GBT19167-2003傳染性囊病診斷技術(shù)

1、GBT 19167-2003傳染性囊病診斷技術(shù)1 范 圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了傳染性囊病病毒的病原分離、抗原的檢測(cè)和檢側(cè)特異性抗體的瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、 病毒血清微量中和試驗(yàn)技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于傳染性囊病的診斷與檢疫。2 病毒的分離及其鑒定2.1 材料準(zhǔn) 備滅菌組織研磨器 、離心機(jī)、37溫箱、孵化器 、滅菌吸管、橡膠吸頭、滅菌小瓶、 滅菌6 # 針頭、滅菌注射器、石蠟。2.2 病料的采集和處理采集具有病變的新鮮法氏囊，用加有抗生素( 3000IU /ml青 霉素和3000g/ml鏈霉素)的胰蛋白酶磷酸緩沖液或生理鹽水制成20 %的組織勻漿液，在37作用30min-60min，l500r/min離心2

2、0min，收集上清液。經(jīng)菌檢培養(yǎng)為陰性后作為接種材料。2.3 雞胚接種2.3.1 接種將收集的上清液以每只0.2ml的量經(jīng)絨毛尿囊膜接種9日齡-11日齡無(wú)傳染性囊病母源抗體雞胚或SPF雞胚(無(wú)特定病原體雞胚)，接種后用石蠟封住接種孔。370C孵育，每天照蛋檢查，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚。2.3.2 雞胚剖檢結(jié)果判定2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)IBDV分離物接種后判定：標(biāo)準(zhǔn)的IBDV分離物接種雞胚后3 d- 5 d可致雞胚死亡。死亡雞胚充血，在羽毛囊、趾關(guān)節(jié)和大腦有血斑性出血。肝臟多可壞死，也可見(jiàn)色淡似熟肉樣。2.3 .2.2 IBDV變異株分離物接種后判定： IBDV變異株經(jīng)毛尿囊膜接種雞胚，-般不致死

3、雞胚，接種后5 d - 6 d 剖檢，可見(jiàn)雞胚大腦和腹部皮下水腫、發(fā)育遲緩、呈灰白色或奶油色，肝臟常有膽汁著色或壞死，脾臟通常腫大2倍-3 倍，但顏色無(wú)明顯變化。2.4 易感雛雞 接種試驗(yàn)2.4.1 接種取2.2 述及的病料上清液 0.5M L，經(jīng)點(diǎn)眼、口服感染5只1 4日齡 - 21日齡無(wú)I B DV母源抗體雞或S P F雞。同時(shí)設(shè)健康對(duì)照組。接種 3d 后將雞剖殺，檢查法氏囊及脾臟。2.4.2 剖檢接種結(jié)果2.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)I B D V接種結(jié)果： 接種后偶見(jiàn)雞死亡，剖檢可見(jiàn)接種雞法氏囊水腫、色 黃，有時(shí)可見(jiàn)出血。脾臟有時(shí)可見(jiàn)輕度腫大，表面有灰色點(diǎn)狀病變。健康雞則正常。2.4.2.2 I

4、BD V變異株接種結(jié)果 ： 接種后不出現(xiàn)死亡，3d 剖檢可見(jiàn)法氏囊萎縮 、 質(zhì)度硬，脾臟可見(jiàn)腫大1 倍-2 倍。健康雞則正常。2. 5 IBD 病毒的鑒定2.5.1 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散( AGID) 試驗(yàn)用 已 知的特異性 的雞傳染性囊病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，用分離株 的法 氏 囊勻漿制備待檢抗原，同時(shí)制備正常法氏 囊勻漿作對(duì)照抗原，按AGID 常規(guī)法滴加抗原和血清進(jìn)行擴(kuò)散，如在抗原孔和血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線(xiàn)者判分離物為陽(yáng)性。2.5.2 直接免疫熒光法2.5.2.1 材料及方法2.5.2. 1. 1 高免血清采用CJ801株毒制備的高免血清，經(jīng)AGID測(cè)定效價(jià)為 1：12 8以上，經(jīng)中和試驗(yàn)測(cè)定在2

5、12( 1：2084) 以上。2.5.2.1.2 直接熒光抗體的制備采用33% 飽和硫酸錢(qián)鹽析，沉淀免疫球蛋白，經(jīng)透析并通過(guò) SePhadexG50柱去銨離子，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定球蛋白濃度在20mg /ml-25 mg /ml左右，以異硫氫酸熒光素(FITC) 按 1%量采用熱標(biāo)記方法標(biāo)記，再經(jīng)透析和SePhadexG50柱層析，收集熒光抗體，保存于-20冰箱備用。2.5.2.1.3 標(biāo)本的制備及染色取分離株法氏囊制成冰凍切片或用其組織制成壓片。待自然干燥，以4 保存的冷丙酮溶液固定10min，0.1 mol/l，PH7.2 磷酸鹽緩沖液沖洗兩次,蒸餾水沖洗一次，風(fēng)干后用1：8 1：1 6

6、熒光稀釋液為工作液，滴加在切片上置濕盒中，在37溫箱中靜置3 0 min，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液、蒸餾水沖洗，風(fēng)干，滴加甘油 緩沖液封固、鏡檢。2.5.2.2 鏡檢及判定標(biāo)準(zhǔn)用熒光顯微鏡檢查。 采用法氏囊冰凍切片為熒光診斷標(biāo)本，法氏囊病毒侵害法氏囊后主要表現(xiàn)在淋巴小葉的髓質(zhì)部。首先在淋巴濾胞胞漿中發(fā)出黃綠色熒光顆粒，胞核位于中間 為暗色不發(fā)光。 感染初期常見(jiàn)到 “光輪” 樣結(jié)構(gòu)的淋巴濾胞，感染最嚴(yán)重時(shí)由于大量病毒在泡漿中復(fù)制發(fā)出強(qiáng)熒光的亮斑。皮質(zhì)不發(fā)光。具有上述淋巴圖像稱(chēng)為特異性熒光，判為陽(yáng)性。根據(jù)熒光強(qiáng)弱，熒光細(xì)胞的數(shù)量及熒光結(jié)構(gòu)的清晰度可判為 “+ +、 +、 +、 + ”。 淋巴小葉結(jié)構(gòu)完整而

7、清晰，又不發(fā) 熒光者判為陰性。瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散3.1 材料準(zhǔn)備3.1.1 雞傳染性囊病診斷抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。3.1.2 瓊脂板制備方法見(jiàn)附錄 A A3.1.3 被檢血清樣品：被檢雞血清應(yīng)新鮮，分離后56滅活30 min，采血后分離的血清可以當(dāng)天使用，也可置-20保存?zhèn)溆谩?.2 操作程序3.2.1 打孔反應(yīng)孔按畫(huà)好的七孔圖案打孔，將畫(huà)好的七孔圖案放在有瓊脂板的平皿下，按照?qǐng)D案在固定位置用不銹鋼小管打孔，中心孔徑 3 mm，外周孔徑3mm，外周孔與中間孔間距3mm，打孔時(shí)切下的瓊脂可以吸也可以用針頭挑出。打好后，在酒精燈上適當(dāng)加熱平皿底部，使瓊脂與玻璃平皿貼緊，避免由于打孔時(shí)導(dǎo)致的瓊脂與平皿脫

8、離。3.2.2 加樣3.2.2.1 抗體的定性與定量測(cè) 定若是做定性試驗(yàn)，不需要稀釋血清，只將血清樣品直接加入瓊脂板孔 中；但若要定量測(cè)定血清沉淀抗體的滴度，可以在24孔或9 6孔 V形培養(yǎng)板上稀釋血清，各孔預(yù)先加入5 0 l的 PBS，然后倍比稀釋血清，最后更換吸頭由高稀釋度開(kāi)始加樣。3.2.2.2 抗原及血清在孔內(nèi)的添加中央 孔7 加抗原，1，4 孔加 陽(yáng) 性血清，2，3，5，6 孔加被檢血清，各孔加到孔滿(mǎn)為止。 如果定量檢測(cè)血清的沉淀抗體，采用中央 孔7 加抗原，周?chē)?1 -6 孔依次加入各不同稀釋度 的 血清樣品。在瓊脂板上另做二孔，打法及間距同前，分別加入陽(yáng)性血清和抗原，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照

9、。 加蓋將平皿置于濕盒或容器中，在37條件下反應(yīng)，逐日觀察，72 h 終判。3.3 結(jié)果判定3.3.1 定性檢測(cè)被檢血清孔與抗原孔之間形成致密沉淀線(xiàn)者，或者陽(yáng)性血清的沉淀線(xiàn)向毗鄰的被檢血清孔內(nèi)側(cè)彎者，此被檢孔血清判為陽(yáng)性。被檢血清孔與抗原孔之間不形成沉淀線(xiàn)，此被檢血清判為陰性。3.3.2 定量檢測(cè)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔產(chǎn)生致密沉淀線(xiàn)后，被檢血清能與抗原產(chǎn)生沉淀線(xiàn)的最高 稀釋度即為該被檢血清的沉淀抗體效價(jià)。4 病毒血清微量中和試驗(yàn)4.1 材 料4.1.1 器 材：40孔或96孔有蓋的聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板洗凈后烘干，采用紫外線(xiàn)距離30 cm照 射蓋內(nèi)側(cè)、培養(yǎng)板孔1 h 或y射線(xiàn)輻射消毒。 多道

10、、單道固定或可調(diào)式微量取樣器，規(guī)格為5ul- 50l ，50l，- 200l，并配以相應(yīng)規(guī)格經(jīng)高壓消毒的塑料吸頭，2cm 寬的滌綸透明膠帶。4.1.2 細(xì) 胞：雞胚成纖維細(xì)胞。4.1.3 血 清：IBDV陽(yáng)性血清和陰性血清均由SPF雞制備。 被檢血清為采自受檢雞的不腐敗、不溶血、不加抗凝劑和防腐劑的血清，在試驗(yàn)前56水浴滅活30min。42 操作程序本試驗(yàn)采用兩板法，即“板1” 作血清-病毒感作，“板2” 用作正式試驗(yàn)。4.2.1 取75l Earles液 加到“板 1”各孔，第10列加7 5 l Earles液作細(xì)胞對(duì)照。4.2.2 取 2 5 l 被檢血清分別加到A，B，C 行的第 1 孔

11、，分別作 1，4 倍系列稀釋至第8孔。4.2.3 取2 5 l 陽(yáng)性血清加到D行的第1孔，取25l陰性血清加到D行的第5孔，分別按上法稀釋( 即 1 -4 孔為陽(yáng)性對(duì)照，5 - 8 孔為陰性對(duì)照)。4.2.4 除第10 列外，取2 5l 含200TCID50/25l的CJ 801病毒，然后置微量振蕩器上振蕩混勻，37感作45min-60min。4.2.5 用 取樣器以200l 含100萬(wàn)/ml 雞胚成纖維細(xì)胞加到“板2”各 孔內(nèi)。4.2.6 用取樣器分別吸取病毒血清混合物轉(zhuǎn)移到“板2”相應(yīng)各孔內(nèi)，每份血清接種 4 孔，每孔25l。4.2.7 用2cm寬的滌綸透明膠帶封蓋，振蕩混勻，置37溫箱培養(yǎng)72h- 96h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況。4.3 結(jié)果判定1：8 以 下為陰性；1：32 以上判為陽(yáng)性；1：1 6 判為可疑，隔周后采血測(cè)定抗體價(jià)仍為 1：1 6