海洋微生物多糖課件

1、第七章 海洋微生物多糖7.1多糖的分類及其生理功能多糖是最早被人們認識的生物大分子化合物，19世紀末，關(guān)子它的研究直接推動了微生物學和化學的發(fā)展。但那之后，人們對多糖的興趣迅速減弱，將自光投向蛋白質(zhì)和核酸的領(lǐng)域。 多糖研究的復雜性造成這種情況的原因很多，其中最主要的是多糖本身的復雜性。與氨基酸、核苷酸相比，組成多糖的單糖有更多的活性基團和手性原子，單糖之間可形成直鏈也能形成支鏈，并且有a和異構(gòu)體，使多糖表現(xiàn)出復雜結(jié)構(gòu)， 如:4個單糖則可以組成35 560種不同的連接方式的四糖，但4種不同的氨基酸僅結(jié)合成24種不同的四膚。 多糖的復雜性還表現(xiàn)在可以形成衍生物，如硫酸酯化、甲基化、乙?；土姿狨セ?/p>

2、等。 在生物體內(nèi)，多糖還與其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)，脂肪等形成糖復合物糖蛋白、糖肽和糖脂。 多（寡）糖鏈還具有較高的柔韌性，易受環(huán)境的影響發(fā)生構(gòu)象變化，從而實現(xiàn)分子之間的相互作用。多糖結(jié)構(gòu)的復雜性是多糖研究的主要障礙。從另一個方面來說，正是多糖的這些分子特征和基礎(chǔ)決定了游離多糖或糖復合物中寡糖鏈能夠編碼大量的生物信息，使多糖成為最有魅力的信息載體。 多糖這種結(jié)構(gòu)的復雜性也決定了多糖復雜多樣的生物功能和良好的生物活性。近20年來分子生物學等新的生物技術(shù)的發(fā)展使人們對多糖的了解愈來愈深，關(guān)于多糖的化學、生物學研究已成為本世紀一個非常有誘惑力的前沿領(lǐng)域。 7.1.1多糖的分類多糖作為天然大分子物質(zhì)同核酸、蛋

3、白質(zhì)一樣廣泛存在于生物體中。根據(jù)其來源可分為動物多糖、植物多糖、微生物多糖。根據(jù)其結(jié)構(gòu)分類的方法，將多糖分為兩大類，多聚糖和糖復合物。 多聚糖就是傳統(tǒng)意義上的多糖 糖復合物是近十幾年來興起研究的一類物質(zhì)，它是由多聚糖與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核苷酸等生物分子鍵合的一種生物大分子物質(zhì)。它的定義跨越了傳統(tǒng)上把生物大分子物質(zhì)分為多糖、蛋白質(zhì)、核酸的三界體系。 研究表明，雖然糖鏈在糖復合物所占的比例不大，但對生理功能往往有決定性的作用，因此把對這一類物質(zhì)的研究歸在多糖的研究中，并命名為糖復合物（glycoconju-gate），也譯為糖綴合物。 從糖單元的多寡上多糖還可以分為多糖和寡糖。兩者之間的界限較模糊。一

4、般來講，少于20個單糖基組成的糖為寡糖。由多于20個單糖基組成的糖為多糖。 7.1.2 糖復合物的生理功能 現(xiàn)在人們研究的糖復合物主要分兩類，與蛋白質(zhì)結(jié)合的稱為糖蛋白；與脂類結(jié)合的稱為糖脂。近年來又發(fā)現(xiàn)了糖、蛋白、脂類三者的共價結(jié)合物。 糖復合物中的糖鏈長短不一，差別很大。 (1) 糖鏈對糖復合物物理化學性質(zhì)的影響 糖鏈對糖復合物的理化性質(zhì)如生理pH,黏性、溶解度等重要的影響。 動物體內(nèi)的黏液蛋白是一種糖蛋白，黏液分泌中的糖蛋白常含有大量的糖鏈，能束縛水，具有很高的黏性，對抗體起保護作用和潤滑作用。 南極魚能生活在一1.85的水域中，經(jīng)研究南極魚發(fā)現(xiàn)，這種魚中含有一種抗凍的糖蛋白，若除去或修飾

5、南極魚的抗凍糖蛋白的糖鏈，會影響糖蛋白與水分子形成氫鍵，糖蛋白會失去降低水的冰點的能力。(2) 糖鏈對糖復合物的構(gòu)象的影響 不少事實證明：糖蛋白中的糖鏈多為新生肽鏈的折疊維持蛋白質(zhì)正確的空間構(gòu)象。如人免疫球蛋白IgG Fc結(jié)合的片段的X射線晶體分析表明，糖遮蓋了蛋白質(zhì)的疏水部分，表明糖鏈穩(wěn)定糖蛋白的構(gòu)象和增加其溶解度； 如：一株皰疹性病毒（VS V）的G蛋白基因經(jīng)突變而除去兩個糖化駐點后，使正確的鏈內(nèi)二硫鏈錯配成鏈間的二硫鍵。 (3) 糖鏈在生物體內(nèi)識別作用 糖復合物是細胞膜的重要的組成部分，作為生物信息的攜帶者和傳遞者，在細胞的識別、集聚和受體作用起關(guān)鍵作用。有些糖復合物在發(fā)揮生物功能的過程

6、中起決定作用的是多（寡）糖鏈。如肝臟中動物凝集素對寡糖的識別和結(jié)合可以促進肝臟細胞對糖蛋白等的消化失活，從而調(diào)節(jié)其在體內(nèi)的濃度和作用強度。 (4) 寡糖鏈是許多糖復合物發(fā)揮生物功能所必須的部分 如血型多糖是一種含糖量達80 %的糖蛋白，血型是由血細胞表面的糖蛋白和糖脂決定的，而決定血型的差異不是氨基酸，而是一條N一連接糖鏈的末端糖，當該糖為D-GaINAc（乙酰氨基半乳糖）時，則為A型血，若為D-Gal（D-galactose ）則為B型血，若不含這兩種糖，而一條分枝上有L-Fuc（巖藻糖）則為O型血。 (5) 糖復合物與機體的病變有密切的關(guān)系 例如，類風濕病人免疫球蛋白G(IgG）糖鏈中Ga

7、l低于正常人，缺乏Gal的IgG構(gòu)型發(fā)生了變化，被人體當作異物而產(chǎn)生抗體，在血管和關(guān)節(jié)出現(xiàn)免疫復合物沉積，從而引發(fā)關(guān)節(jié)炎。 總之，像生物體內(nèi)其他物質(zhì)一樣，多（寡）糖的生物功能與生物體為適各種內(nèi)外部環(huán)境的壓力和變化而產(chǎn)生的一系列代謝機制有重要關(guān)系。這些功能不僅在正常細胞中起作用，而且也被病變細胞所利用。因此研究多（寡）糖的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系對生物學界、醫(yī)學界和藥學界都有十分重要的意義。如今一門新的學科糖生物學（glycobiology）的正在興起，并已成為主流學科一部分 。7.1.3 多聚糖的生理功能與糖復合物的研究相比多糖的研究要成熟很多，現(xiàn)在已經(jīng)有好幾個產(chǎn)品被應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。 目前，靈芝、茯苓及

8、香菇多糖注射液已被廣泛用于臨床治療各種腫瘤，牛膝寡糖作為免疫增強劑被深人研究。近年來多（寡）糖的增強免疫功能、抗癌、抗輻射、抗炎、降血糖等生理活性受到廣泛的重視 (1) 抗腫瘤 有些多糖能提高巨噬細胞MW的吞噬功能，誘導白細胞介素1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF)的生成，激活LAK細胞，在抗腫瘤中發(fā)揮直接的細胞毒作用。如：黑柄炭角菌多糖使腫瘤細胞增殖抑制率達85% -90%，對艾氏腹水癌細胞有明顯的殺傷作用。樹舌多糖使老鼠的荷瘤率降低，瘤重減輕。 多糖在腫瘤免疫治療中最重要的是顯示促進胸腺體液反應(yīng)，具“宿主中介作用”刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，提高宿主對癌細胞的特異抗原免疫反應(yīng)力。 云芝多糖、豬荃多

9、糖、香菇多糖、地黃多糖對小鼠S180肉瘤及其他癌細胞都有明顯的抑制作用 (2) 抗病毒 微生物細胞壁都有1-3一葡聚糖結(jié)構(gòu)，而自然界中的葡聚糖都以1，3結(jié)構(gòu)聚合而成，該結(jié)構(gòu)可能是動植物產(chǎn)生宿主防御機制的基本誘發(fā)原因，因而具有廣譜免疫調(diào)節(jié)作用，多糖類可通過類似的免疫調(diào)節(jié)機制增強宿主免疫功能以抵抗病原體的侵襲 。如：香菇多糖對泡狀日炎病毒感染引起的小鼠腦炎有顯著治療和預防作用，對阿伯耳病毒和十二型腺病毒感染也有效。 釀酒酵母葡聚糖能增強宿主對鼠肝炎病毒的抵抗力，使肝細胞壞死病變明顯減輕，對單純皰疹病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒和Riff Valley熱病毒也有抵抗作用。 (3）抗衰老 免疫系統(tǒng)與機體

10、的衰老有密切的關(guān)系，隨年齡增大，免疫功能下降或紊亂，結(jié)果胸腺萎縮，T細胞損耗，從而導致機體衰老，壽命縮短。多糖能從整體上提高機體免疫功能，從一定程度延緩衰老，防治老年病。 枸杞子多糖(LBP）、靈芝多糖、銀耳多糖、甘蔗多糖、黃精多糖具有明顯抗衰老作用。(4) 抗凝血作用 由六糖或八糖重復單位組成的肝素可抑制蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，有抗凝血作用?從褐藻掌狀昆布（Laminaria digitata）中提的昆布多糖對狗及豚鼠血液的研究證明，該多糖的硫酸化衍生物具有肝素一樣作用。 由1，4一聚渭-甘露糖醛酸和L一古羅糖醛酸組成的藻酸，硫酸化后也具抗凝血作用。海帶多糖除抗腫瘤作用外，在體內(nèi)外的實驗中均

11、表現(xiàn)出抗凝血作用。(5)降血糖作用 Konno等從人參中提得的5種多糖（panaxan），Takahashi等從知母提得4種多糖，Hiki加等從桑根皮提得的桑( moran )和從靈芝中的兩種靈芝多糖(ganoderan)，Konno等從烏頭提得4種烏頭多糖（aconitan），從紫草提得3種紫草多糖( lithosper-man），從雙蕙黃麻提得5種多糖（叩hedran)，從東蒼術(shù)提得3種蒼術(shù)多糖 。這些正常小鼠血糖有下降作用，下降量與劑量呈正相關(guān)，其中有些多糖對四氧噴陡小鼠有顯著降血糖作用 。(6) 降血脂作用 類肝素的結(jié)構(gòu)與肝素類似，能促進脂蛋白脂肪酶釋放，使血液中大分子的脂質(zhì)分解成小分

12、子，因而對血脂過多引起的血清渾、濁有澄清作用，也能明顯降低血清膽固醇。 (7) 類似腎上腺皮質(zhì)激素和促腎上腺皮質(zhì)激素作用 非致病菌光假孢桿菌( Pseudmonas fluoresecens）菌體提得的一種復合多糖-促皮質(zhì)糖(TTG) ，具有類似皮質(zhì)激素和促皮質(zhì)激素的作用，臨床上用于治療急慢性風濕性關(guān)節(jié)炎。 (8) 抗?jié)冏饔?IN eose公司研制的一種直接靶向幽門螺旋菌的抗?jié)児烟穷愃嶯E80 ，能與幽門螺旋菌結(jié)合，阻止其與胃腸受體相互作用的功能。(9) 阻抗放射性元素和毒素的吸收 1964年，Skoryna報道用藻酸鈉能顯著降低Sr在鼠消化道的吸收，有效地減少其在骨骼中的累積，并且含L一

13、古羅糖醛酸量越大，其阻吸作用越大。 此外，食物中的纖維素能阻抗人體對食品添加劑、農(nóng)藥、合成洗滌劑等有害物質(zhì)的吸收。多糖作為一類重要的生物活性物質(zhì)，雖然到目前為止，只有云芝多糖、豬苓多糖、香菇多糖、裂褶多糖、茯苓多糖等用于臨床。但它們在抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、治愈潰瘍等疑難病癥的治療方面已顯示了誘人的前景。 隨著多糖的制備、結(jié)構(gòu)，合成、藥理學及臨床學研究的不斷深人，多糖藥物將具有更廣闊的前景。 海洋微生物多糖 微生物多糖的廣泛研究和應(yīng)用主要局限于陸地。隨著對海洋微生物活性物質(zhì)的研究不斷深人，從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)多種有趣的有生物活性的化合物，但這些像具有生物活性的化合物在陸地卻沒有發(fā)現(xiàn)。 人

14、們不斷從海洋微生物中頻頻發(fā)現(xiàn)像瓊脂這樣陸地少有的聚糖物。這些事實說明海洋環(huán)境可能是海洋生物合成和降解像多糖這樣聚合物的有效資源。目前，海洋微生物多糖的研究主要集中在海洋微藻多糖和海洋細菌多糖，對海洋真菌多糖的研究較少。海洋細菌多糖 海洋細菌方面，各國科研工作者對深海熱水出口(deep-sea hydrothermalvent）附近采集來的微生物產(chǎn)生的多糖非常感興趣，因為深海熱水出口旁極端的環(huán)境（高壓，高溫度梯度，高濃度有毒物），產(chǎn)生的多糖在結(jié)構(gòu)和生物化學性質(zhì)方面有其特殊性。 海洋假單胞菌（Pseudoalteromonas）可產(chǎn)生一系列具生物活性的胞外產(chǎn)物，如抗體、酶、抗毒素及抗腫瘤和抗病毒的

15、物質(zhì)，其胞外多糖也引起了廣泛的關(guān)注。此外，近年來各國科學工作者還分離出許多有趣的多糖。Umezawa H等從海水、海泥和海草中分離出海洋細菌，經(jīng)過人工海水的培養(yǎng)后，從培養(yǎng)液中分離出167種胞外多糖，對這些多糖進行抗腫瘤活性篩選，有6%的多糖有明顯抗S180活性。其中有一種新的雜多糖marinactan,是由葡萄糖、甘露糖和巖藻糖按7:2:1的比例組成，對S180的抑瘤率為79%-90%。Raguenes G 4E391從深海水流中分離得到一種喜氧嗜溫異氧細菌ST716 0這種細菌在葡萄糖的批培養(yǎng)基中分泌出一種不同尋常的大分子質(zhì)量的多糖。這種多糖的黏度與另外一種在工業(yè)上有廣泛用途的黃單胞菌多糖的

16、黏度相同。該多糖含有葡萄糖，甘露糖，丙酮酸酸化的甘露糖，半乳糖及半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。海洋微藻多糖 海藻是生活在海水域中的光合植物，海藻按所含色素分為黃藻、金藻、藍藻、綠藻、褐藻和紅藻等，其中以藻體大、數(shù)量多、生長近海、較易采集而又有工業(yè)利用價值的是褐藻和紅藻。 海藻多糖是海藻中所含各種高分子碳水化合物，它們都是水溶性的，具有高黏度或凝固能力，這些海藻多糖也統(tǒng)稱海藻膠。瓊 脂瓊脂是一組海藻多糖的總稱。是由D-半乳糖和3,6一內(nèi)醚一L一半乳糖通過1-3和1-4交替連接的長鏈，在C6上被硫酸酯化，是一類含硫酸酯的半乳聚糖。海藻中的瓊脂有直鏈的，也有支鏈的，廣泛應(yīng)用在生化、臨床、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域，

17、瓊脂類硫酸多糖對B型感冒病毒、腮腺炎及腦膜炎病毒有一定的抑制作用?？?拉 膠角叉聚糖又稱卡拉膠，是由。一（13）一D一半乳糖殘基和(1-4)-D一半乳糖殘基交替連接的硫酸酯化的半乳聚糖，根據(jù)其主鏈結(jié)構(gòu)、硫酸根含量及連接位置等分為6類。現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)和使用的是K-體-卡拉膠，廣泛用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域，其具有抗凝血、降血脂、抑制病毒等作用。褐藻膠褐藻膠是從褐藻中分離提取的一種酸性多糖，是褐藻細胞壁的主要組分，是由-（14）-D甘露糖醛酸(M)，和a-(1-4)-D-古洛糖醛酸(G）不規(guī)則地連接起來的線型長鏈分子。其鈉鹽已廣泛應(yīng)用于制藥和食品工業(yè)。海洋生物多糖不僅僅在生物，醫(yī)藥方面有其重要用途，而且在

18、環(huán)境污染治理方面也有一定的應(yīng)用潛力，如Kong J由海洋細菌Zoogloea sp. (kccM 10036)產(chǎn)生的連胞多糖（CBT）可作為金屬離子的吸附劑和酶固定的載體。CBT在溶劑表現(xiàn)出對鉻，鉛和鐵離子有高的吸附率。在pH 5.0，25，l0mg/ml的每種金屬離子的溶液中，其吸附率達95。 多糖的研究方法 1多糖的分離及純化 (1)多糖的分離多糖的品種繁多，由于其結(jié)構(gòu)相似，因此分離方法大同小異。多糖中羥基較多，極性大，通常用不同溫度的水、稀堿溶液或稀酸溶液提取，也有用稀弱酸（乙酸）或苯酚溶液提取。 用堿或稀酸提取多糖，一般在較低的溫度下進行，以防止破壞糖苷鍵及水解多糖鏈上的基團：如硫酸酯

19、基、磷酸酯基等。 由于用水或堿提取的多糖的糖鏈上常連有蛋白質(zhì)或多肽鏈，因此可將水或堿提取的多糖粗制品再用蛋白酶水解。多糖粗提物含雜質(zhì)較多，主要為氨基酸肽、蛋白質(zhì)以及極性大的小分子和色素。肽和蛋白質(zhì)通常用Sevag法，三氟或三氯乙烷法和三氯乙酸法除去，前兩種方法多用于微生物多糖的提取，后一種方法多用于植物多糖的提取，3種方法均不適合糖肽，因為糖肽也會沉淀出來。 多糖中的色素多為酚類化合物，通常在堿性條件下以過氧化氫氧化法脫色。小的極性分子通過透析法除去。 粗多糖是分子質(zhì)量極不均勻的混合物，需要進行分級和純化。純化的方法很多，常用的方法有分步沉淀法、金屬離子絡(luò)合法、離子交換層吸法、凝膠過濾法等。色

20、譜技術(shù)也在糖的分離中得到應(yīng)用，親和色譜技術(shù)及制備型的高效液相色譜已應(yīng)用于糖的分離 分步沉淀法 分步沉淀法包括有機溶劑分步沉淀法和鹽析法。有機溶劑分步沉淀法是利用多糖在不同濃度的有機溶劑（常用醇或酮）中溶解度的差異，使不同分子質(zhì)量多糖沉淀出來。乙醇是應(yīng)用最廣泛的分部沉淀劑，簡單方便，成本低。 多糖在有機溶劑里溶解度小，在多糖的水溶液中加入乙醇破壞多糖溶劑化水膜，降低溶液介電常數(shù)，使多糖沉淀出來。加入低濃度的乙醇，分子質(zhì)量大的多糖先沉淀出來，依次增加乙醇的濃度得到分子質(zhì)量由大到小的多糖組分。因此乙醇沉淀法也用于多糖的分級。沉淀往往在pH7 0左右進行，在此條件下多糖較穩(wěn)定。鹽析法鹽析法是根據(jù)不同多

21、糖在不同鹽濃度中溶解度不同的性質(zhì)，加入鹽析劑使多糖逐步沉淀出來，常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸按等，但硫酸按最常用。 金屬離子絡(luò)合法金屬離子絡(luò)合法是根據(jù)多糖與金屬離子形成絡(luò)合物沉淀分離多糖，常用試劑有斐林試劑、氯化銅、氫氧化鋇和乙酸鉛等。所得沉淀經(jīng)水充分洗滌后，用5%無機酸乙醇溶液或硫化氫分解。季銨鹽沉淀法季銨鹽沉淀法利用季銨鹽與酸性多糖生成不溶于水的多糖化合物的特性，分離酸性多糖與中性多糖。常用的季銨鹽有溴代十六烷基三甲銨（CTAB），十六烷基鹽酸吡啶（CPC）。多糖季銨鹽復合物可溶于鹽溶液或有機溶劑中，季銨鹽可用透析法除去。 多糖季銨鹽復合物在不同鹽溶液中溶解度不同，可以利用這一性質(zhì)對

22、多糖進行分級。若用此方法沉淀中性多糖，多糖應(yīng)轉(zhuǎn)化為負離子，才能與季銨鹽生成沉淀，一般可使多糖形成硼酸鹽復合物或在很高的pH（至少大于9)條件下進行沉淀。 離子交換柱層析法離子交換柱層析法適用于分離各種酸性、中性多糖和黏多糖。常用的樹脂為DEAE-Sephadex, DEAE一纖維素和ECTEOLA-纖維素等。在pH6時，中性多糖不被吸附，酸性多糖很容易吸附在交換劑上。然后利不同濃度的緩沖劑進行洗脫，使酸性不同多糖依次洗脫下來，達到分離的目的。 凝膠過濾法凝膠過濾法又叫分子篩層析，此類層析的固相載體或介質(zhì)是一些多孔性或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，并且具有分子篩效應(yīng)，當含有不同大小分子的混合物流經(jīng)這一介質(zhì)時，能

23、將混合物中的各組分按分子大小進行分離，從而達到把分子大小不同的物質(zhì)分離開。其效果較好的有葡聚糖凝膠（Sephadex），聚丙烯酞胺凝膠（Bio-gel-p），瓊脂糖凝膠（Sepharose）等。 凝膠過濾常用不同濃度的鹽溶液洗脫，用硫酸-苯酚比色法或示差折射及紫外檢驗糖的濃度，最近有人用安培計檢驗，收集單一峰部分，為均一組分多糖。(2) 多糖的純度檢驗 經(jīng)過純化的多糖需要進行純度檢驗證明是否為均一組分多糖。多糖表現(xiàn)為微觀不均一性，其純度只代表相似鏈長的平均分布，所謂多糖純品實際上是一定分子質(zhì)量范圍的均一組分。要肯定某種多糖的均一性，需要幾種方法相互印證。常用純度檢驗方法有比旋光度法、超離心法、

24、電泳法和高效液相（凝膠）層析法。 比旋光度法比旋光度是物質(zhì)固有性質(zhì)，根據(jù)不同的多糖有不同的比旋光度，把多糖樣品制成半飽和水溶液，用不同濃度的乙醇把多糖沉淀出，分別測其比旋光度，若兩次比旋光度有相同的值，證明該多糖為均一組分。超離心法超離心法是利用物質(zhì)微粒在離心力場中沉降的速度與微粒的密度、大小和形狀的關(guān)系測定多糖分子純度。如果某一多糖在離心力場的作用，形成單一區(qū)帶，說明多糖分子有相同的沉度速度，說明多糖是均一組分。電泳法電泳法是根據(jù)多糖在電場作用下，按分子大小、形狀及所帶電荷不同而運動的距離不同的原理進行的，均一組分多糖有相同泳動速度，染色后呈現(xiàn)單一區(qū)帶，中性多糖不帶電荷，可以與硼砂結(jié)合形成帶

25、電荷的復合物進行電泳。電泳法有：醋酸纖維薄膜電泳法、聚丙烯酞胺凝膠電泳法和高壓電泳法。凝膠過濾法凝膠過濾法不僅可純化多糖，也可以用于純度鑒定。由于凝膠具有一定大小的孔徑，故不同形狀和大小的多糖分子在凝膠層析柱移動速度亦不同，較大分子移動快，小分子移動慢，流出液經(jīng)示差檢測或硫酸一苯酚法檢驗，如為一對稱峰，則為均一組分。(3）多糖的分子質(zhì)量測定 多糖分子質(zhì)量測定是研究多糖性質(zhì)一項重要工作，但至今仍是一個復雜的問題。多糖是高分子物質(zhì)，有高分子物質(zhì)的共性，常用測定高分子分子質(zhì)量的方法都可用于測定多糖分子量，如黏度法、滲透壓法、蒸氣壓法、光散射法、超離心法，因組成不同也有其特性，如端基法、凝膠過濾法。現(xiàn)

26、代質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，使多糖分子質(zhì)量的測定變?yōu)榭旖?、方便?第八章 海洋微生物的細菌視紫紅質(zhì) 蛋白質(zhì)是3種生物大分子中研究得最詳細的一個，2000年人們在海洋細菌中發(fā)現(xiàn)了一種細胞膜蛋白細菌視紫紅質(zhì)(bacteriorhodopsin )。這是第一次在海洋中發(fā)現(xiàn)這種膜蛋白，具有重要意義。 眾所周知，太陽是地球能量的惟一源泉，幾乎所有生物的能量都是直接或間接的來自太陽能。自然界中存在著兩類利用光能的生物系統(tǒng)：葉綠素的光合作用細菌視紫紅質(zhì)（bacteriorhodopsin，簡稱BR）的離子泵作用。 前者一直是新陳代謝研究中的核心問題后者于20世紀60年代被發(fā)現(xiàn)于死海中的嗜鹽菌（一種古細菌）的細胞膜上，

27、因其具有類似于脊椎動物視網(wǎng)膜上的光敏蛋白視紫紅質(zhì)(rhodopsin)的二級結(jié)構(gòu)和生理功能而得名。含視紫紅質(zhì)微生物種類嗜鹽菌是一種較原始的古生細菌，直到1999年，人們發(fā)現(xiàn)了大約30種細菌視紫紅質(zhì)（BR）它們都來自于嗜鹽菌。1999年J A Bieszke等在一種真菌脈孢菌( Neurospora )中發(fā)現(xiàn)了細菌視紫紅質(zhì)。2000年Oded Beja等在-proteobacteria中、2002年Sineshchekov等在綠藻Chlamydomonas中都發(fā)現(xiàn)這類物質(zhì)。 -proteobacteria是一種分布很廣的海洋細菌，在-proteobacteria中發(fā)現(xiàn)細菌視紫紅質(zhì)對研究地球生物圈

28、中的能量流動、碳素循環(huán)等問題都有重大的意義。 嗜鹽菌的細菌視紫紅質(zhì) 嗜鹽菌顧名思義是生活在高鹽濃度環(huán)境下的一種細菌，主要分布在死海、大鹽湖等高鹽度咸水湖和曬鹽場高濃度鹽池中。 1971年，Stoeckenius, Oesterhelt和Blaurock在研究的最詳細的嗜鹽菌鹽桿菌中發(fā)現(xiàn)了后來被稱為細菌視紫紅質(zhì)的蛋白質(zhì)色素 嗜鹽菌是一類古生細菌，生長在濃度15%以上的鹽域中，最適宜的鹽濃度為25%一30 %。嗜鹽菌的細胞膜因含有類胡蘿卜素而發(fā)紅，因而被稱為紅膜（red membrane）。這類細菌的新陳代謝很有特點，當氧氣充足時通過紅膜中的氧化磷酸化酶獲得能量。 缺氧的時候，紅膜上會出現(xiàn)紫色斑塊

29、，即紫膜（purple membrane），紫膜直徑大約為0.5m，厚度3nm，蛋白質(zhì)約占干重的75，其余25為類脂，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分子比約為7：1。細菌視紫紅質(zhì)是紫膜中蛋白的唯一成分它以三聚體的形式排列成二維六角形晶格，晶格尺寸為14nm，兩個蛋白質(zhì)中心相距1. 5nm，每個紫膜中大約含有10萬個細菌視紫紅質(zhì)分子。 從幾何上來說，六角形晶格是一種非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這可能就是紫膜異常堅固的內(nèi)在原因之一。 在細胞膜里，脂質(zhì)排列成雙分子層，細菌視紫紅質(zhì)的氨基酸鏈卷曲成7個螺旋，它們與脂質(zhì)雙分子層垂直，并排排列成一圈，整個分子就像懸浮在脂質(zhì)海洋中的一個個浮筒。視紫紅質(zhì)的生物功能在嗜鹽菌中，視紫紅質(zhì)的主

30、要作用是質(zhì)子泵。即在光驅(qū)動下，視紫紅質(zhì)從細胞質(zhì)一側(cè)（cytoplas-mic）吸收一個質(zhì)子，向細胞外一側(cè)（extracellular）釋放一個質(zhì)子。這樣的單向質(zhì)子通道產(chǎn)生了一個跨越細胞膜的質(zhì)子梯度，在紅膜中的H十一ATP酶可以利用細胞膜兩側(cè)的質(zhì)子濃度差把磷酸鹽和ADP合成ATP，為細菌提供能量。細菌視紫紅質(zhì)，是人類在生物界中發(fā)現(xiàn)的第二種光能轉(zhuǎn)化為化學能的途徑，對人們認識生物圈中能量的利用和轉(zhuǎn)化有重要意義。另外人們還發(fā)現(xiàn)，細菌視紫紅質(zhì)有著優(yōu)良的光學、電學性能，非常適用于生物芯片計算機、海量三維光學存儲器等新一代的光電機器。在海洋中發(fā)現(xiàn)細菌視紫紅質(zhì)，為人們研究細菌視紫紅質(zhì)提供了更多的材料。-pro

31、teobacteria中細菌視紫紅質(zhì)的結(jié)構(gòu) 通過對-proteobacteria中細菌視紫紅質(zhì)基因的研究，發(fā)現(xiàn)這種細菌視紫紅質(zhì)由249個氨基酸組成。分子質(zhì)量大約27kD。根據(jù)疏水作用作圖，我們可以得到它的結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)它是一個典型的細菌視紫紅質(zhì)蛋白，有7個a螺旋(ABCDEFG），與視黃醛結(jié)合的位置在G螺旋的賴氨酸上。 比較這三個蛋白的結(jié)構(gòu)可以看出：各種細菌視紫紅質(zhì)雖然在氨基酸順序上并不相同，但卻具有相同的二級結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵位點上的氨基酸，如G螺旋上的賴氨酸、C螺旋上的天冬氨酸等。這些都說明它們應(yīng)具有相似的生理功能。事實也證明了這一點，在新發(fā)現(xiàn)的幾種細菌視紫紅質(zhì)，都觀測到和嗜鹽菌中相似質(zhì)子泵作用。 細

32、菌視紫紅質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析細菌視紫紅質(zhì)排列相當規(guī)則且呈膜片狀，這使它成為X射線衍射、電子顯微鏡的理想研究對象，二十多年來細菌視紫紅質(zhì)已成為生物膜結(jié)構(gòu)研究中最為清楚的膜蛋白之一。 1975年，Henderson首次解析得到了分辨率為0.7nm的細菌視紫紅質(zhì)晶格結(jié)構(gòu)。 隨著，超低溫電子顯食鏡的應(yīng)用，電子顯微鏡三維重構(gòu)技術(shù)、X射線晶體衍射技術(shù)的發(fā)展，目前已在0 .155nm的水平上揭示了細菌視紫紅質(zhì)各種動力學、熱力學性質(zhì)。細菌視紫紅質(zhì)在空間卷曲折疊成7條跨膜的a螺旋，每條螺旋長度在3.5-4.0nm之間，螺旋柱基本垂直于細胞膜，N端在細胞外側(cè)，C端在細胞內(nèi)側(cè)。7個螺旋體中3個在一起組成內(nèi)環(huán)，另外4個組成外

33、環(huán)，中間包埋著一個維生素A醛被稱為視黃醛（retinal）。 視黃醛分子和7個螺旋基本垂直，它的醛基和G螺旋上的一個賴氨酸形成希弗堿，另一端楔入蛋白深處。質(zhì)子泵循環(huán)中，視黃醛呈現(xiàn)兩種異構(gòu)體，“13一順式（13 - cis）”和“全反式（all-trans）”。 在黑暗中，含有這兩種異構(gòu)體的細菌視紫紅質(zhì)分子數(shù)量相等。當光照時，因為存在一個分支的途徑使“13一順式”轉(zhuǎn)人到“全反式”，而負反應(yīng)很慢，因此光照下“13一順式”視黃醛很快消失，只有含有“全反式”視黃醛的細菌視紫紅質(zhì)分子參與質(zhì)子泵循環(huán)。 細菌視紫紅質(zhì)的質(zhì)子泵效應(yīng) 對于嗜鹽菌等細菌來說，細菌視紫紅質(zhì)的主要生理作用就是光直接驅(qū)動下單向的運輸質(zhì)子

34、，而這也正是三十多年來來自不同領(lǐng)域的科技工作者最感興趣的地方。細菌視紫紅質(zhì)可以在細胞膜兩側(cè)形成很大的質(zhì)子梯度。例如Beja等測量-proteobacteria的細菌視紫紅質(zhì)，在光照開始后2min電勢差就達到一90mv。嗜鹽菌中的視紫紅質(zhì)最高可產(chǎn)生一250mV的電勢差。質(zhì)子泵循環(huán) 視黃醛分子是質(zhì)子泵的發(fā)動機。當光照時，視黃醛分子在幾個皮秒內(nèi)構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)變，從全反式（all-trans）變?yōu)?3-順式（13-cis）。 視黃醛與Lys-216相連的（即希弗堿處）一端延著雙鍵扭曲，使N上的質(zhì)子處在一個不穩(wěn)定的環(huán)境下，經(jīng)過大約50ms之后，這個質(zhì)子經(jīng)過Tyr89傳遞到Asp85,在這個過程中，C螺旋微微

35、的移動使Asp85更靠近N原子，幫助質(zhì)子的轉(zhuǎn)移。 視黃醛脫去質(zhì)子后從粉紅色變?yōu)辄S色，并伸直。由于視黃醛兩端是固定的，這個動作使N原子向上移動了大約0.07一O.lnm，碰到了F螺旋上的一些支鏈較大的氨基酸殘基。 通過杠桿作用，F(xiàn) 螺旋向外擺動了大約0.35nm，此時G螺旋的頂部也向F螺旋靠攏。這一系列動作使視黃醛又從Asp96處獲得一個質(zhì)子，重新變得彎曲。 G螺旋和F螺旋向原位回擺，Asp96得以重新質(zhì)子化。同時，Asp85上的質(zhì)子被轉(zhuǎn)移至細胞外側(cè)水分子的擴展氫鍵網(wǎng)絡(luò)中。帶正電荷的Arg82側(cè)鏈向二價基Glu194 /G1u204方向運動，對質(zhì)子向細胞外側(cè)釋放起到了推動作用。 最后，視黃醛弛豫

36、回全反式的構(gòu)型，G和F螺旋擺回原來的位置，重新開始下一個循環(huán)。 海洋浮游細菌中發(fā)現(xiàn)細菌視紫紅質(zhì)的生態(tài)學意義 -proteobacteria是一種分布較廣海洋浮游細菌，從近岸水域到大洋深處，從太平洋到大西洋人們都曾發(fā)現(xiàn)它的蹤跡6221。這些數(shù)據(jù)也表明-proteobacteria主要分布于表層海水。 Bej a等人應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)在-proteobacteria中發(fā)現(xiàn)細菌視紫紅質(zhì)。這個發(fā)現(xiàn)，對人們認識生物圈能量流動有重要的意義。傳統(tǒng)上，人們先人為主的認為海洋里發(fā)生著和陸地上大同小異的事情：浮游植物通過體內(nèi)的細菌葉綠素利用太陽能將海水中的二氧化碳轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物質(zhì)儲存起來，放出氧氣；浮游動物和魚

37、類消耗浮游植物所固定的碳，并利用溶解于海水中的氧氣進行呼吸，放出二氧化碳。 海洋中的微生物，近年來，愈來愈多的新發(fā)現(xiàn)動搖了傳統(tǒng)的看法，現(xiàn)在，海洋生態(tài)學家們認為海洋中的能量流動和物質(zhì)循環(huán)遠遠不像原先想象的那樣簡單，有好幾個不同的途徑共存。Beja的發(fā)現(xiàn)就是其中重要的一個。雖然還沒得到有關(guān)-proteobacteria細菌視紫紅質(zhì)在物質(zhì)循環(huán)（主要是碳素循環(huán)）中作用的數(shù)據(jù)，但可以肯定在能量流動中它扮演著重要的角色。 據(jù)估計，每年這種細菌視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)化的光能占全部生物轉(zhuǎn)化光能的10%。有人認為，這一系列的發(fā)現(xiàn)可能是自列文虎克發(fā)現(xiàn)“小動物，（細菌）以來對生態(tài)學最大的沖擊。 細菌視紫紅質(zhì)的提取 無論是對細菌

38、視紫紅質(zhì)進行理論科學研究，還是今后對其進行大規(guī)模的開發(fā)利用，分離提取都是重要的課題。首先是菌種的培養(yǎng)將分離純化后的啥鹽菌菌種接種在已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基，在38恒溫箱中培養(yǎng)4-5d。待菌體變紅后，按此法活化一次?；罨蟮木w就可以應(yīng)用于大規(guī)模的培養(yǎng)。 嗜鹽菌大規(guī)模培養(yǎng)分兩個階段：第一階段用加氧泵和日光燈不停的通氣和照射，使嗜鹽菌快速生長。培養(yǎng)5-7d后，嗜鹽菌大量繁殖，因嗜鹽菌細胞膜呈紅色（紅膜），所以培養(yǎng)基變紅且渾濁。 第二階段，停止通氣并隔絕空氣，繼續(xù)光照710d，因為缺氧、增鹽菌必須通過細菌視紫紅質(zhì)吸收光能，這時嗜鹽菌細胞膜上出現(xiàn)紫色斑點即紫膜。紫膜就由細菌視紫紅質(zhì)組成。待到菌體不再變紅，就可

39、以收集菌體了。離心收集菌體后，加入10倍體積的蒸餾水，在水的低滲作用下，嗜鹽菌細胞膜破裂，紫膜因為其堅固的晶格結(jié)構(gòu)得以保留下來。加人Dnase水解核酸，離心收集沉淀，蒸餾水懸浮沉淀，然后勻漿、再離心，重復兩次。純化和其他蛋白一樣，細菌視紫紅質(zhì)的純化可以采用密度梯度離心、電泳、凝膠過濾等多種方法。密度梯度離心經(jīng)過上述分離后大部分的紅膜已經(jīng)除去了，但從光譜中可以看到仍含有一定量的紅膜。紅膜的密度為1.16g/cm,紫膜密度為1.18g/cm，常規(guī)的離心法不能將它們分開，可采用蔗糖密度梯度離心法。 選擇35%的蔗糖(p =1.14g/cm3)、43%的蔗糖(p1.18g/cm3）和60%的蔗糖(p1

40、.23g/cm3）制備成不連續(xù)的密度梯度，離心后紫膜聚集在43%的蔗糖層的底部，紅膜在35蔗糖層，其他沉降系數(shù)比紫膜大的雜蛋白、膜碎片則沉淀在60蔗糖層的底部。細菌視紫紅質(zhì)的應(yīng)用 細菌視紫紅質(zhì)能將光能轉(zhuǎn)變成質(zhì)子的單向運動即電流，也就是說，它可以作為光電轉(zhuǎn)換的介質(zhì)。與其他介質(zhì)相比細菌視紫紅質(zhì)具有很多突出的優(yōu)點： 反應(yīng)速度快，整個光循環(huán)在毫秒數(shù)量級。 分子尺度級別的響應(yīng)單元帶來了很高的分辨率，大于5000線/Mm. 吸收面積大，可利用較弱的光能。 光學靈敏度高，10-3J/cm2。光循環(huán)過程中具有多個中間態(tài)，且吸收波長相差大有利于制作雙穩(wěn)態(tài)器件。良好的雙光子吸收性能，可用于制作海量三維光存儲器。 溫度適應(yīng)性強，從-30-140不變性。 在器件要求的干膜條件下，仍有很強的光學活性。 具有良好的非線性光學性能，可以用LB膜及聚合物旋轉(zhuǎn)沉積等技術(shù)形成性能良好的薄膜 來源于微生物，可大量繁殖和培養(yǎng)，極具商業(yè)前景。 天然微生物材料，不會對人類自然界造成傷害和環(huán)境污染。 可以與高分子材料進行特殊工藝混合，從而在光學均勻性、分子排列結(jié)構(gòu)和物理強度等方面得到改善。 可以通過不同的組裝技術(shù)，組成不同的分子排列形式和結(jié)晶的分子膜系統(tǒng)。 如此多的優(yōu)點，使細菌視紫紅質(zhì)有著廣闊