流式基本知識

1、一步一步學流式第一篇：流式細胞術的歷史概要說來，流式細胞術主要包括了樣品的液流技術、細胞的分選和計數技術，以及數據的采集和分析技術等FCM目前 發(fā)展的水平凝聚了半個世紀以來人們在這方面的心血和成果。1934年，Moldavanl首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數，并用光 電記錄裝置計測的設想，在此之前，人們還習慣于測量靜止的細胞，因為要使單個細胞順次流過狹窄管道容易造成較大 的細胞和細胞團塊的淤阻。1953年Crosland -Taylor根據雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律的研究認識到：管中 軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流體

2、動力聚集作用。于是設計了一個流動室，使待分析 的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍著鞘液；細胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細胞 術中的液流技術基礎。1956年，Coulter在多年研究的基礎上利用Coulter效應生產了 Coulter計數器。其基本原理是：使細胞通過一個小 孔，只在細胞與懸浮的介質之間存在著導電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號，測量電脈 沖的強度和個數則可獲得有關細胞大小和數目方面的信息。1967年Holm等設計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細胞， 再由光電檢測設備計數的裝置。1973年Steinkamp設計了一種利用激光激發(fā)雙色

3、熒光色素標記的細胞，既能分析計 數，又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計數技術的主要歷程?，F(xiàn)代的FCM數據采集和分析技術是從組織化學發(fā)源的，其開拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在組織化學 的基礎上提出了兩個新設想：（1）細胞的組分是可以用光光度學來定量測定的，即分光光度術可以定量地獲得有關細 胞組織化學的重要信息。（2）細胞的不同組分可以同時進行多參數測量，從而可以對細胞進行分類。換句話說，對同 一細胞可以同時獲得有關不同組分的多方面信息，用作鑒別細胞的依據。流式細胞術在細胞化學中的應用的先驅者是Van Dilla和美國的Los Alamos小組。他們在

4、1967年研制出流液束、照 明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細胞計的基礎上，首次用熒光Feulgen反應對DNA染色顯示出DNA的活 性與熒光之間存在著線性關系，并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細胞周期的各個時相。Gohde和Dittrich接著把 這項技術推向實用，他們用流式細胞術測定細胞周期借以研究細胞藥代動力學問題。FCM用于免疫組織化學中的關鍵是 對細胞進行免疫熒光染色，其它和在細胞化學的應用并沒有多大差異。（下圖為一 DNA直方圖）DNA直方圖第二篇：流式細胞儀的工作原理將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，

5、鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在 鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射 下，產生散射光和激發(fā)熒光。前向角散射，即FSC與細胞直徑平分正相關，所以我們平時上機的時候，有時用FSC做閾值，排除碎片及其它顆粒， 避免干擾。側向角散射，即SSC是指與激光束正交90度方向的散射信號，它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更敏感，可以提供細 胞內結構及顆粒性質的信息！因此，僅根據FSC/SSC，我們就可以分開全血樣本中的淋巴細胞，單核細

6、胞和中性粒細 胞！這兩種信號同時被前向光電二極管和90方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上 反映了細胞體積的大?。粺晒庑盘柕慕邮芊较蚺c激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個 不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再 通過模/數轉換器，將連續(xù)的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理， 將分析結果顯示在計算機屏幕上，液可以打印出來，還可以數據文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。(下圖為光學系統(tǒng))檢測數據的顯

7、示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為 細胞數目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數，這視其模數轉換器的分辨率而定。對于雙 參數或多參數數據，既可以單獨顯示每個參數的直方圖(histogram)，也可以選擇二維的散點圖(dot plot)、等高線圖 (contour)或三維立體視圖(pseudo 3D散點圖及三維立體圖細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電后振動，使噴出的 液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶

8、有幾千伏 特的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細 胞的分離。也就是高中學過的帶電粒子在電場中運動的原理！補充細節(jié)1 :關于熒光素熒光信號主要包括兩部分：自發(fā)熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射后所發(fā)出的熒光；特征熒光， 即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪 聲信號，在多數情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對于結合水平不高的熒光抗體 來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發(fā)熒光的分子(例核黃素、細胞色

9、素等)的含量越 高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒 光越強。減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：盡量選用較亮的熒光染料；選用適宜的激光和濾片光學系 統(tǒng)；采用電子補償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻予以補償。當應用流式細胞術對細胞表面或內部抗原進行檢測時，除必要的抗體外，應用各種熒光素也是必不可少的，它包括單標 記抗體熒光索、雙標記抗體熒光素、三標記抗體熒光素等。熒光素發(fā)射熒光基本原理是：熒光素受到一定波長（激發(fā)波 長）的激光激發(fā)后，其原子核外的電子由于吸收了激光的能量，由原本運動處于基態(tài)軌道躍遷到激發(fā)態(tài)軌道上運動，然 后當電

10、子由激發(fā)態(tài)重新回到基礎態(tài)時，釋放出能量并發(fā)射出一定波長（發(fā)射波長）的熒光。不同熒光素用不同的激發(fā)光波 長的激發(fā)光來激發(fā)，所以要選擇正確的激光器。例如，F(xiàn)ITC和FE等的微發(fā)光波長均為488nm，所以可用產生可見光 的氬離子激光器，而APC和PC5等的激發(fā)波長在紅光范圍，需使用發(fā)射630nm波長紅光的氦一氖激光器。此外，各 種熒光素的發(fā)射波長也十分重要，可以據此確定其檢測所需光電倍增管性質。如FITC，被激光激發(fā)后發(fā)射綠光，檢測 時要使用第一光電倍增管（即PMTl）； PE則發(fā)射橙包光，需用第二光電倍增管（即PMT2）； PC5和PcrCP等發(fā)射的是深 紅色光，這時需選擇第二甚至第四光電倍增管（

11、即PMT3或PMT4）等。一定要注意激發(fā)波長和發(fā)射波長的區(qū)別！ 常用熒光素流式細胞儀測定常用的熒光染料有多種,他們分子結構不同,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異，選擇熒光染料時必須依據流式 細胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長（如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488nm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長 633nm）。488nm激光光源常用的熒光染料有FITC （異硫氤酸熒光素）、PE （藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP（葉綠素蛋白）、ECD（藻紅蛋白-得克薩斯紅）等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是:激發(fā)光波長（nm） 發(fā)射光峰值（nm）FITC 488 525 （綠）PE 488

12、 575 （橙紅）PI 488 630 （橙紅）ECD 488 610 （紅）CY5 488 675 （深紅）PreCP 488 675 （深紅）FITC 和 PIPI和EB都具有嵌入到雙鏈DNA和RNA的堿基對中并有與堿基對結合的特異性。為了獲得特異的DNA分布，染色前 必須用RNA酶處理細胞，排除雙鏈RNA的干擾。PI和EB不能進入完整的細胞膜，因此又可以用于檢測死細肥。PI 和EB各種理化性質相似，但PI比EB的發(fā)射光光譜峰向長波方向移動，因而在作DNA和蛋白質雙參數測量時，PI的 紅色熒光和FITC的綠色熒光更易于區(qū)分和測量。另外，Pl比EB測得的DNA分布的變異系數（CV值）低，所以

13、PI得 到更廣泛的應用。FITC為一種小分子熒光素，其效率（即熒光強度）取決于溶液的pH值，因此在使用FITC時應注意溶 液的酸堿度。一些流式常用名字的概念和意義：（舊文版）Amplifier 放大器 Electronic component of a flow cytometer that increases the signal by an adjustable factor.Aneuploid 異倍體 Having an abnormal number of chromosomes. Aneuploid cells may also have an abnormal DNA conten

14、t.Average The mean value, which is the total amount divided by the number of contributors.Channel 常說的熒光道數 The measured value of a parameter, representing the signal intensity of an event after amplification. To appear on a plot, data for an event must fall into one of either 256 channels (0-255) or

15、one of 1024 channels (0-1023) depending on the resolution of the plot.Compensation (熒光)補償 An electronic calculation that removes signal overlap which the optical system cannot remove. Fluorescence compensation works for specific pairs of fluorescent parameters; for example, FL1 and FL2.Cursor For FA

16、CScans: a highlight appearing in a data field that indicates you can modify this field. On a dot plot, a crosshair for drawing a polygon gate. On other flow cytometers: a line separating regions on single parameter histograms that are treated statistically separate. See marker.%CV CV 值！表示其集中分散趨勢。Per

17、cent coefficient of variation is a measure of peak distribution. The percent coefficient of variation is the standard deviation of the peak divided by the mean channel number of the peak, times 100.Diploid 二倍體 Having the normal number of chromosome pairs for non-reproductive, mammalian cells. The am

18、ount of DNA in diploid cells defines the normal DNA content for the species.DNA Index The ratio of GO/G1 peak channel in a DNA histogram of the experimental sample to the GO/G1 peak channel of the reference sample, when normal human diploid cells or nuclei are the reference. This is a measure of DNA

19、 aneuploidy, or abnormal DNA content.Dot Plot A two parameter data graph used for acquisition and analysis. Each dot on the display represents one event that the flow cytometer analyzed.Doublet 分選中常用的概念。Two particles stuck together, which a flow cytometer records as one larger event. Particles may a

20、lso occur in triplets and higher associations.Event A unit of data representing one particle or cell. An event has a relative intensity value and channel number for each parameter.Filter An optical device used to attenuate particular wavelengths or frequencies while passing others.FL1, Green Fluores

21、cence signal received by the photomultiplier tube (PMT), FL1. The range of the signal detected is dependent on the filters associated with the PMT. For FACScans and FACSCaliburs, FL1 measures light in the green range of the spectrum (515 to 545 nm).FL2, Orange-Red Fluorescence signal received by the

22、 photomultiplier tube, FL2. For FACScans and FACSCaliburs, FL2 measures orange-red light (564-606 nm).FL3, Red Fluorescence signal received by the photomultiplier tube, FL3. For FACScans, FL3 measures red light (above 650 nm). For FACSCaliburs, FL3 measures red light (above 670 nm).FL4, Red-Orange F

23、luorescence signal received by the photomultiplier tube, FL4. For FACSCaliburs, FL4 measures red-orange light (653-669 nm).Fluorescence A property of molecules to absorb light at one wavelength and emit light at a longer wavelength. Flow cytometers detect Fluorescence emission at a 90 degree angle t

24、o the exciting light beam.Forward Scatter (FSC)前向角 A parameter measuring light scattered less than 10 degrees as a cell passes through the laser beam. The FSC measurement is related to cell size.G0 Phase of cell cycle designating cells that are quiescent and have not yet entered the growth cycle. No

25、rmal cells in this phase have exactly one set of chromosome pairs.G1 Phase of cells cycle in which cells are committed to division. These cells have the same number of chromosomes and the same amount of DNA as GO phase cells. They are about to enter S phase where they synthesize DNA.G2 Phase of cell

26、s cycle in which proliferating cells have duplicated their DNA and formed two sets of chromosome pairs, in preparation for division. G2 follows the S phase and precedes the M (mitosis) phase.Gain 增益 An adjustment that modifies amplifier responses. Increasing the gain increases the electronic pulse (

27、and the relative fluorescence intensity value and the channel value) in response to a light signal.Gate 翻譯過來后還是覺得稱之為gate”好！ A boundary that defines a subset or sub-population of events. Gates are set by drawing boundaries around the subsets on data plots (dot plots or histograms). Use gates either f

28、or data acquisition or analysis. Inclusive gates select only the events that fall within (and on) the boundary. Exclusive gates select only the events that fall outside of the boundary.Live gate與上面的gate”不同，是作為記錄的條件的gate，不在gate之內的數據不被存入電腦！ Gate through which any data from the flow cytometer/computer

29、parallel interface must pass before acquisition. Any data outside the gate does not enter the computer.Haploid 單倍體 Having one set of single chromosomes. Reproductive cells, like eggs and sperm, are haploid.Histogram A data plot of a single parameter. This displays either the relative fluorescence in

30、tensity value or the channel number on the x axis and the number of events on the y axis.Linear scale 線，性 The scale on which the output is directly proportional to the input. When the control is set at Linear, the voltage measured is directly proportional to the channel into which the event falls.Lo

31、garithmic scale 對數 The scale on which the values increase logarithmically. This scale is used when the instrument is set to LOG. There are four decades across the 1024 channels on FACScan (256 channels per decade). The scale ranges from 1 to 10,000. For FACScan, the number of decades is fixed.M Phas

32、e of the cell cycle, mitosis, during which a cell divides into two. This precedes GO/G1 and follows G2. M phase and G2 cells contain the same amount of DNA and the same number of chromosomes. In normal cells, this is the tetraploid number (4N) of chromosomes.Marker就是第五篇中的一張圖上面的M1，M2等。作為統(tǒng)計時的分界區(qū)域限制。A

33、line separating regions on single parameter histograms that are treated statistically separate. See cursor.Parameter A measurement of light intensity, either scattered or emitted fluorescence, from a particle as it passes through a laser beam. For all five parameters (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3) the he

34、ight of the electronic pulse that is generated is used. In addition, for cell cycle analysis CellQuest software can measure either FL2 area and FL2 width (for staining with propidium iodide) or FL3 area and FL3 width (for staining with 7-amino-actinomycin D).Photodiode 光電二極管，將光信號轉化為電信號。A semiconduct

35、or device used to detect light and generate an electrical current. Typically used in forward scatter (FSC) detection.Photomultiplier 光電倍增管 A photodetector, with adjustable voltage, that translates optical tube (PMT) signals into electrical current. PMT detectors are used for SSC and fluorescence par

36、ameters. Increasing the PMT voltage, increases the output signal for a given amount of light.Ploidy 倍性 The number of chromosomes present in the cell. The amount of DNA in a cell gives an indication of the ploidy, but is not directly proportional. See Haploid, Diploid, and Aneuploid.Pulse 不是脈搏，是脈沖！ T

37、he electronic signal generated by a particle （cell or nucleus） in the flow cytometer.Rate The number of events per second processed by the computer.Reference Sample就是作為一個內標的樣本，通過它可以對一些物質進行定量檢測！（這就是為什么在一些帖子里 面，我們總是說流式是個定性，半定量工具，要做到半定量或定量，需要內標。不是所有的數據都可以定量的，慢慢會 理解的，我正在理解中。）A sample of known DNA conten

38、t mixed with an experimental sample to provide an internal standard.S Phase of the cell cycle, DNA synthesis, in which the cell duplicates its DNA.Scale The maximum number of events displayed for a channel in a histogram. A low scale number magnifies the data.Side Scatter （SSC） Also called 90o scatt

39、er or right angle scatter. Light scattered at a 90 degree angle as a cell passes through the laser beam. This measurement is related to the internal granularity or complexity of a particle.Singlet A single particle （cell or nucleus）, which a flow cytometer records as one event.Threshold 閾值，在流式中，這是個很

40、重要的概念！ The lowest channel number for a selected parameter for which an event may be recorded. The flow cytometer sends to the computer only events above the threshold level.第三篇：安全問題既然要學習流式，操作流式，在了解了流式的歷史和基本原理后，我們認為最終要的就是安全問題，因為在操作流程中 間還是有許多環(huán)節(jié)存在各種安全隱患，需要我們謹慎操作的，現(xiàn)不完全列出！1、電安全問題：偏振板，激光供電等都是高電壓，要特別小心。儀器內

41、部應該只有廠家人員及相關工作人員才能操作， 試驗人員不要冒險！2、激光安全問題：流式的激光有相應的cover來保護，不要打開，否則危險！某些儀器操作時必須關上相應的門！不 要直視激光！（不用說的?。┦覂炔灰蟹垂馕矬w。（女生不要在那里化妝喲，雖然中獎幾率極小?。┎灰噲D用什 么阻斷激光束！3、生物學安全問題：如病毒，細菌，致癌物質等，倒廢液桶時要注意！不要用手或身體其它部位直接接觸有可能有危 險的東西，提高警惕！4、財產安全問題：流式是貴重儀器，液流系統(tǒng)，激光系統(tǒng)，電腦系統(tǒng)都價值昂貴！大家在操作時千萬要嚴肅，嘻笑不 適合在流式旁！第四篇：流式細胞術的應用流式細胞術址檢測細胞各種成分的重要細胞生

42、物學工具。它不但可以定量檢測細胞膜、細胞質和細胞核中的各種細胞成 分，而日可以研究細胞的各種功能狀態(tài)（細胞增殖，細胞凋亡、細胞分化、酶活性、細胞膜通透性、氧化還原狀態(tài)、吞 噬性等）。目前還叫以定量檢測血清中的各種可溶性生物分子成分。細胞膜：脂質雙層分子結構中具有多種蛋白質分子一一細胞表面抗原，表面糖類、表面受體，細胞因子，膜電位.膜結 合鈣離子，細胞表面電荷等，這對確定細胞的性質及其功能是十分重要的。細胞質：各種細胞成分，包拈蛋白質、RNA、各種細胞器中的特殊成分、各種抗原、基因編碼蛋白，細胞質內鈣離子、 pH值等。細胞核：DNA，RNA，蛋白質.各種基因表達蛋白、抗原蛋白等。(摘自實用流式細

43、胞術彩色圖譜)收集的其它關于流式應用的網頁： HYPERLINK /content/20050417/10956.htm /content/20050417/10956.htm HYPERLINK /Article_Show.asp7ArticleIDn2230 /Article_Show.asp7ArticleIDn2230本頁內容本來也用網頁形式帖出的，但是由于網頁顯示問題，只附上鏈接！而且本鏈接的內容較為詳細，值得看看！第五篇：學看流式圖參照【圖片倉庫】流式圖片專區(qū)精華協(xié)助理解。 HYPERLINK /bbs/post/view?bid=66&id /bbs/post/view?bid=

44、66&id = 1774204&tpg = 1&ppg = 1&sty=1&age=0#1774204幾個介紹流式圖片的網頁： HYPERLINK /veddesign/catalogues.html /veddesign/catalogues.html HYPERLINK http:/www.cytometry.cz/en/services/data-analysis.html http:/www.cytometry.cz/en/services/data-analysis.html HYPERLINK /fcc/data.htm /fcc/data.htm HYPERLINK /v3/FA

45、Q/differentgraphs.html /v3/FAQ/differentgraphs.html我們在第二章中就已經說到流式數據可以用一維直方圖、二維散點圖、等高線圖、密度圖等來表示，下面逐一附圖說明。1、單參數直方圖：每一個細胞單參數的測量數據可以整理成統(tǒng)計分布，以直方圖的方式來顯示。在圖中，橫坐標表示熒光信號或散射光信 號相對強度的值，其單位是道數，可以是線形(line)或者對數(log)?？v坐標一般是細胞數(count) !直方圖當然 不僅僅是用來表示DNA含量的。這里有一個在本版常見問題：如何做M1陰性界限？！實際上，這個M1的劃分完全 是根據陰性對照來的！如果您要問：怎么這么巧，正好在101 這兒劃分？呵呵，原來偶也這么傻傻地問過！因為我 們可以人為地將電壓，放大調到相應的大小以達到陰性的右邊界在某一個值上，這樣后期做sample時好看！當然您也 可以調到10的2次方，3次方。只要機器電壓允許，陽性組還有地方放得下。2、散點圖：散點圖常被用來分析多參數數據，如上面CD分子的表