微生物培訓(xùn)課件

1、微生物的基本知識(shí)回顧1.什么是微生物： 微生物（microorganism, microbe）是一類(lèi)個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，肉眼不可見(jiàn)或看不清楚的微小生物的統(tǒng)稱(chēng)。2. 微生物的特點(diǎn)： 個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單:細(xì)胞大小以微米和納米計(jì)量。 種類(lèi)繁多、分布廣泛：一克沃土中含菌量高達(dá)幾億甚至幾十億 生長(zhǎng)繁殖快，代謝能力強(qiáng)：大腸桿菌（Escherichia coli）在適宜的條件下，每20分鐘即繁殖一代，24小時(shí)即可繁殖72代。 遺傳穩(wěn)定性差，容易發(fā)生變異：自發(fā)突變頻率為10-6左右細(xì)菌的性質(zhì)1 菌體形態(tài):球，桿，螺旋革蘭氏染色1884年丹麥醫(yī)師Gram所發(fā)明 真細(xì)菌根據(jù)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)分為革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌

2、約40層網(wǎng)狀肽聚糖覆蓋在細(xì)胞表面，磷壁酸貫穿于肽聚糖層，形成厚約2080nm的細(xì)胞壁；磷壁酸貫穿其中；革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)內(nèi)壁層：靠近細(xì)胞膜，為12層網(wǎng)狀肽聚糖；外壁層：脂多糖（LPS）、磷脂層和脂蛋白層；革蘭氏陰性菌（G-）細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)脂多糖的結(jié)構(gòu)模型O-特異側(cè)鏈核心多糖類(lèi)脂A內(nèi)毒素?zé)嵩促|(zhì)細(xì)菌的特出結(jié)構(gòu)芽孢：在其生長(zhǎng)的一定階段在細(xì)胞內(nèi)形成圓形或橢圓形、圓柱形休眠體結(jié)構(gòu)稱(chēng)為芽孢。 功能：對(duì)惡劣環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗能力 ，有的芽孢，在一定條件下可保持活力數(shù)年甚至數(shù)十年之久，它本身具有一個(gè)細(xì)胞維持生命的所有功能。特點(diǎn)：耐高溫，抗熱性很強(qiáng)；抗化學(xué)藥物和酸類(lèi)；對(duì)溶菌酶有抗性 。細(xì)菌的特出物質(zhì)熱原質(zhì)

3、：特點(diǎn)：耐高溫；不具揮發(fā)性（重要疏水原理）；易被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿破壞；可濾過(guò)性；易吸附性；可稀釋性（水溶性）內(nèi)毒素：細(xì)胞壁外層，屬于細(xì)胞壁的組成部分（脂質(zhì)A）一般與細(xì)胞結(jié)合在一起不分泌到環(huán)境中，只有當(dāng)細(xì)菌溶解（裂解）后才釋放出來(lái)，故稱(chēng)內(nèi)毒素。少量?jī)?nèi)毒素0.001g入血即可引起發(fā)熱反應(yīng)。內(nèi)毒素被吞噬細(xì)胞吞飲后，細(xì)胞釋放出內(nèi)源性致熱原，經(jīng)血流到達(dá)下丘腦， 體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱。作用特點(diǎn)：沒(méi)有組織器官的選擇性 肌體發(fā)熱，腹瀉，出血性休克或其他組織損傷 不能經(jīng)甲醛脫毒2、菌落（colony）：?jiǎn)蝹€(gè)（或聚集在一起的一團(tuán)）微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見(jiàn)的、 有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)

4、的子細(xì)胞生長(zhǎng)群體。菌落單位為CFU ( Colony-Forming Units )。眾多菌落連成一片菌苔（lawn） 通常情況下，純培養(yǎng)能較好地被研究、利用和重復(fù)結(jié)果，因此，把特定的微生物從自然界混雜存在的狀態(tài)中分離、純化出來(lái)的純培養(yǎng)技術(shù)是微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。3 細(xì)菌純培養(yǎng)的群體生長(zhǎng)規(guī)律 把一定微生物接種到一定量的液體培養(yǎng)基中，在一定條件下進(jìn)行一次性培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定活菌數(shù)，以活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，就可以畫(huà)出一條有規(guī)律的曲線，這就是微生物的典型生長(zhǎng)曲線（繁殖曲線）.一般把典型生長(zhǎng)曲線劃分為適應(yīng)期、對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期（指數(shù)期）、穩(wěn)定期和衰亡期等四個(gè)時(shí)期。適應(yīng)期對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期穩(wěn)定期衰亡

5、期球菌（直徑）： 0.5 1 mm 桿菌（直徑長(zhǎng)度）： 0.2 1 mm 1 5 mm青霉的分生孢子頭根霉的孢子囊和孢囊孢子酵母菌是對(duì)一類(lèi)單細(xì)胞真菌的通稱(chēng)；有球形、卵形、橢圓形、圓柱形等；大小在5-20 m霉菌的細(xì)胞呈分枝或不分枝的絲狀，直徑約210 m細(xì)菌菌落 放線菌菌落 霉菌菌落濕干薄而小厚而大密而小厚而大細(xì)菌酵母放線菌霉菌酵母菌2019年版中國(guó)藥典微生物檢驗(yàn)主要增修訂內(nèi)容1.培養(yǎng)基的質(zhì)量控制2.菌種的質(zhì)量控制1.微生物檢驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)量控制技術(shù) 培養(yǎng)基是微生物試驗(yàn)的基礎(chǔ)，直接影響微生物試驗(yàn)結(jié)果。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗(yàn)是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。1.1培養(yǎng)基制備過(guò)程中的注意事

6、項(xiàng) 1.1.1培養(yǎng)基的水化 培養(yǎng)基水化時(shí)不得用銅鍋或鐵鍋,以防有離 子混入培養(yǎng)基中,影響微生物的生長(zhǎng)； 配制培養(yǎng)基最常用的溶劑是純化水 ,不能含 有任何可能抑制或影響微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)；培養(yǎng)基制備過(guò)程中的注意事項(xiàng) 1.1.2 培養(yǎng)基的溶解 在培養(yǎng)基分裝滅菌前,各成分應(yīng)溶解均勻, 使用電爐等設(shè)備煮沸培養(yǎng)基時(shí),應(yīng)用小火加熱,并邊加熱邊攪拌,避免培養(yǎng)基焦化或爆沸溢出。培養(yǎng)基制備過(guò)程中的注意事項(xiàng)1.1.3 培養(yǎng)基的滅菌 已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌 濕熱滅菌必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時(shí)間培養(yǎng)基制備過(guò)程中的注意事項(xiàng) 1.1.4 培養(yǎng)基的pH微生物必須在適宜的pH范圍內(nèi)才能正常生長(zhǎng)繁殖或體現(xiàn)其生物特性。調(diào)整培養(yǎng)

7、基的pH,應(yīng)用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl調(diào)整pH，一般滅菌前比最終pH高0.20.3。培養(yǎng)基制備過(guò)程中的注意事項(xiàng) 1.1.5 培養(yǎng)基的保溫 滅菌以后培養(yǎng)基應(yīng)該迅速冷卻至所需溫度,避免長(zhǎng)時(shí)間保存在滅菌鍋內(nèi),造成過(guò)度滅菌,影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分或選擇性效果。1.2 培養(yǎng)基質(zhì)量控制（2019版藥典） 培養(yǎng)基適用性檢查計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 控制菌檢查用培養(yǎng)基 1.2.1培養(yǎng)基適用性檢查的基礎(chǔ)一、對(duì)照培養(yǎng)基 系指按培養(yǎng)基處方特別制備、質(zhì)量?jī)?yōu)良的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)基適用性檢查。由中國(guó)藥品生物制品檢定所研制及分發(fā)。1.2.2 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查 大腸埃希菌金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌 白色念珠菌 黑

8、曲霉 白色念珠菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基Nutrient Agar (NA) 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 酵母浸出粉胨葡萄糖 瓊脂培養(yǎng)基（YPD） Yeast Peptone Dextrose Agar 50-100CFU 1.2.2 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查 結(jié)果判定 被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù) 對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù) 菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致 70% 菌落計(jì)數(shù)法證明培養(yǎng)基生長(zhǎng)能力USPUSP要求每批配制培養(yǎng)基作促生長(zhǎng)能力測(cè)試菌種選擇（變化大）：每個(gè)微生物單獨(dú)測(cè)試大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基：金葡，銅綠，枯草沙堡葡萄糖培養(yǎng)基：白念，黑曲方法：在培養(yǎng)中加入少量中（不超過(guò)100cfu）的微生物，按要求培養(yǎng)。對(duì)于

9、新鮮制備的菌液，生長(zhǎng)與前批已通過(guò)測(cè)試的培養(yǎng)基的前次測(cè)試結(jié)果一致。標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)接種物的計(jì)算量差別小于系數(shù)2（即 計(jì)數(shù)結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)接種物數(shù)量的50%-200%）。1.2.3 控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 促生長(zhǎng)能力 抑制能力 指示能力 檢查項(xiàng)目1.2.3 控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 促生長(zhǎng)能力檢查增菌培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查： 分別接種不大于100cfu 的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。 培養(yǎng)基基本要求1.2.3 控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 促生長(zhǎng)能力檢查固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查： 取試

10、驗(yàn)菌各0.1ml（含菌數(shù)50100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落大小形態(tài)特征應(yīng)一致。 培養(yǎng)基基本要求USP控制菌檢查用固體培養(yǎng)基能力檢查：使用表面涂布法，在培養(yǎng)中加入少量中（不超過(guò)100cfu）的微生物，在規(guī)定溫度下培養(yǎng)不超過(guò)規(guī)定的最短時(shí)間。清楚的觀察到與前批已通過(guò)測(cè)試的培養(yǎng)基的前次測(cè)試結(jié)果一致。注：有生長(zhǎng)就行，無(wú)數(shù)字上要求。1.2.3 控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 抑制能力檢查培養(yǎng)基抑制能力檢查： 接種不少于100cfu 的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長(zhǎng)時(shí)間下培養(yǎng)

11、，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。 針對(duì)選擇性培養(yǎng)基：膽鹽乳糖培養(yǎng)基、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、四硫磺酸亮綠培養(yǎng)基；（金黃色葡萄球菌）溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基，亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基、卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，念珠菌顯色培養(yǎng)基。（大腸埃希菌）1.2.3 控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 指示能力檢查固體培養(yǎng)基指示能力檢查： 取試驗(yàn)菌各0.1ml（含菌數(shù)不大于100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落形態(tài)、大小、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。 針對(duì)鑒別培養(yǎng)基1.2.3 控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 指示能力檢查

12、液體培養(yǎng)基指示能力檢查： 分別接種不大于100cfu 的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況、指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。 針對(duì)鑒別培養(yǎng)基典型特征大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB，曙紅亞甲藍(lán))上典型特征典型特征黑曲霉和白色念珠菌在玫瑰紅鈉瓊脂Rose Bengal Agar上典型特征典型特征金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉Mannitol Salt Agar瓊脂上典型特征典型特征沙門(mén)氏菌在SS瓊脂上沙門(mén)氏菌在BS瓊脂（亞硫酸鉍瓊脂）上培養(yǎng)基質(zhì)量控制（2019版藥典） 實(shí)驗(yàn)室配制的培養(yǎng)基的常規(guī)監(jiān)控項(xiàng)目p

13、H 適用性檢查試驗(yàn) 定期的穩(wěn)定性 檢查以確定有效期 2.菌種的質(zhì)量控制2.1 概念標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國(guó)內(nèi)或國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對(duì)接種培養(yǎng)物而言就稱(chēng)為一代。工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。 中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株 美國(guó)國(guó)家菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株 法國(guó)生物梅里埃公司提供的商業(yè)派生菌株（Bioball)低溫冷凍保藏的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株低溫蠟封保

14、藏的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株 我所制備的工作菌株中國(guó)藥典2019年版在方法的附錄中對(duì)菌種的規(guī)定同2019年版在新增的“藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則”中對(duì)菌種有了較為明確的規(guī)定允許使用標(biāo)準(zhǔn)菌株和商業(yè)派生菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)按保藏機(jī)構(gòu)提供的說(shuō)明進(jìn)行復(fù)活標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株，商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株菌種鑒定簡(jiǎn)單的講可以采用目前比較成熟的商品化鑒定技術(shù)，如API鑒定條基本程序?yàn)椋簩?duì)疑似菌種進(jìn)行純培養(yǎng)進(jìn)行染色鏡檢根據(jù)染色情況，并結(jié)合顯

15、色培養(yǎng)基等鑒定的初步信息，選擇合適的鑒定條根據(jù)操作說(shuō)明書(shū)，得到各生化反應(yīng)的鑒定結(jié)果，通過(guò)查閱檢索表，得到菌種鑒定的初步結(jié)果也可以采用半自動(dòng)或全自動(dòng)的微生物鑒定系統(tǒng)菌種的管理菌種的采購(gòu)菌種的復(fù)蘇菌種的傳代菌種的保藏菌種的使用和銷(xiāo)毀菌種的采購(gòu)每年年底，由實(shí)驗(yàn)室菌種管理人員提出下一年度菌種采購(gòu)的計(jì)劃，計(jì)劃購(gòu)置的菌種一般為藥典收載的標(biāo)準(zhǔn)菌種，填寫(xiě)請(qǐng)購(gòu)單，經(jīng)批準(zhǔn)后，由所采購(gòu)部門(mén)向指定的菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)置。所購(gòu)菌種均為冷凍干燥菌種。 采購(gòu)部門(mén)購(gòu)入菌種后，應(yīng)及時(shí)移交實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室菌種管理人員應(yīng)仔細(xì)核對(duì)菌種發(fā)放單和冷凍干燥菌種管標(biāo)簽等各項(xiàng)信息，確認(rèn)無(wú)誤后，置46暫存。 浙江省食品藥品檢驗(yàn)所菌種管理程序：菌種的復(fù)

16、蘇菌種在打開(kāi)前應(yīng)仔細(xì)核對(duì)標(biāo)簽上菌名、菌號(hào)。并注意一株菌種使用一套打開(kāi)用具，嚴(yán)防交叉污染。 菌種復(fù)蘇應(yīng)在生物安全柜內(nèi)操作。 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門(mén)菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同時(shí)接種液體培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基斜面，枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、藤黃微球菌和黑曲霉可接種瓊脂培養(yǎng)基斜面。 取瓊脂培養(yǎng)基斜面上的菌苔按要求對(duì)菌種的純度進(jìn)行鑒定。 浙江省食品藥品檢驗(yàn)所菌種管理程序：菌種的傳代應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行菌種的傳代 。取經(jīng)過(guò)純度鑒定的第1代菌種管（瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物）用于傳代制備第2代菌種。接種完畢，液體培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基斜面應(yīng)在規(guī)定的溫度下培養(yǎng)適宜的時(shí)間，芽孢桿菌宜培養(yǎng)56天，黑

17、曲霉宜培養(yǎng)57天，其他菌種一般培養(yǎng)1824小時(shí)。 浙江省食品藥品檢驗(yàn)所菌種管理程序：菌種的保藏保存的容器為無(wú)菌凍存管，保藏溫度為-70。 在冷凍前，應(yīng)貼上菌種標(biāo)簽。標(biāo)簽內(nèi)容應(yīng)包括菌名、菌號(hào)、傳代日期和有效期。所有凍存管應(yīng)立即置低溫冰箱中，迅速冷凍。該方法保藏菌種的有效期規(guī)定為6個(gè)月 。浙江省食品藥品檢驗(yàn)所菌種管理程序：菌種的使用和銷(xiāo)毀本所保藏的菌種主要供本所檢驗(yàn)工作使用并可對(duì)外提供給有關(guān)涉藥單位。本所提供的菌種為第二代低溫冷凍菌種。 本所檢驗(yàn)工作所需菌種，領(lǐng)用人應(yīng)向菌種管理人員領(lǐng)取，并在菌種領(lǐng)用記錄上記錄菌名、數(shù)量、領(lǐng)用人等信息。 外單位向我所購(gòu)買(mǎi)菌種，應(yīng)憑單位介紹信，并注明菌名、菌號(hào)、數(shù)量，

18、必要時(shí)可預(yù)約購(gòu)買(mǎi)。本所保藏的菌種，一般應(yīng)每年更換原種（每年打開(kāi)一套冷凍干燥菌種傳代制備第1代原種保存）。過(guò)期菌種應(yīng)及時(shí)銷(xiāo)毀，銷(xiāo)毀時(shí)應(yīng)經(jīng)121 20分鐘的生物滅活處理。 浙江省食品藥品檢驗(yàn)所菌種管理程序：通過(guò)制備工作菌種進(jìn)行菌種保藏的方法優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)便成本低比較容易掌握缺點(diǎn)保存期比較短反復(fù)傳代有引起變異的可能通過(guò)制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種進(jìn)行菌種保藏的方法優(yōu)點(diǎn)保存期較長(zhǎng)反復(fù)傳代導(dǎo)致菌種變異的風(fēng)險(xiǎn)較小缺點(diǎn)操作相對(duì)復(fù)雜成本較高操作流程相對(duì)較長(zhǎng)，受到污染的風(fēng)險(xiǎn)較高菌種保藏方法舉例申請(qǐng)?zhí)?專(zhuān)利號(hào)： 201910124325本發(fā)明提供了一種菌種保藏方法，采用半固體、低溫密封培養(yǎng)的方法：將菌種接種于無(wú)菌的半固體培養(yǎng)基中

19、，倒入無(wú)菌液體石蠟后豎直存放入的環(huán)境溫度中保存。所述菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色鏈珠菌。具體過(guò)程為：制備半固體培養(yǎng)基，分裝、滅菌，然后培養(yǎng)天，確定無(wú)菌后將菌種穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中，平行于培養(yǎng)基平面穿刺接種不少于點(diǎn)。倒入高的無(wú)菌液體石蠟，用封口膜密封，豎直存放入的電冰箱中保存。采用本發(fā)明可延長(zhǎng)菌種的保存時(shí)間，同時(shí)菌種的濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，為生產(chǎn)、試驗(yàn)節(jié)約了大量的成本，減少了菌種使用后廢棄物的處理和排放，減少了對(duì)環(huán)境的危害。 斜面保藏法:一般使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,生孢梭菌使用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基,在3035培養(yǎng)1824小時(shí).存活時(shí)間13個(gè)月.

20、 斜面保藏的菌種在冰箱中放置應(yīng)注意控制溫度,一般不宜低于4,也可以放置在室溫中,但應(yīng)控制溫度不超過(guò)25 .有關(guān)菌種的常見(jiàn)問(wèn)題陽(yáng)性菌的制備：領(lǐng)取工作菌種，從斜面上取一定量的培養(yǎng)物，稀釋至系列梯度的菌懸液，分別測(cè)各梯度菌懸液的菌落數(shù)。臨用時(shí)，取相應(yīng)稀釋菌懸液用于陽(yáng)性試驗(yàn)，同時(shí)用平皿法測(cè)定加入的菌液中的菌落數(shù)。是否可行？對(duì)照用菌液的制備應(yīng)取工作菌種，接種置適宜的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后獲得濃菌液，再進(jìn)行稀釋和確定菌濃度菌種傳代至第5代時(shí)，還能不能用該斜面菌種接種制備工作用菌液嚴(yán)格講，這種操作是不符合藥典規(guī)定的。藥典所指的傳代次數(shù)不超過(guò)5代，應(yīng)該是指用于實(shí)驗(yàn)的工作用菌液。因此，從保藏的角度看，制備成的斜

21、面保藏菌種只能到第4代。陽(yáng)性對(duì)照是否必須購(gòu)買(mǎi)菌種？有效期一般為多長(zhǎng)時(shí)間？對(duì)照用菌種應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)菌種，一般應(yīng)外購(gòu)有效期根據(jù)不同菌種，不同的保藏方法而異，如采用斜面移植保藏法，不能形成芽孢的細(xì)菌有效期一般為1個(gè)月，能形成芽孢的細(xì)菌有效期一般為3個(gè)月，真菌的有效期為3個(gè)月。如何對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯，傳代之前是否一定要做微生物學(xué)鑒定，確認(rèn)是否有變異。復(fù)壯的方法應(yīng)根據(jù)待復(fù)壯的菌種的保藏形式來(lái)確定。對(duì)凍干菌種，復(fù)壯操作較為繁瑣微生物傳代中的菌種確認(rèn)是必須的。以短小芽孢桿菌為例說(shuō)說(shuō)細(xì)菌鑒定通過(guò)顯微鑒別，為不呈鏈狀排列的桿菌，革蘭氏染色為陽(yáng)性。營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔光滑，薄，閃光，蔓延，不粘著，常常是淺黃色。 生化試驗(yàn)可

22、選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原 ，結(jié)果為明膠緩慢液化，淀粉水解陰性，硝酸鹽還原陰性。采用API鑒定條，結(jié)合染色鏡檢和接觸酶實(shí)驗(yàn)等結(jié)果微生物基本操作1、純培養(yǎng)技術(shù)2、微生物的計(jì)數(shù)3、微生物形態(tài)的觀察4、微生物生理生化特性測(cè)定干熱滅菌：160-180 2h高壓蒸汽滅菌(濕熱滅菌)：121 15-30min試管、瓶子、培養(yǎng)皿等常用的滅菌方法：常用的器具：一、純培養(yǎng)技術(shù) 1、微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌無(wú)菌環(huán)境的保證： 無(wú)菌室：萬(wàn)及潔凈區(qū) 凈化工作臺(tái)：萬(wàn)及潔凈區(qū)下的局部百級(jí) 酒精燈：外焰溫度最高，r=5cm的球形區(qū)為無(wú)菌區(qū)1）無(wú)菌環(huán)境微生物的環(huán)境器皿及培養(yǎng)基的無(wú)菌操作者的外界環(huán)境及操作過(guò)程的無(wú)菌（

23、環(huán)境及操作的無(wú)菌）2） 無(wú)菌操作火焰附近（酒精燈、煤氣燈）進(jìn)行2、接種3 分離純培養(yǎng) 平板劃線法（streak plate method） 2.劃線接種，分離純化Inoculating an agar plate to obtain single colonies二、細(xì)菌、霉菌、酵母菌的計(jì)數(shù)： 菌落總數(shù)的測(cè)定方法（活菌計(jì)數(shù)法），主要步驟為：將樣品制作成10倍梯度的稀釋液，選擇3個(gè)合適的稀釋度，吸取1mL于平皿，傾注培養(yǎng)基后，培養(yǎng)觀察，計(jì)數(shù)。對(duì)霉菌的計(jì)數(shù)，還可以采用顯微鏡直接鏡檢計(jì)數(shù)的方法使用郝氏計(jì)測(cè)玻片 。酵母菌的總數(shù)測(cè)定，可采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行顯微鏡直接鏡檢計(jì)數(shù)。酵母菌的死活鑒定可以通過(guò)0.1

24、%的美蘭染液染色2-3min完成，活菌不著色。USP對(duì)菌落計(jì)數(shù)方法分析菌落數(shù)的回收率可變范圍大：可能在+/-0.5log10單位左右，即真實(shí)值為A時(shí)，結(jié)果在100.5AA/100.5。（100.53.16） 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果一般不均勻，其對(duì)數(shù)值（log10）近似正態(tài)分布。 平皿技術(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）一般在15-35%（與平皿上CFU的數(shù)量有關(guān)）可以用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否有效，或是藥典替代方法精密度判定標(biāo)準(zhǔn)之一。應(yīng)用過(guò)程中的相關(guān)規(guī)定比較：差異0.5log10系數(shù)2 （50%-200%） 0.3log10回收率70%抗菌性測(cè)定中菌數(shù)不增加的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力測(cè)試合格標(biāo)準(zhǔn)抑菌性消除的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。產(chǎn)品

25、有抑菌性的標(biāo)志是相差超過(guò)。培養(yǎng)基替代時(shí)檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異標(biāo)準(zhǔn)微生物限度檢查時(shí)的可接受合格標(biāo)準(zhǔn)是建議標(biāo)準(zhǔn)的2倍（0.3log10）與CP一致菌落數(shù)的95%置信限菌落數(shù)值精度限制 %95%置信限5009455-54540010360-44032011284-356 20014172-2281002080-120802262-98502836-64303719-41204711-2916506-2410604-166831-11平皿數(shù)的95%置信限菌落平均值總誤差%95%置信限平皿數(shù)230010.5237-3631001570-1305020.729-713025.615-45平皿數(shù)33008.9247-35310013.274-1265017.932-683021.717-43平皿數(shù)53008.1251-34910010.579-1215014.136-643017.910-41固體培養(yǎng)基可計(jì)數(shù)范圍（通過(guò)牛奶中大腸埃希菌的計(jì)數(shù)“驗(yàn)證”）：CP規(guī)定細(xì)菌、酵母菌：30-300CFUUSP推薦：25-250CFU 不包括膜法對(duì)于黑曲霉建議：8-80CFU當(dāng)加菌量過(guò)大時(shí)，加菌量越大回收率越低當(dāng)加菌量極少時(shí)，加菌量越少誤差越大CP2019菌數(shù)報(bào)告原則1 要求每片濾膜上的菌落數(shù) 應(yīng)不超過(guò)100個(gè)。2 平皿法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)在30300之間、霉菌平均菌落