《儀器分析》課件第五章 分子發(fā)光分析法

1、光源單色器液池檢測(cè)器單色器檢測(cè)器I0ItIfUV-Vis:定量A=lg(I0/It)= kbc 定性 maxmaxem發(fā)光:定量If= kc 定性 ex, em分子吸收光譜法與分子發(fā)光光譜法的比較第五章 分子發(fā)光分析法 分子發(fā)光現(xiàn)象及類型 分子熒光的產(chǎn)生 熒光分析儀器 熒光效率及影響因素 磷光分析法及化學(xué)發(fā)光分析法 熒光光譜及定量第一節(jié) 方法概述一、分子發(fā)光分析法及其分類某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來的分析方法為分子發(fā)光分析法基態(tài)分子激發(fā)態(tài)分子hE生化反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)光電基態(tài)分子激發(fā)態(tài)分子二、分子發(fā)光分

2、析法分類 三、分子熒光分析法的特點(diǎn)1. 靈敏度高 檢測(cè)限熒光分析法比分光光度法低24個(gè)數(shù)量級(jí)？3. 實(shí)驗(yàn)方法簡單2. 選擇性好4. 待測(cè)樣品用量少；儀器價(jià)格適中？5. 應(yīng)用范圍較廣（尤其是生命科學(xué)領(lǐng)域）基因組測(cè)序第二節(jié) 熒光和磷光光譜法一、熒光和磷光的產(chǎn)生1. 電子自旋狀態(tài)的多重性ES0S1T1C=O基態(tài)單重態(tài)第一激發(fā)單重態(tài)第一激發(fā)三重態(tài)單重態(tài)分子具有抗磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-8S三重態(tài)分子具有順磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-41S2. 分子內(nèi)各種光物理過程T1VR（10-1410-12 s）VRICS0S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：體系間竄躍F: 熒光P：磷光AA

3、VRICFISCP熒光壽命：10-910-6s磷光壽命：10-310s波長：AFPISC（10-1310-11 s）(2) 分子去激化（退激）過程a. 無輻射去激體系內(nèi)的多余的能量以熱的形式釋放，不伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過程叫無輻射去激。振動(dòng)馳豫(Vibrational Relaxation) 同一電子能級(jí)較高振動(dòng)能級(jí)到較低振動(dòng)能級(jí)內(nèi)部轉(zhuǎn)換（Internal Covertion） 相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換 S-S體系間竄躍（Inter System Crossing） 不同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換 S-T(1) 分子激發(fā)（吸收）過程b. 輻射去激處于S1或T1態(tài)的電子返回S0態(tài)時(shí)，伴隨有發(fā)光現(xiàn)象，這種過程叫輻

4、射去激 熒光（Fluorescence） 從第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)S0各振動(dòng)能級(jí)所產(chǎn)生的光輻射叫熒光 磷光（Phosphorescence） 從T1最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)所發(fā)射的光叫磷光 * 易產(chǎn)生熒光n * 易產(chǎn)生磷光二、熒光效率及影響因素 f =發(fā)熒光的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)1. 熒光效率f Kf 為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)若以各種躍遷速率常數(shù)來表示 f 反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力， f 越大，熒光越強(qiáng).Ki 為非輻射躍遷的速率常數(shù)之和主要取決于化學(xué)環(huán)境，也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)分析上有應(yīng)用價(jià)值的熒光化合物的熒光效率在0.11之間2. 熒光效率與分子

5、結(jié)構(gòu)關(guān)系（1） 大的共軛鍵體系f ex /nm em /nm 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400 350線狀結(jié)構(gòu)比非線狀結(jié)構(gòu)的熒光波長長 芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光 多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測(cè)定 ex = 386 nm em = 430 nm3，4 - 苯并芘是強(qiáng)致癌物（2） 剛性平面結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)熒光素f=0.92酚酞f=0聯(lián)苯f=0.18芴f=1大多數(shù)無機(jī)鹽類金屬離子，不能產(chǎn)生熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，可用于痕量金屬離子的測(cè)定（3）取代基的類型-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2給電子

6、基團(tuán)增強(qiáng)熒光吸電子基團(tuán)減弱熒光-COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH影響不明顯的取代基-NH3+、-R、- SO3H重原子熒光減弱、磷光增強(qiáng)-F、-Cl、-Br、- I3、環(huán)境對(duì)熒光、磷光的影響(1) 溶劑的影響一般來說，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長長移，熒光強(qiáng)度增大(2) 溫度的影響Kf基本不隨溫度變，而Ki隨溫度升高顯著增大。低溫下測(cè)定，提高靈敏度溫度升高熒光效率下降(3) pH的影響影響熒光強(qiáng)度和波長(5)水中溶解氧(4)表面活性劑的影響降低熒光效率*非極性溶劑中極性溶劑中E非E極四、熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系If熒光強(qiáng)度Ia吸收的輻射強(qiáng)度I0入射光強(qiáng)度 If = f （

7、I0- I010-A） = f I0 （1-10-A ）I = I010-A將上式展開If = f Ia= f （I0- I ）當(dāng)A0.05時(shí)：If = 2.3 f I0A =2.3 f I0 bc對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長和強(qiáng)度一定時(shí)， f 、I0、 和b為常數(shù)，合并為K If = KC定量分析依據(jù)1、定量關(guān)系式只有在極稀的溶液中熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線形關(guān)系If = 2.3 f I0A =2.3 f I0 bc濃度高時(shí)， If與C不呈線形關(guān)系，有時(shí)C增大， If反而降低，發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)熒光測(cè)定的是微量或痕量組分，靈敏度高A0.052、熒光猝滅(1) 涵義：熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化

8、學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降或熒光效率f 下降稱為熒光猝滅。(2) 熒光猝滅劑：使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑(3) 熒光機(jī)理：碰撞猝滅M +激 M*M* + Q M + Q +熱自熄滅熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象光源激發(fā)單色器液池檢測(cè)器發(fā)射單色器檢測(cè)器放大器及記錄器exemI0五、熒光分析儀器與熒光光譜ItIf高壓汞燈和氙弧燈光柵石英材料的方形池光電倍增管1. 熒光分析儀器2. 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(1) 激發(fā)光譜: 是在固定熒光波長(em)下，測(cè)量熒光體的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(ex)變化的光譜。(2) 發(fā)射（

9、熒光）光譜: 是在固定激發(fā)波長下，測(cè)量熒光體的熒光強(qiáng)度隨發(fā)射波長變化的光譜。激發(fā)光譜實(shí)質(zhì)上是熒光物質(zhì)的吸收光譜。熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系(nm)3. 性能 選擇性熒光分析法與紫外可見吸收法的異同2. 儀器 靈敏度 1. 原理 UV-VismaxFex ；emT=It/I0If = 2.3 f I0 bc增大激發(fā)光強(qiáng)度使用靈敏度更高的檢測(cè)器吸收法只能選擇吸收波長熒光法不僅能選擇激發(fā)波長；還能選擇發(fā)射波長400360040第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光是利用化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象所建立的分析方法一、概述化學(xué)發(fā)光與熒光的主要區(qū)別：受激發(fā)時(shí)所需的能量來源不同，需要化學(xué)反應(yīng)過程中所提供的化學(xué)能化

10、學(xué)發(fā)光分析具有以下特點(diǎn)：靈敏度高線性范圍寬儀器設(shè)備簡單，成本低廉分析速度快，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化局限性：可供發(fā)光用的試劑有限 發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理(2) 處于激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)1. 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基本條件(1) 化學(xué)反應(yīng)必須產(chǎn)生足夠的化學(xué)能A + B C* +D具有過氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿足要求C* C + h 產(chǎn)物接受反應(yīng)能被激發(fā)在可見光區(qū)觀察化學(xué)發(fā)光，需170-300kJmol-1激發(fā)能?；瘜W(xué)反應(yīng)多是在有O3、H2O2等參加的高能反應(yīng)中2. 化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強(qiáng)度(1) 化學(xué)發(fā)光效率CL激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率F 與熒光效率

11、的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響激發(fā)態(tài)分子數(shù)發(fā)射的光子數(shù)參加反應(yīng)的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子數(shù)參加反應(yīng)的分子數(shù)發(fā)射的光子數(shù)=frCLr 取決于發(fā)光所依據(jù)的化學(xué)反應(yīng)本身具有高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體中,亦稱生物發(fā)光。 如：螢火蟲發(fā)光反應(yīng)的效率幾乎接近100%。 非生物體的化學(xué)發(fā)光效率一般不超過1%(2) 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度對(duì)下列化學(xué)發(fā)光反應(yīng)： A +B C* +D C + h化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度ICL(t)與反應(yīng)速度、化學(xué)發(fā)光效率有如下關(guān)系dtdctICLCL=j)(A為待測(cè)物質(zhì)，C為發(fā)光物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)物B的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量于待測(cè)物濃度時(shí)，發(fā)光反應(yīng)可視為一級(jí)反應(yīng)定量依據(jù)3. 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型(1

12、) 液相化學(xué)發(fā)光 研究和應(yīng)用的比較廣泛的有魯米諾（Luminol）光澤精、沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。魯米諾（3 氨基苯二甲酰環(huán)肼）可以測(cè)定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時(shí)量子效率為0.01-0.05魯米諾H2O2的化學(xué)反應(yīng)，可以被一些痕量的過渡金屬元素所催化，使發(fā)出的光大大增強(qiáng)，由此可測(cè)定Co（）,Cu（）, Ni（）, Cr（）等 50余種元素。魯米諾化學(xué)發(fā)光體系還可用于許多涉及到H2O2的產(chǎn)生或H2O2參加反應(yīng)的生化分析研究(2) 氣相化學(xué)發(fā)光可監(jiān)測(cè)空氣中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。NO + O3 NO2* + O2 NO

13、2* NO2 +h CO + O（原子氧） CO2* CO2* CO2 +h （600nm）（=300500nm）四、化學(xué)發(fā)光分析儀器（自學(xué)）氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)主要用于某些氣體的監(jiān)測(cè)，有專用的監(jiān)測(cè)儀。主要討論的是液相發(fā)光分析儀器按進(jìn)樣方式分立取樣式和流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光儀1. 分立取樣式是一種在靜態(tài)下測(cè)量發(fā)光信號(hào)的裝置，它利用移液管或注射器取一定量的試劑與試樣加入發(fā)光反應(yīng)池中混合，或把試劑與試樣加入貯液管中，開啟塞子使溶液流入反應(yīng)池中混合，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)立即發(fā)生，發(fā)光信號(hào)通過光電倍增管檢測(cè)，記錄下發(fā)光強(qiáng)度。根據(jù)發(fā)光峰面積的積分值或峰高進(jìn)行定量分析儀器具有設(shè)備簡單，造價(jià)低，體積小，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)：手工進(jìn)樣重復(fù)性差，測(cè)定精密度不高；難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，分析效率低2. 流動(dòng)注射式是動(dòng)態(tài)測(cè)量法，試液和試劑通過蠕動(dòng)泵傳送，并在流動(dòng)中進(jìn)樣混合，恰好流動(dòng)至盤管中反應(yīng)發(fā)光，流動(dòng)注射式發(fā)光分析的自動(dòng)化程度、精密度和準(zhǔn)確度都比較高，分析速度快，適用于批量試樣的測(cè)定熒 光 形 成 機(jī) 制單重態(tài)第二激發(fā)態(tài)第一激