流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)及應(yīng)用課件

1、流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)及應(yīng)用 王萬黨2015.08.15中山市小欖人民醫(yī)院檢驗(yàn)科流式細(xì)胞術(shù)：Flow cytometry1930年，Caspersson 和Thorell開始致力于細(xì)胞的計(jì)數(shù)1934年，Moldaven 試圖用光電儀 記錄流過一根毛細(xì)管的細(xì)胞1949 年 Wallace Coulter 提出在懸液中計(jì)數(shù)粒子的方法的專利流式細(xì)胞的發(fā)展史1953年，Croslannd-Taylor 應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動計(jì)數(shù)器2-4 color cytometer 10-20 color cytometer sorter high-end res1953，Parker 和Horst

2、 描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置，成為流式細(xì)胞儀的雛形 1967，發(fā)展了一種液流束、照明光軸、檢測系統(tǒng)三者垂直的流式細(xì)胞儀1969 ， Van Dilla Fulwyler 發(fā)明第一臺熒光檢測細(xì)胞計(jì)1975 ， Kohler 和Milstein 提出單克隆抗體技術(shù)流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer):是集光電子物理，光電測量，計(jì)算機(jī)，細(xì)胞熒光化學(xué)，單克隆抗體技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry):利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動的單個細(xì)胞/生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒可達(dá)1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達(dá)99%以上）的技術(shù)。流式細(xì)胞儀的工作原理

3、液流系統(tǒng) 流動室 液流驅(qū)動系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 激光光源 光收集系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)液流系統(tǒng)：流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。進(jìn)樣孔鞘液激光束熒光信號FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細(xì)胞流）樣本管鞘液管液流中心由單列勻速運(yùn)動顆粒組成的液柱為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細(xì)胞被限制在液流的軸線上。激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短

4、波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）光學(xué)系統(tǒng)Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (PE)620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645

5、DL流式細(xì)胞儀光路圖氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍(lán)光488nm的譜線最強(qiáng)，約占總光強(qiáng)的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以633nm較強(qiáng)。前向散射光信號細(xì)胞大小 側(cè)向散射光信號細(xì)胞內(nèi)顆粒 散射光信號外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖用熒光標(biāo)記抗體抗體特異性地結(jié)合細(xì) 胞上對應(yīng)的抗原表達(dá)該抗原的細(xì)胞被標(biāo)記上熒光；抗原表達(dá)多的細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)陽性細(xì)胞百分比或濃度靶蛋白濃度熒光信號 FL1 FITC FL2 PE FL3 - PC7熒光的產(chǎn)生熒光素種類FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色 530nmGFP (綠色熒光蛋白) ：綠色 PE（藻紅蛋白）：橙黃色 575nmPerCP(多甲藻黃素

6、葉綠素蛋白）：深紅色675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色 620nmAPC(別藻蘭蛋白）：紅色 660nm熒光產(chǎn)生過程濾光片：Optical Filters460 500 540460 500 540460 500 540SP 500LP 500BP500/50長通短通帶通 光收集系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光一般由光電倍增管（PMT）檢測。細(xì)胞分選系統(tǒng)激發(fā)光+-電極板單細(xì)胞收集管數(shù)據(jù)顯示熒光檢測器 流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選器通過噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，然后由充電電路對選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中。 數(shù)據(jù)分析

7、Positive cellNegative Cell CD4 PECD4 PEAbsolute Counts - Cells per mLPositive CellAbsolute Count BeadsNegative CellCD4 PECD4 PE流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用免疫狀態(tài)監(jiān)測 淋巴細(xì)胞亞群/樹突狀細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞檢測血液病 白血病及淋巴瘤免疫分型及微小殘留（MRD）檢測 血小板檢測及網(wǎng)織紅細(xì)胞和網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)/PNH檢測自身免疫病 HLA-B27檢測感染性疾病 CD64檢測移植免疫腫瘤細(xì)胞因子檢測免疫狀態(tài)監(jiān)測淋巴細(xì)胞亞群活化的T淋巴細(xì)胞抗原特異性免疫細(xì)胞調(diào)控性T細(xì)胞樹突狀細(xì)胞先天免

8、疫細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群分析 根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān)總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能， 能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)CD4、CD8表達(dá)，T淋巴細(xì)胞又分為T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+）T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）Th/Ts 評價(jià)那些自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)，此外，這一比值還可用來監(jiān)測骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻擊 Th/Ts升高：自身免疫性

9、疾?。愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血淋巴細(xì)胞亞群T淋巴細(xì)胞(CD3+)名 稱功 能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增

10、生時(shí)升高 CD3+CD4-CD8- 有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,其表達(dá) / T細(xì)胞受體(TCR / ) CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO- 幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞 當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時(shí)此細(xì)胞亞群較低 CD45RA-CD45RO+ 記憶性T淋巴細(xì)胞 病菌感染時(shí)升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T細(xì)胞, 感染時(shí)升高 感染時(shí)升高淋巴細(xì)胞亞群活化T淋巴細(xì)胞名 稱功 能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4

11、+CD25+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+ 活化的B細(xì)胞過敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞 NK細(xì)胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時(shí)降低, 而病毒感染時(shí)升高 CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強(qiáng)烈征兆 淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢查意義疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低嚴(yán)重降低

12、增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活動性肝炎、肝硬化降低正?；蛟龈呓档徒档湍[瘤降低降低增高降低降低非特異性的先天免疫細(xì)胞細(xì)胞:占外周血T細(xì)胞的10以下，非抗原依賴型免疫細(xì)胞，在傳染病、腫瘤病人外周血數(shù)量增加，表達(dá)CD3量較普通T細(xì)胞多NK細(xì)胞：占外周血淋巴細(xì)胞825，傳染病和腫瘤病人數(shù)量偏低。NK細(xì)胞可以根據(jù)NKR的不同而分類，丙型肝炎的發(fā)生和預(yù)后可能與NK細(xì)胞的表型相關(guān)樹突狀細(xì)胞（DC）：分布在淋巴組織和外周血，機(jī)體主要的抗原提呈細(xì)胞Treg細(xì)胞：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，自身免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切血液學(xué)中的應(yīng)用1）白血病和淋巴瘤的免疫分型2）微小殘留（MRD）檢測3） CD34+造血干/祖細(xì)胞

13、的檢測4）活化血小板及網(wǎng)織血小板的檢測5）陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）6）網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)流式細(xì)胞的免疫分型是白血病分型的重要指標(biāo) FAB標(biāo)準(zhǔn)，形態(tài)學(xué)和免疫表型結(jié)合適合于白血病的分型診斷，但不適合用于確診是不是白血病。Minimal residual diseases (MRD)診斷白血病主要標(biāo)志：B-ALL: CD34, HLA-DR, CD19, CD10+/-, cCD79aT-ALL: CD34, CD38, CD7, CD2+/-, CD5+/-, cCD3AML: CD34, CD117, CD33, CD13, cMPOM3: CD34-, HLA-DR-M2: CD19+:

14、 t(8, 21)M4/M5: CD14+M6: GlyA+, CD71+M7: IIb/IIIa(CD41, CD61)+M4M5M6M7T-ALLB-ALLM2M3微小殘留（MRD）檢測白血病微小殘留是指患者經(jīng)過治療取得完全緩解（CR）后體內(nèi)殘留的微量白血病細(xì)胞。白血病微小殘留病是白血病復(fù)發(fā)的主要根源。檢測MRD可早期預(yù)測白血病復(fù)發(fā)的可能性、判斷療效、研究白血病發(fā)生發(fā)展的特征。2）CD34+造血干/祖細(xì)胞的檢測。主要用于干細(xì)胞移植及基因治療方面的檢測。3）活化血小板及網(wǎng)織血小板的檢測，在栓塞性疾病，如腦血管和心肌梗塞的患者，可出現(xiàn)活化的血小板增多。而血小板減少的患者，如果出現(xiàn)網(wǎng)織血小板增多

15、，則說明血小板減少的原因?yàn)檠“迤茐倪^多所致。CD41a是特異的血小板表面標(biāo)記CD61是特異的泛血小板表面標(biāo)記PAC-1為早期血小板活化指標(biāo)CD62p為血小板活化的后期指標(biāo)CD41-CD61復(fù)合物檢測可提示血小板無力癥CD41a-CD42b復(fù)合物檢測可提示巨大血小板血癥臨床意義：1、評估患者血小板活化能力2、檢測血小板活化相關(guān)疾病過程，抗血小板藥物療效或治療藥物的影響，預(yù)測血栓形成3、輔助診斷血小板活化相關(guān)的疾病:血小板無力癥、巨大血小板綜合癥、肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥、血栓4、鑒別細(xì)菌感染和病毒感染性疾病4）陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH） 發(fā)病機(jī)制為X染色體上的PIG-A基因發(fā)生突變，引起

16、糖化肌醇脂（GPI）錨合成障礙，使GPI錨連蛋白缺乏，已證實(shí)的GPI錨連蛋白有10余種，用于PNH診斷的主要為CD55和CD59兩種，如果在紅細(xì)胞或WBC上出現(xiàn)CD55或/和CD59表達(dá)下降，且患者體內(nèi)的紅細(xì)胞呈現(xiàn)不均一性，可診斷為PNH。5）網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)A：正常人，B-D均為PNH患者HLA-B27檢測 HLA-B27是在有核細(xì)胞上表達(dá)的I型MHC分子，在淋巴細(xì)胞表面尤為豐富 強(qiáng)直性脊柱炎，HLA-B27陽性率達(dá)90%，其表達(dá)與強(qiáng)直性脊椎炎高度相關(guān)。CD64檢測 CD64主要表達(dá)與巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表面，中性粒細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)，當(dāng)機(jī)體患感染性疾病時(shí)，中性粒細(xì)胞表面CD64表達(dá)迅速升高。 CD64用于感染性疾病的早期診斷，區(qū)分感染和活動性的自身免疫性疾病，監(jiān)測抗菌藥物療效并預(yù)測術(shù)后感染，鑒別細(xì)菌感染和病毒感染 可溶性蛋白檢測CBA（Cytometric Beads Array）采用的是夾心免疫分析方法，捕捉抗體包被在微球上微