測定的點(diǎn)誤差較大，影響測定的正確性。聚丙烯酰氨凝膠電泳蛋白質(zhì)相對分子量的測定事物蚪打加時牛也前白3t臼e&j a#!廖清黃白過士打)一牙白物獨(dú)智利用的林CH,M4)當(dāng)分子量在15kD到200kD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對 數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：，式中： Mr為相對分子量，mR為相對 遷移率，K、b均為常數(shù)；若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)相對 分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白在相 同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的相對遷移率mR即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得

44、 分子量。14 / 315實驗結(jié)果與分析討論5.1胰蛋白酶的親和配基-雞卵粘蛋白的分離與定量7 6,54,3， 2-1 01.1OA值f吸光度)0,.0395 黑白質(zhì)含量（2Ug）2530圖蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線從上圖可以得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0236x-0.0464, R2=0.9543。通過同樣的方法測得樣品溶液稀釋 40倍后測得A595下的吸光度為0.401,將此數(shù)據(jù) 帶入蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中可以得到樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度為2.522mg/mL。結(jié)果分析：從蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線中可以知道 R2=0.9543并沒有達(dá)到兩個0.99的可信度，所以 從這條標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到的數(shù)據(jù)可信度相

45、對較差。而且最終求出來的CHOM的濃度遠(yuǎn)沒有達(dá)到后續(xù)實驗所需要的20mg/mL。存在一下情況導(dǎo)致數(shù)據(jù)的可信度低和不能獲得預(yù)期 中的蛋白含量：.調(diào)節(jié)pH值不夠準(zhǔn)確，pH值未到或者超過一定的限度，這樣導(dǎo)致是雜蛋白沒有能 夠除去，目的蛋白析出量較少。.加入預(yù)冷的丙酮的時候，加入的量不夠，導(dǎo)致析出的量和純度不夠理想。.在使用移液槍量取液體體積的時候，操作不規(guī)范導(dǎo)致量取液體體積時不存在誤差。.稀釋溶液加入的體積不準(zhǔn)確沒有到達(dá)所需要的濃度，人為操作實驗造成。.材料不符合標(biāo)準(zhǔn)，雞蛋本身的含量沒有達(dá)到理論值。.透析時間過長，使得部分CHOM析出。.離心時轉(zhuǎn)速達(dá)不到理論值，導(dǎo)致部分CHOM還殘留在溶液中，不能完

46、全沉淀，造 成了蛋白含量偏低。.蛋白質(zhì)冷凍的溫度過低，導(dǎo)致部分 CHOM失去活性。15 / 315.2親和層析法分離純化胰蛋白酶A280圖親和層析圖譜結(jié)果分析：從親和層析圖譜可以看出，在整個親和層析的過程中會出線兩個蛋白峰。.首先在第2到第8根試管時吸光度值都比較高，說明此時有大量的蛋白質(zhì)從層析 柱中流出，此時出現(xiàn)的是在上樣平衡時需要除去的雜蛋白峰，說明目的蛋白還在層析柱 中未洗脫出來。.第10到第28根管時，吸光值較低，此時只有少量蛋白質(zhì)或沒有蛋白質(zhì)從層析柱 中流出。.第29到第33根試管時吸光度再次增大，說明此時又有大量的蛋白質(zhì)從層析柱中 流出，此時出現(xiàn)的是在洗脫時我們最終要得到的純胰蛋白

47、酶峰，最后保留了純胰蛋白酶 含量最高的兩根試管（30和31）的溶液為后續(xù)的實驗作準(zhǔn)備。0.30.250.2A253 0.150.1系列206 0402 O08OO1082 062Oa2 072002061 oal021/s間時粗酶酶活力測定16 / 31純酶酶活力測定從粗酶酶活力測定圖中可以得到小253/min=0.060,從酶酶活力測定圖中可以得到AA253/min=0.006o胰蛋白酶溶液的活力單位（BAEE單位/mL）=胰蛋白酶比活力（BAEE單位/mg）=比活力純化倍數(shù)3031.16033.20829724.4733蛋白含量（1 g/mL） 酶活力粗酶液（PX）989.7215000純

48、化酶（合并的試管）154.25300表粗酶及純化酶結(jié)果表結(jié)果分析：.從活力測定圖中可以很明顯看出通過純化的酶吸光度值要低于粗酶的吸光度值。.純胰蛋白酶的9253/min沒有在理論范圍0.05-1.00之間，導(dǎo)致的原因是純胰蛋白 酶含量較低和底物受到了污染。.計算出的純酶含量比較低，是因為在CHOM雞卵粘蛋白分離提純中，得到的CHOM含量低，沒有達(dá)到理論含量值，就直接導(dǎo)致在上樣平衡之后，大量的胰蛋白酶沒 有被親和專一性抑制劑吸附，導(dǎo)致大量胰蛋白酶流失。.CHOM雞卵粘蛋白中含有雜蛋白，這樣在親和層析中雜蛋白會阻礙CHOM雞卵粘蛋白吸附胰蛋白酶，導(dǎo)致胰蛋白酶大量的流失。17 / 31酶動力學(xué)研究根

49、據(jù)米氏常數(shù)雙倒數(shù)作圖法可以得出趨勢線y=0.0004x+11.905,其橫截距為-,縱截距為，因此可以求出米氏常數(shù) Km=mol/L,最大反應(yīng)速率V=0.084/(Lmin)。圖表3-6CHOM抑制劑效果從圖中可以看出在吸光值變化量相等時，2中用到的底物濃度更多，而Ti1用的比Ti2少，可以推測出Ti2類試管中所加的抑制劑量較多，抑制效果更好。根據(jù)圖中趨勢線 的走向可以推測出此 CHOM為可逆抑制劑中的競爭性抑制劑，此抑制劑和底物是屬于 競爭關(guān)系，因為胰蛋白酶只能和抑制劑以及底物兩者之一結(jié)合，若抑制劑結(jié)合上胰蛋白 酶，則胰蛋白酶失活，從而起到抑制的作用。18 / 312520y = 3E+06

50、x + 15.5831/vy = 554957x + 14.188y = 930591x + 13.9721510i y = 1E+06x + 13.948y = 876480 x + 12.371025E-06 -1.5E-06-5E-07 0.0000005 0.0000015 0.0000025系列1系列2系列3系列4系列5線性（系列1）根據(jù)作圖法得出抑制劑濃度與反應(yīng)初速度的倒數(shù)得出上圖，根據(jù) Dixon圖可知，所 有趨勢線的交點(diǎn)的橫坐標(biāo)為-Ki,通過計算得到交點(diǎn)為（-0.0000008,13）所以可以得出抑制 劑常熟 Ki=-0.0000008。聚丙烯酰氨凝膠電泳MarkerTryps

51、in磷酸酶b.7,200） 牛血清白蛋白（66,409）卵清蛋白（44,287）碳酸甘酶（29,000）PXCHOM胰蛋白酶抑制劑（20,100）溶菌酶（14,300)圖3-8標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及樣品電泳圖19 / 31標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線rMg數(shù)對的量子分對相的質(zhì)白蛋y = -1.3844x + 4.9789R2= 0.9716系列1線T（系列1）0.20.40.60.8標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率mR圖3-7標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線根據(jù)數(shù)據(jù)做出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線，得到一個關(guān)系式y(tǒng)=-1.3844x+4.9789此關(guān)系式對求樣品蛋白質(zhì)分子量起著重要作用。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以算出Trypsin的相對分子量為54325, CHOM的相

52、對分子量為15560.結(jié)果分析：.從標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及樣品電泳圖上來看，圖中一共有4條電泳帶，分別依次是Marker、 Trypsin、PX、CHOM。.PX粗酶的條帶上面出現(xiàn)了與純胰蛋白酶條帶重疊的一部分，這說明這一部分是胰蛋白酶條帶。.由于Trypsin濃度太低，導(dǎo)致電泳時Trypsin條帶最后出現(xiàn)的非常淺。.在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線中，其 R2=0.9716并沒有達(dá)到兩個0.99的可信度，所以從這條 標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到的數(shù)據(jù)可信度相對較差。.從標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及樣品電泳圖上來看，CHOM并不是純品，含有三種雜志。.根據(jù)公式計算出來的CHOM的相對分子量比理論值要小，是因為CHOM樣品在 電泳時被放在了最邊上的電

53、泳槽中，出現(xiàn)了 微笑現(xiàn)象”，邊緣對蛋白的遷移率造成了影 響。20 / 317結(jié)論雞卵粘蛋白的分離與定量實驗中，每一個步驟都非常的重要，一步做錯都將影響到 后續(xù)的實驗的進(jìn)行。因此在材料的選擇、試劑的配置和試劑的使用上要嚴(yán)格按照要求進(jìn) 行，在進(jìn)行透析脫鹽時應(yīng)該盡量減少脫鹽的時間，在Bradford定量蛋白質(zhì)中的曲線制作時，應(yīng)該盡量使加入的試劑時間同步，并不能長時間擺放后使用。在分離純化胰蛋白酶中，我們需要通過親和層析法來獲取純的胰蛋白酶，因此親和 層析柱的組裝是非常重要的，一定要按照要求進(jìn)行，在裝入填料時，一定要使調(diào)料自然 沉降并且使上表面保持平整，在加入上篩板時不能擠壓到填料，如果填料過于緊密會

54、導(dǎo) 致層析的速度慢，分離效果差。在整個親和層析的過程中，絕對不能使填料變干，填料 變干也是會使分離效果變差。在酶動力學(xué)研究中，我們需要測定多組數(shù)據(jù)的用253/min并使這些數(shù)據(jù)的用253/min在0.05-0.100的范圍以內(nèi)，所以首先我們需要使第三組的數(shù)據(jù)在測定范圍的 中間值處，才能使整個實驗的其他數(shù)據(jù)也在要求的范圍以內(nèi)。通過實驗可以進(jìn)一步的證 明，當(dāng)溶液中加入的抑制劑越多，酶的活性將越低，結(jié)合底物的能力越差。在底物飽和、 環(huán)境條件穩(wěn)定的情況下，反應(yīng)速度會隨著酶的濃度增加而增大，成直線關(guān)系；從實驗中 還可以知道隨著反應(yīng)時間的增加，酶促反應(yīng)的速度會隨之下降。在聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗中，凝膠的配

55、制是最重要的，必須嚴(yán)格按照配方配制才 能在實驗中得到好的實驗結(jié)果，因此在配膠時，使膠體凝固的試劑要最后加入，并邊加 入邊輕輕的搖晃，加完所有的試劑后應(yīng)該盡快把凝膠加入到玻璃板間，且不能產(chǎn)生氣泡,若產(chǎn)生氣泡，將會使蛋白質(zhì)的電泳帶斷裂。21 / 31參考文獻(xiàn)1周德慶.微生物學(xué)教程M .北京：高等教育出版社，2011: 2-3.2周德慶.微生物學(xué)教程.北京：高等教育出版社，2011: 96.3周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 76.4周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 110.5周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，

56、2013: 18.6周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 8.7周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 9.8周德慶.微生物學(xué)教程.北京：高等教育出版社，2011: 233.9周德慶.微生物學(xué)教程.北京：高等教育出版社，2011: 153.10周德慶.微生物學(xué)教程.北京：高等教育出版社，2011: 23.11周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 34.12周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 91.13周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 91.1

57、4周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 350.15周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 350.16周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 351.17周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 351.18吳正潔，朱超鋒.微生物學(xué)實驗指引手冊M,珠海：北京理工大學(xué)珠海學(xué)院化 工與材料學(xué)院生物教研室，2014: 5.11周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 35.20周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實驗教程.北京：高等教育出版社，2013: 94.21周德慶.

58、微生物學(xué)教程.北京：高等教育出版社，2011: 14.22 / 31附錄表微量法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣法(單位： mL)試管號#0#1#2#3#4#50.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)一0.030.090.150.210.2-7蛋白溶液70.15 M0.0NaCl0.300.270.210.150.093考馬斯亮3.0藍(lán)試劑3.003.003.003.003.000混勻，靜置10min后以#0為空白對照，在595nm處比色A5950.0000.0390.1240.2640.3990.669表 樣品溶液的測定(單位：mL) TOC o 1-5 h z 試管號X1CHOM樣品溶液稀釋液0.30考馬斯亮藍(lán)試劑3.00混

59、勻，靜置10min后在595nm處比色A5950.401 (稀釋 40 倍)表粗酶吸收值變化時間(S)610120 130 140A253 時間(s)A2530.0110.1690.0220.1790.0310.1890.0420.1990.0520.2090.0640.2190.0740.2290.08620.2390.0960.2470.1060.2540.1190.2550.127600.2580.1392700.2570.1492800.2610.1592900.260表純酶吸收值義化時間(s)610120130140A2530.0470.0470.0480.0500.0500.054

60、0.0510.0530.0550.0510.0520.0520.0530.0540.056時間(s)260270280290A2530.0530.0530.0530.0530.0540.0550.0560.0570.0580.0590.0600.0600.0610.0600.061表上樣平衡管號123456789101112A2800.0271.0073.0103.0103.0102.8341.5350.8500.5670.3960.3000.243管號8192021222324A2800.2130.1880.1540.1150.0800.0780.0610.0540.0470.0710.04