β-葡萄糖苷酶研究進(jìn)展

1、B-葡萄糖苷酶研究進(jìn)展1.1問題的提出及意義隨著能源危機(jī)、食物短缺、環(huán)境污染等問題正日益嚴(yán)重地困擾著整個世界，尋找開發(fā)新能源、節(jié)省糧食、減少環(huán)境污染顯得越來越重要。纖維素類物質(zhì)是自然界中存在的最廉價(jià)、最豐富的一類可再生資源。全世界每年的植物體生成量高達(dá)100-500億噸干物質(zhì)，其中一半以上為纖維素和半纖維素1。纖維素在一定條件下可以被水解成單糖，單糖可再通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種有用的產(chǎn)品，如飼料、燃料、化工原料、食品、藥品等，并且可取代目前的淀粉原料發(fā)酵生產(chǎn)的各種產(chǎn)品，以及由化工燃料合成生產(chǎn)的部分有機(jī)產(chǎn)品2,3。開發(fā)高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類可再生資源的微生物技術(shù)，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物等發(fā)酵生產(chǎn)人類急需的

2、燃料、飼料及化工產(chǎn)品，即化工原料的“綠色化”，具有極其重要的意義和光明的發(fā)展前景。纖維素酶是一類能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱，它是一類復(fù)雜的復(fù)合物，稱之為纖維素酶系,根據(jù)其中各酶功能的差異，可將其分為三大類：(1)內(nèi)切p-1,4-葡聚糖酶(endo-p-1,4-glucanase,EC3.2.1.4，也稱Cx酶)，作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)或羧甲基纖維素，隨機(jī)水解B-1,4-糖昔鍵，將長鏈纖維分子截?cái)?，產(chǎn)生大量小分子纖維素；外切B-1，4-葡聚糖酶(exo-B-1,4-glucanase，EC3.2.1.91，也稱C1酶)，作用于纖維素線狀分子末端，水解B-1,4-糖苷鍵，每次從纖維

3、素鏈的非還原端切下一個纖維二糖分子，可以水解微晶纖維素；(3)B-葡萄糖昔酶(cellobiohydrolase,EC2.1.21，簡稱CBH)，水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖4。3種酶協(xié)同作用，完成對纖維素的降解。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)卩-葡萄糖昔酶。后來研究發(fā)現(xiàn)，B-葡萄糖昔酶存在于植物、昆蟲7、酵母、曲霉及細(xì)菌體內(nèi)。它參與生物體的糖代謝，對維持生物體正常生理功能起著重要作用。B-葡萄糖昔酶是纖維素酶系的重要成員，在纖維素水解時，纖維二糖的積累會抑制內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶的活性，而纖維素酶組分中該酶含量最少、活力普遍較低，因此成為纖維素酶解的瓶

4、頸。增加B-葡萄糖昔酶活性，會有效提高纖維素酶解效率。目前，國內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)正致力于B-葡萄糖昔酶的分子生物學(xué)研究，以期望更好改善纖維素酶的催化效率，利用纖維素資源。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀目前卜葡萄糖苷酶的研究主要集中在高效產(chǎn)生菌分離、酶作用機(jī)理、酶生理生化特性及卩-葡萄糖苷酶基因克隆上。121卩-葡萄糖苷酶的分類與底物特異性根據(jù)氨基酸序列分類，將P-葡萄糖苷酶劃分在糖苷水解酶家族1和3中。家族1中的卩-葡萄糖苷酶來自于細(xì)菌、植物和哺乳動物；家族3中的酶來自于真菌、細(xì)菌和植物。家族1中的酶除有葡萄糖苷酶活性外，還有很強(qiáng)的半乳糖苷酶活性9。幾乎所有的卜葡萄糖苷酶對底物的糖基部分結(jié)構(gòu)的專一性較差。

5、能裂解C0糖苷鍵、CS鍵、CN鍵、CF鍵等；有些對糖基部分的C和C構(gòu)形也不專一，能同時水解卜葡萄糖苷酶鍵和卜半乳糖苷鍵，有些甚至C位的專一性也不高，能水解木糖10。但在所有底物中，卩-葡萄糖苷酶對纖維二糖的活性最強(qiáng)。在卩-葡萄糖苷酶C端的高度保守序列可能與結(jié)合糖苷底物有關(guān)，在這區(qū)段的微小差異決定了卩-葡萄糖苷酶的不同底物特異性11。1.2.2卩-葡萄糖苷酶的理化性質(zhì)12,13,14一般來說，不同來源的卜葡萄糖苷酶的相對分子量由于其結(jié)構(gòu)和組成不同而差異很大，最適pH相差不多，最適溫度因其來源不同而相差很大，表一15列舉了一些不同來源的卩-葡萄糖苷酶的理化性質(zhì)。表一不同來源的卩-葡萄糖苷酶的理化性

6、質(zhì)生物喀稱核相對分子質(zhì)屋CkDa)亞基數(shù)pl最適pH最遙a度oo占細(xì)Pri,ococcusfiiiiosus12304丄厶aO102-105酵母菌ceivisiae2025曲孫菌曲Hustibingensis41311424665135119406554117aO605413i6aO60.鷹嘴SlCicerarieiinuin213.525.9-7.130-35321172145-48aO2050卩-葡萄糖苷酶的相對分子量一般在40250kDa之間。已報(bào)導(dǎo)的卩-葡萄糖苷酶的pl大多數(shù)都在酸性范圍，并且變化不大，一般在3.55.5之間，但最適pH可以超過7.0,而且酸堿耐受性強(qiáng)。P-葡萄糖苷酶的

7、最適溫度在40110C之間都有分布；一般來說，來自植物的卩-葡萄糖苷酶最適溫度在40C左右，而來自古細(xì)菌的卩-葡萄糖苷酶其熱穩(wěn)定性和最適溫度要高于普通微生物來源的卩-葡萄糖苷酶16。對于工業(yè)應(yīng)用來說，酶的熱穩(wěn)定性越高越有利。因此，從嗜熱細(xì)菌中分離卜葡萄糖苷酶引起了人們的興趣。123卩-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制隨著越來越多的卜葡萄糖苷酶基因已被克隆和序列分析，為其基因結(jié)構(gòu)與功能方面的研究提供了重要依據(jù)。同其他纖維素酶一樣，卩-葡萄糖苷酶也具有纖維素酶的一般結(jié)構(gòu)，即含有催化結(jié)構(gòu)域(CD)、結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)、連接肽(Linkerpeptide)。催化結(jié)構(gòu)域含有進(jìn)行催化作用的活性中心，體現(xiàn)了催化

8、活性及對特定水溶性底物的特異性；CBD通常位于酶蛋白的C-末端或N-末端，其主要功能是將酶分子連接到纖維素上；連接橋主要是保持CD和CBD之間的距離，也可能有助于不同酶分子間形成較為穩(wěn)定的聚集體17，18。國外通過X射線晶體衍生法分析卜葡萄糖苷酶三維空間結(jié)構(gòu)。糖苷水解酶家族1的典型結(jié)構(gòu)具有8個(a/g)結(jié)構(gòu)圍成的桶狀結(jié)構(gòu)，也被稱為4/7超家族。糖苷水解酶家族3有A區(qū)和B區(qū)兩個域構(gòu)成，B區(qū)包括SDW序列，內(nèi)有活性為點(diǎn)Asp(D)殘基。在分子水平上，水解酶家族3的編碼基因有5個典型的區(qū)域構(gòu)成，N端區(qū)、N端催化區(qū)、非同源區(qū)、C端未知功能區(qū)、C端殘基19。多數(shù)卜葡萄糖苷酶中起催化作用的是兩個谷氨基酸殘

9、基，其中，靠近N端的谷氨酸起酸/堿作用，另一谷氨基酸起親核試劑的作用20。但Grabnitz等人0研究發(fā)現(xiàn)來自Clostridiumthermocel的m-葡萄糖苷酶的活性部分在N端的130個氨基酸區(qū)域，該區(qū)的個性特征是氨基酸序列中心基團(tuán)His-Asn-Glu-Pro，存在于該區(qū)域的具有催化作用的殘基是相隔3555個氨基酸的His和Glu,其中質(zhì)子化態(tài)的完全保持殘基Hisl21作為質(zhì)子供體與Glu166協(xié)同穩(wěn)定氧碳正離子。高度保守的C-端附近的殘基也許參與了酶與糖苷基底物的鍵合，其中在該區(qū)的一些微小差異與不同卩-葡萄糖苷酶的底物特異性有關(guān)。Shoseyov,O等22通過用2-脫氧-2-氟基-卩

10、-D-糖基氟化物對該酶活性部位親核體鑒定發(fā)現(xiàn)：bgl1氨基酸序列排布中Asp261完全保守，此完全保守性與催化親核體的關(guān)鍵作用完全一致。除了可形成共價(jià)糖基化酶中間體和穩(wěn)定氧化卡賓體的類離子過渡態(tài)外，親核體還可調(diào)節(jié)酸/堿催化堿基的電離狀態(tài)，并且過渡態(tài)中還在糖狀物的2-羥基位置上形成很強(qiáng)的氫鍵。經(jīng)研究證明卩-葡萄糖苷酶在催化糖苷鍵的裂解反應(yīng)時遵循兩步雙取代反應(yīng)機(jī)制23,24，其中有兩個關(guān)鍵的活性部位羧基參與。其反應(yīng)方程式如下：EEEP第一步是酶與底物鍵合形成米氏復(fù)合物ES（反應(yīng)速率常數(shù)分別為K和K-）。第二步是酶一底物中間體（E-S）的形成（反應(yīng)速率常數(shù)為K2）:酶的一個羧基（親核體）攻擊底物的端

11、基異構(gòu)體的中心部位，而另一個羧基（酸、堿催化劑）則使糖苷中的氧質(zhì)子化，因此可輔助苷元的脫離，從而形成共價(jià)的3-糖基酶中間體（E-S）。在此過程中，BGL的活性中心可根據(jù)不同類型的底物而相應(yīng)地發(fā)生一定程度的結(jié)構(gòu)變化，從而使BGL可以和多種糖類底物結(jié)合，這一步?jīng)Q定了BGL具有底物專一性。第三步是中間體的水解，由水按堿催化機(jī)制對端基異構(gòu)體進(jìn)攻，形成3-糖基產(chǎn)物并使酶恢復(fù)其初始的質(zhì)子化態(tài)。BGL在整個反應(yīng)過程中其構(gòu)型保持不變。1.2.33-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達(dá)目前，國內(nèi)外對3-葡萄糖苷酶分子方面的研究主要是:用基因工程技術(shù)構(gòu)建含3-葡萄糖苷酶基因的克隆菌株；表達(dá)具有較高酶活力的3-葡萄糖苷酶；通

12、過分子演化和設(shè)計(jì)來提高酶的功能性。3-葡萄糖苷酶基因重組表達(dá)是當(dāng)前3-葡萄糖苷酶研究熱點(diǎn)之一，已有很多不同來源的3-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌或酵母菌中得到高效表達(dá)，見表二25。表二部分已表達(dá)克隆的卩-葡萄糖苷酶基因表達(dá)輕怵表達(dá)宿.上盅達(dá)晦曆世pET2siE.ioil陽話30帰fl%BtlwEEHJsIntinE.Carlsati12S.5tDpHCG3MainRtiyn創(chuàng)Michel1S3.2kDpPlCZaA艸曲FfcWti閃Xf購總JitmgHongHlxanmTammJcaLlKkDP303OS,百林唸visionMerjaE,PcotlilHeksnlKeviaiiLB口CffiWfd

13、kjpe/rtcu/口129.5kPpGCAS.rerevfjEtzf晾覘番rzo%ChieKohctiiAkioToh-CpUCIKEg障酶浴50略A.WiMun?J.GallagherK加y呻cfxy阿JragilisVJJfikDKF2IS.AJaunRaynalClaiickGcrhaudCj胡皿mW伽t63.t*kDpNZ1065KK22?JEzQ氐聘枯10%-15伽D_frLLoveR.Rslieir百洋nr血丁魁總砒S92kDpABGSEc&H占丁曲曲活WarreTiWELkarebukpDouginCLFCilbompPICAjra.MPithiapaMom氐陶活的Kw曲R.Y

14、ophidaL123.1卜葡萄糖苷酶基因的克隆到目前為止，有上百個微生物、植物和動物中的卜葡萄糖苷酶基因已得到克隆并被測序，其中以微生物和植物為主。PranitaRoy等26將Pichiaetchellsii的卩-葡萄糖苷酶的基因進(jìn)行克隆、測序并將其在大腸桿菌中表達(dá)，分析得到開放閱讀框1515bp，預(yù)測編碼蛋白質(zhì)量54kDa，將表達(dá)后的酶液進(jìn)行SDS，結(jié)果證明蛋白質(zhì)量為52.1kDa。李遠(yuǎn)華等27將與萜烯類香氣前體及與抗病蟲害有密切關(guān)系的茶樹卜葡萄糖苷酶cDNA通過pET-32a表達(dá)載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到EscherichiacOlL21zztrxB(DE3)中表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生了63kD的融

15、合蛋白，并主要在細(xì)胞質(zhì)中以可溶性蛋白形式存在。融合蛋白具有正常的生物學(xué)活性，能催化葡萄糖苷鍵的水解反應(yīng)。早期卜葡萄糖苷酶基因的克隆是通過構(gòu)建總DNA文庫或鳥槍法進(jìn)行活性篩選的方式獲得的。隨著PCR技術(shù)的應(yīng)用，可根據(jù)種屬相似性進(jìn)行擴(kuò)增克隆得到卜葡萄糖苷酶基因。隨著基因組學(xué)的發(fā)展,越來越多的微生物基因組全序列被測定。通過序列篩查定位分析出可能的卜葡萄糖苷酶基因，是獲得卩-葡萄糖苷酶新基因的有效手段。近年來，熱穩(wěn)定性的卩-葡萄糖苷酶成為研究熱點(diǎn)，JiongHong和HisanoriTama28于2007年從一株嗜熱子囊菌中分離出耐熱的卜葡萄糖苷酶，該酶在70C高溫下仍有活性，序列分析表明該酶屬于水解

16、酶家族3成員。123.2卩-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)卜葡萄糖苷酶在纖維素降解中起關(guān)鍵作用，但其含量少、活力低，成為纖維素酶解的瓶頸。因此，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建工程菌，分泌表達(dá)高活性P-葡萄糖苷酶對纖維素有效降解具有重要意義。為此，已經(jīng)有很多種卩-葡萄糖苷酶基因被構(gòu)建到不同的工程菌中。許多研究表明，卩-葡萄糖苷酶基因可以在大腸桿菌中表達(dá)。大腸桿菌基因結(jié)構(gòu)簡單，易于進(jìn)行基因操作，而且它生長迅速，周期短，營養(yǎng)需求簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)，但是，缺少真核生物的翻譯后加工過程。趙云，劉偉豐等29將多粘芽抱桿菌卜葡萄糖苷酶基因重組到E.colBL21中，在培養(yǎng)液中表達(dá)的卩-葡萄糖苷酶活性達(dá)到24.7IU/mL。M

17、i-RiHong，Yeong-SuKim等30在2009年將嗜熱菌CaldicellulosiruptorsaccharolyticusDSM8903的卩-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，純化后，比酶活達(dá)到到13U/mg，最適pH為5.5、最適溫度為70C。隨著真核表達(dá)體系的建立與完善，根據(jù)近年來研究表明，卩-葡萄糖苷酶基因在酵母中表達(dá)比在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)量和酶活性普遍要高些。最近10年，許多細(xì)菌和真菌的卩-葡萄糖苷酶基因已經(jīng)在酵母菌中成功地克隆和表達(dá)。酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢：既便于培養(yǎng)，便于基因操作，成本低，繁殖快，又可對真核基因產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后加工，得到正確折疊、有活

18、性的蛋白。2003年，KawaiR和YoshidaM等人31從Phanerochaetechrysosporium中克隆到的卩-葡萄糖苷酶基因，采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，其重組表達(dá)的酶活甚至達(dá)到原始菌株幾十倍。PatrickMurraya等32將來源于耐熱真菌Talaromycesemersonii的屬于耐熱家族3中的卩-葡萄糖苷酶基因在綠色木霉中進(jìn)行表達(dá)，最適溫度達(dá)71.5C。夏永振等陽，利用酵母的表面表達(dá)系統(tǒng)將來自Trichodermareesei的卩-葡萄糖苷酶固定在了釀酒酵母的表面上，得到了有活性的表面酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酵母表面表達(dá)酶有活性，該酶的最佳誘導(dǎo)時間為24h，最適溫度是70

19、C，而酶活的最適pH是5.5,這為纖維素酶的同步發(fā)酵工藝提供了幫助。1.2.4應(yīng)用前景1.2.4.1作為風(fēng)味劑卜葡萄糖苷酶在食物中可以與鼠李糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等風(fēng)味酶協(xié)同作用于風(fēng)味前體物一卜糖苷，促進(jìn)揮發(fā)性糖苷配基的釋放，起到增香作用34。如李平等35研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉卜葡萄糖苷酶對蘋果汁、檸檬汁、茶汁的增香效果良好。目前卜葡萄糖苷酶廣泛應(yīng)用于茶葉36、果汁和果酒37中增香，其應(yīng)用逐漸得到開發(fā)。1.2.4.2作為脫苦劑陶寧平等38研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖苷酶可以把青梅中的苦杏仁苷分解為苯甲醛及氫氰酸和兩分子葡萄糖，而使青梅苦味大大減少。雖然分解出的氫氰酸有時可使人食后中毒，但氫氰酸可在加熱過程中蒸發(fā)掉，而

20、且據(jù)報(bào)道，一定劑量的苯甲醛和氫氰酸混合物具有防癌效果。因此經(jīng)常作為柑橘、橄欖中的去苦劑，除去苦味。用于生產(chǎn)低聚龍膽糖39目前，工業(yè)上對P-葡萄糖苷酶的主要應(yīng)用是生產(chǎn)低聚龍膽糖。低聚龍膽糖比麥芽糖漿具有更高的吸水性和較低的粘度，可預(yù)防食品中的淀粉老化和保持食品中的水分，具有增味作用和顯著的保健功能。目前我國低聚龍膽糖的產(chǎn)量仍很小。用于生產(chǎn)大豆異黃酮大豆異黃酮可調(diào)控動物機(jī)體養(yǎng)分代謝，改善飼料利用率，可改善動物產(chǎn)品的品質(zhì)，并有抗氧化作用，可以提高動物免疫功能和生產(chǎn)機(jī)能。但是大豆異黃酮主要以結(jié)合型的糖苷(glucosides)形式存在，而研究發(fā)現(xiàn)：結(jié)合型的糖苷不具有最佳的生理活性狀態(tài)。卩-葡萄糖苷酶能

21、使大豆異黃酮苷等生物苷類物質(zhì)脫去糖基，變成分子量較小的高生物活性苷元，進(jìn)而提高生物利用率。據(jù)報(bào)道，豆奶中添加卩-葡萄糖苷酶或接種產(chǎn)卩-葡萄糖苷酶的微生物，都能夠?qū)⒍鼓碳岸鼓谭壑猩镉行暂^低的異黃酮糖苷化合物高效轉(zhuǎn)化為高活性的異黃酮苷40。制造生物酒精將卩-葡萄糖苷酶與纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶基因轉(zhuǎn)入酵母菌中進(jìn)行同步糖化發(fā)酵制造生物酒精。同步糖化發(fā)酵過程是將生物質(zhì)水解產(chǎn)生還原糖和還原糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇組合到一起，在同一步驟進(jìn)行，這樣一方面可以使還原出來的糖被酵母利用生成乙醇，解除了產(chǎn)物對酶的抑制作用；另一方面降低了發(fā)酵罐中的糖含量，從而降低了染菌幾率41。2005年，全球生物酒精的需求量已達(dá)到38.27millionkL,但目前使