生物《基因工程的基本操作程序》

1、 基因工程(jyn gngchng)的基本操作程序共二十八頁思考(sko):轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的大致培育過程? 基因工程(jyn gngchng)的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定共二十八頁一、目的基因(jyn)的獲取主要是編碼(bin m)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因現(xiàn)代獲取方法：1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成初始目的基因的來源從生物中直接獲取人工合成共二十八頁外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)原核生物(shngw)基因真核生物

2、(shngw)基因共二十八頁1、從基因文庫中獲取目的(md)基因 將含有某種生物不同(b tn)基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同(b tn)基因，稱為基因文庫?；蛭膸?基因組文庫部分基因文庫(CDNA文庫)共二十八頁某生物體內(nèi)全部(qunb)DNA 許多(xdu)DNA片段受體菌群體1、從基因文庫中獲取目的基因限制酶與運(yùn)載體連接 導(dǎo)入基因組文庫某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接 導(dǎo)入部分基因文庫（cDNA文庫）共二十八頁2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的(md)基因 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)?？?/p>

3、以獲得大量(dling)的目的基因。共二十八頁循環(huán)(xnhun)變性退火延伸共二十八頁緩沖液需要(xyo)為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，熱穩(wěn)定DNA聚合酶，存在(cnzi)于緩沖液中，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。Taq DNA聚合酶的應(yīng)用高溫解決了打開雙鏈的問題，但又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化。共二十八頁 PCR的反應(yīng)(fnyng)過程1、PCR的反應(yīng)(fnyng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性和延伸

4、變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解鏈，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。2、循環(huán)過程共二十八頁靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步：高溫(gown)變性共二十八頁復(fù)性（退火(tu hu)） 低溫復(fù)性模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度(wnd)降低，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。共二十八頁延伸(ynshn) 中溫延伸DNA模板引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則(yunz)與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈。共二十八頁靶序列靶序列引物

5、引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸共二十八頁循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列(xli)擴(kuò)增的數(shù)量共二十八頁二.基因表達(dá)載體(zit)的構(gòu)建-核心共二十八頁基因(jyn)表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子(fnz)限制酶處理兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端共二十八頁復(fù)制原點(diǎn)+啟動(dòng)子+目的(md)基因+終止子+標(biāo)記基因基因表達(dá)載體(zit)的組成共二十八頁三、將目的(md)基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化常用(chn yn)的受體細(xì)胞： 有大腸桿菌、枯草

6、桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。共二十八頁三、將目的(md)基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的(md)基因?qū)胫参锛?xì)胞-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法共二十八頁三、將目的(md)基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的(md)基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植共二十八頁三、將目的(md)基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参?zhw)細(xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸?/p>

7、物細(xì)胞Ca2+處理共二十八頁四、目的(md)基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)(jin c)鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交DNA-RNA分子雜交法分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交共二十八頁基因工程(jyn gngchng)的基本操作程序目的基因(jyn)的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成復(fù)制原點(diǎn) + 目的基因 + 啟動(dòng)子 + 終止子 + 標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍

8、法、花粉管通道法、顯微注射法、Ca2+處理法DNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原抗體雜交技術(shù)分子檢測(cè)外的個(gè)體水平鑒定共二十八頁鞏固(gngg)練習(xí):1.人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗生素抗性基因,該抗性基因的主要作用是 ( )A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B.有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C.增加質(zhì)粒分子的分子量D.便于與外源基因連接2.在遺傳工程技術(shù)中,限制性內(nèi)切酶主要用于 ( )A.目的基因的提取和導(dǎo)入B.目的基因的提取和檢測(cè)C.目的基因與載體的結(jié)合和導(dǎo)入D.目的基因的提取與載體結(jié)合BD共二十八頁3.在遺傳工程技術(shù)(jsh)中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得 (

9、 )A.人的胰島素基因 B.蠶的蠶絲蛋白基因C.芽孢桿菌的抗蟲基因 D.菜豆儲(chǔ)藏蛋白基因4.1976年,美國的科學(xué)家首次將人的生長(zhǎng)抑制素釋放因子的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌,并獲得了表達(dá),此文中的表達(dá)是指該基因在大腸桿菌 ( )A.能進(jìn)行DNA復(fù)制B.能傳遞給細(xì)菌后代C.能合成生長(zhǎng)抑制素釋放因子D.能合成人的生長(zhǎng)素CC共二十八頁5.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的,在基因操作的基本步驟中,不進(jìn)行減基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 ( )A.人工合成目的基因B.目的基因與載體結(jié)合(jih)C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C共二十八頁內(nèi)容摘要基因工程的基本操作程序。將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。與運(yùn)載體連接 導(dǎo)入。DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，熱穩(wěn)定DNA聚合酶，存在于緩沖液中，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR一般經(jīng)歷三十多次循