細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)五秋水仙素遺傳毒性的檢測(cè)

1、細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)秋水仙素遺傳毒性檢測(cè)山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆招∈蠊撬杓?xì)胞染色體的制備方法。了解小鼠染色體的基本特征。了解染色體畸變的產(chǎn)生機(jī)制。實(shí)驗(yàn)原理染色體畸變只能在細(xì)胞分裂的中期相進(jìn)行觀察和分析。為了收集足量的中期相細(xì)胞，在收獲細(xì)胞前用秋水仙堿或者乙酰甲基秋水仙堿處理，從而阻斷微管蛋白的聚合，抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成，使分裂間期和前期的細(xì)胞停留于中期相。制備的細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)低滲，使染色體能夠均勻散開(kāi)，然后固定、染色，油鏡下鏡檢。實(shí)驗(yàn)用品1器材：解剖器具、注射器、離心機(jī)、離心管、恒溫水浴箱、載玻片、酒精燈等.2試劑 0.1%秋水仙素溶液、Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸3：1;甲醇：

2、冰醋酸1：1 ）、0.075 mol / L KCI溶液、Giemsa染液等。 3材料：小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將小鼠隨機(jī)分成兩組實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)200mg/kg環(huán)磷酰胺實(shí)驗(yàn)前1-2小時(shí)0.5%秋水仙素0.1ml/只對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前1-2小時(shí)0.5%秋水仙素0.1ml/只實(shí)驗(yàn)步驟注射量隨動(dòng)物種類(lèi)不同而異。秋水仙素的主要作用是使分裂細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期，增加中期分裂相的比例。 引頸處死或斷頭處死小鼠。取出小鼠的前肢骨和后肢骨，注意不要將股骨剪斷，否則容易造成骨髓細(xì)胞的流失。滴加適量生理鹽水進(jìn)行沖洗，并仔細(xì)地將皮膚、肌肉等組織清除干凈。加入少量低滲液，用剪刀將骨充分剪碎，并用吸管吹打，使骨髓細(xì)胞全部釋放出來(lái)

3、。用濾網(wǎng)將獲得的液體過(guò)濾到離心管中，加低滲液至8ml左右室溫下靜置20-30分鐘，進(jìn)行低滲。低滲結(jié)束后，加入1mlCarnoy固定液進(jìn)行預(yù)固定（5分鐘左右），輕輕混勻后，離心。1200轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清，加入固定液6ml，混勻后，室溫固定30分鐘，再次離心去上清，重復(fù)固定一次，離心后，根據(jù)沉淀的體積向沉淀中加入0.5-1ml預(yù)冷的固定液（甲醇：冰醋酸=1：1），將細(xì)胞重懸。預(yù)冷的玻片滴片后，須將片子晾干，再滴加適量Giemsa染液染色10-15分鐘，棄去染液，水洗，鏡檢。結(jié)果顯示有絲分裂指數(shù)（mitoticindex）：某一分裂組織或細(xì)胞群中，處于有絲分裂M期的細(xì)胞數(shù)占其總細(xì)胞數(shù)的百分

4、數(shù)。 分裂相細(xì)胞數(shù)有絲分裂指數(shù) = 細(xì)胞總數(shù)實(shí)驗(yàn)組（環(huán)磷酰胺）對(duì)照組有絲分裂指數(shù)平均值取秋水仙素不同劑量組染色體制片，各隨機(jī)選取3-5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)各視野內(nèi)的有絲分裂指數(shù)，并可對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)），比較兩組數(shù)據(jù)有無(wú)顯著性差異。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)小鼠解剖殘?jiān)灰湃胂滤?。?shí)驗(yàn)結(jié)束后，請(qǐng)將實(shí)驗(yàn)用小鼠及垃圾放入垃圾袋，值日生務(wù)必帶走。實(shí)驗(yàn)中使用的過(guò)濾細(xì)胞的尼龍濾網(wǎng)請(qǐng)勿丟棄，實(shí)驗(yàn)完畢后放入白瓷盤(pán)并用玻璃漏斗或試劑瓶壓住。將小鼠分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠大劑量注射環(huán)磷酰胺溶液一次。實(shí)驗(yàn)前三天，每天向小鼠（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組）腹腔注射2%的蛋白胨溶液1ml，實(shí)驗(yàn)前30min，向腹腔內(nèi)注射1%雞

5、紅細(xì)胞1ml。引頸處死吸取腹腔液分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠各1只，同時(shí)準(zhǔn)備好玻片，做好標(biāo)記，分別取材，制備腹腔液涂片。在干凈的載玻片上滴加一滴生理鹽水，向其中滴加一滴腹腔液，靜置10分鐘，使腹水細(xì)胞貼壁，棄去生理鹽水，待其稍干后，進(jìn)行瑞氏染色(濃染1-2min，淡染3-5min)。未被吞噬的雞紅細(xì)胞吞噬了雞紅細(xì)胞的吞噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)報(bào)告鏡檢時(shí)，你能在視野中看到幾種類(lèi)型的細(xì)胞？計(jì)算吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分?jǐn)?shù)。 活化的吞噬細(xì)胞的數(shù)量吞噬百分?jǐn)?shù)= 100個(gè)吞噬細(xì)胞 活化的吞噬細(xì)胞中吞噬的雞紅細(xì)胞的總量吞噬指數(shù)= 100個(gè)活化的吞噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組吞噬百分?jǐn)?shù)吞噬百分?jǐn)?shù)平均值吞噬指數(shù)吞噬指數(shù)平均值在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腹腔液涂片上各隨機(jī)選取多個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)各視野內(nèi)的吞噬百分