凝膠滲透色譜GPC-分析測試中心課件

1、GPC基礎知識島津國際貿(mào)易(上海)有限公司分析中心1SEC定義SEC全稱Size Exclusion Chromatography(體積排阻色譜，或者尺寸排阻色譜）SEC定義：是利用多孔凝膠固定相的獨特特性，而產(chǎn)生的一種主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來分離的液相色譜方法。2SEC分類凝膠滲透色譜 (GPC)主要用于聚合物領域以有機溶劑為流動相(氯仿，THF，DMF)常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯共聚物凝膠過濾色譜 (GFC)主要用于生命科學領域以水溶液為流動相常用固定相填料：親水性有機凝膠(葡聚糖，瓊脂糖，聚丙烯酰胺等)3GPC用途高聚物的分子量及其分布是高聚物最基本的參數(shù)之一。高聚物的許多性質(zhì)

2、是與分子量有關(guān)的。例如沖擊強度、模量、拉伸強度、耐熱、耐腐蝕性都與高聚物的分子量和分子量分布有關(guān)。4GPC分離原理固定相是多孔填料，小分子樣品可以進入孔徑內(nèi)部樣品與固定相之間無作用力遷移時間不同孔穴填充物顆粒 大 中小樣品5MW與RT之間的關(guān)系 Log (MW)排阻極限滲透極限GPC柱6GPC術(shù)語排阻極限排阻極限是指不能進入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。隨固定相不同，排阻極限范圍約在 400至601

3、06之間。滲透極限能夠完全進入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最大分子的分子量。在選擇固定相時，應使欲分離樣品粒子的相對分子質(zhì)量落在固定相的滲透極限和排阻極限之間。 7平均分子量計算公式數(shù)均分子量 重均分子量 Z均分子量Z+1均分子量Hi： 峰高 Mi：分子量Mw =S Mi HiS Hi Mn =S HiS (Hi / Mi)Mz =Mi 2HiS Mi Hi Mz+1 =Mi 3HiS Mi 2Hi 8平均分子量含義數(shù)均分子量 (Mn)拉力、抗沖擊性重均分子量 (Mw)脆度Z 均分子量 (Mz)彈性、硬度分布寬度指數(shù)D(分散度)= Mw/Mn對于多分散試樣 Mn Mw Mz9高聚物多分散性表征樣品間分子

4、量分布寬度的比較，最直接的方法是將實驗所得到的分子量分布曲線作對比。分子量分布曲線有兩種形式：用重量分數(shù)W對分子量作圖的曲線叫做微分分布曲線；用累積重量分布對分子量作圖的曲線叫做積分分布曲線。還有一種更一般化且最常用的方法就是重均數(shù)均比，即：Mw/Mn。10測定聚合物分子量的方法直接方法滲透壓方法 (for Mn)光散射方法 (for Mw)粘度方法 (for Mv)超速離心方法 (for Mz)間接方法GPC (for Mn, Mw and Mz)用標準品進樣得到分子量校正曲線，間接算出聚合物樣品的相對分子量。如和標準品結(jié)構(gòu)不同，還需進行相應的計算才能得到聚合物樣品自身的分子質(zhì)量。11為什么

5、要用GPC方法相對分子量分布(多分散性指數(shù))對聚合物的性質(zhì)有重要影響。在相對分子質(zhì)量分布（多分散性指數(shù)）成為人們關(guān)注的熱點后，經(jīng)典方法卻不能同時測定聚合物的相對分子質(zhì)量分布。凝膠滲透色譜(GPC)的應用改善了測試條件，并提供了可以同時測定聚合物的相對分子質(zhì)量及其分布的方法，使其成為測定高分子相對分子質(zhì)量及其分布最常用、快速和有效的技術(shù)。 12GPC系統(tǒng)配置泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器THF, 氯仿, DMF 示差檢測器需要GPC軟件才可計算MW13配置實例No.產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱型號數(shù)量1228-45011-38系統(tǒng)控制器CBM-20Alite12228-45000-38輸液單元LC-20AD13

6、228-45018-32在線脫氣機DGU-20A314228-45041-91容器盤-15228-45006-38自動進樣器SIL-20A16228-46606-96自動進樣器用GPC對應組件-17228-45009-38柱溫箱CTO-20A18228-45095-38示差折光檢測器RID-10A19228-20810-91色譜柱GPC-80M110228-20812-91保護柱GPC-800P111223-05671-92LC工作站LCsolution Single112223-05655-92GPC軟件LCsolution GPC114GPC系統(tǒng)與常規(guī)HPLC系統(tǒng)區(qū)別檢測器GPC系統(tǒng)標配示

7、差折光檢測器常規(guī)HPLC有多種檢測器可選梯度GPC系統(tǒng)是等度系統(tǒng)，并且用并聯(lián)泵常規(guī)HPLC可以是等度或者梯度管路GPC系統(tǒng)采用全不銹鋼流路常規(guī)HPLC用PEEK或者不銹鋼流路自動進樣器針密封GPC系統(tǒng)采用Vespel針密封，適用THF、氯仿、DMF等常規(guī)HPLC用PEEK針密封15LCsolution GPC軟件該 GPC 可選軟件可在 LCsolution 上無縫地運行。作為 LCsolution 的一部分，此軟件擴展了方法、數(shù)據(jù)和報告格式文件的功能，并可使用 LCsolution 的所有功能特性。特點：1) 可以操作 GPC 與 LC 工作站2) 對方法和數(shù)據(jù)文件的統(tǒng)一管理3) 兼容多個系

8、統(tǒng)和多個檢測器（包括 PDA 檢測器）4) 同時輸出色譜圖報告和 GPC 計算結(jié)果5) 可以根據(jù)控制樣品進行保留時間的校準16GPC色譜柱系列Shim-pack GPC-80X for THFShim-pack GPC-80XC for 氯仿Shim-pack GPC-80XD for DMF排阻極限 (聚苯乙烯)1.5x103(GPC-801), 5x103(GPC-802), 2x104(GPC-8025), 7x104(GPC-803), 4x105(GPC-804), 4x106(GPC-805), 4x107(GPC-806)，4x107 (mixed gel，GPC-80M), 2

9、x108(GPC-807)17GPC色譜柱類型普通凝膠柱按照不同的排阻極限分成很多種型號(如GPC-80X)每種排阻極限的柱子使用同一種凝膠顆粒在一段范圍內(nèi)校正曲線成線性混合凝膠柱一種型號(如GPC-80M)使用混合凝膠顆粒在較寬范圍內(nèi)校正曲線都成線性，可消除不同柱子串聯(lián)時可能產(chǎn)生非線性校正曲線導致結(jié)果偏差的問題18GPC色譜柱類型混合凝膠柱GPC-80M19GPC色譜柱選擇按照樣品所溶解的溶劑來選擇柱子所屬系列THF、氯仿、DMF必須選擇合適的溶劑來溶解聚合物按照樣品分子量范圍來選擇柱子型號樣品分子量應該處在排阻極限和滲透極限范圍內(nèi)，并且最好是處在校正曲線線性范圍內(nèi)20標樣聚苯乙烯(PS，溶

10、于各種有機溶劑)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚環(huán)氧乙烷 (PEO，也叫聚氧化乙烯，溶于水)聚乙二醇(PEG，溶于水)(PEO與PEG的碳鏈骨架相同，但是其合成原料和封端不同，由于原料的性質(zhì)，使其產(chǎn)物的分子量和結(jié)構(gòu)都有一定的區(qū)別。PEO常是指一端為甲基封端，一端為羥基封端的聚環(huán)氧乙烷，而PEG一般是兩端都是羥基封端的聚乙二醇。) 21校正曲線逐一注入聚合物標樣以確定分子量與保留時間的關(guān)系IDTimeMW114.797853000215.559380000316.239186000416.888100000517.47648000618.03223700718.49512200819.005580

11、0常用線性擬合或者三次方擬合22GPC校正方法窄分布標樣校正法選用與被測樣品同類型的單分散性(d1.1)標樣，先用其他方法精確測定其平均相對分子質(zhì)量，然后與被測樣品在同樣的條件下進行GPC分析。 普適校正法此法的優(yōu)點是只要用一種高聚物（一般用窄分布聚苯乙烯）作標準曲線就可以測定其他類型的聚合物，但先決條件是2種高聚物的K和值必須己知。漸進試差法(寬分布標樣校正法)這種方法不需要窄分布樣品，其標樣可為13個不同相對分子質(zhì)量的寬分布標樣（平均相對分子質(zhì)量精確測量，Mw和Mn為已知），采用數(shù)學處理方法得到漸進試差法的校正曲線。23窄分布標樣校正法要有5個以上的不同分子量的單分散標樣來制作校正曲線樣品

12、最好與標樣是相同的結(jié)構(gòu)。如果樣品與標樣結(jié)構(gòu)完全一樣，則結(jié)果不需再修正如果樣品結(jié)構(gòu)與標樣結(jié)構(gòu)不一樣，并且樣品是單鏈結(jié)構(gòu)，則可以用QF因子比來修正結(jié)果如果樣品結(jié)構(gòu)與標樣結(jié)構(gòu)不一樣，并且樣品帶有支鏈，則無法使用窄分布標樣校正法24窄分布標樣校正法-分子量轉(zhuǎn)換QF因子比(RQF)QF定義：單位鏈長分子量僅適用于單鏈聚合物25聚苯乙烯的QFQF=104 / 2.50 = 41.5 -( CH-CH2 )n- C6H5 單位鏈長的MW = 104一個單位長度為 2.50 A.C-C 鍵長度約為 1.54 A.C-C-C 鍵角度約為 109度.一個單位長度計算如下： 1.54 x sin(109 / 2)

13、x 2 =2.5026聚苯乙烯的QFCCCC1091.54 A1.54 x sin (109/2)1.54 x sin (109/2) x 22.50 ACC27聚異丁烯的QFQF = 56 / 2.50 = 22.3 CH3 -(C-CH2)n- CH3 單位鏈長的MW = 56一個單位長度為 2.50 A.28RQF聚異丁烯與聚苯乙烯的QF之比為 RQF. RQF = 22.3 / 41.5 = 0.537 M 聚異丁烯= M GPC x 0.53729RQF的制約因素RQF 僅適用于單鏈聚合物如果聚合物有支鏈結(jié)構(gòu), MW的計算就有誤30普適校正法用一種高聚物標樣做校正曲線，常用聚苯乙烯樣

14、品結(jié)構(gòu)可以與標樣不一樣，并且可以有支鏈樣品及標樣在流動相溶劑中的K和值必須己知可以用粘度法來測定K和的值31普適校正法公式GPC反映的是淋洗體積與高聚物流體力學體積間的關(guān)系。根據(jù)Einstein粘度關(guān)系： 為特性粘度；v表示聚合物鏈等效的流體力學體積；N為阿佛加德羅常數(shù)；M為聚合物分子量。根據(jù)上式可用M表示流體力學體積。 32普適校正法公式當樣品與標樣有相同的淋洗體積時，下式成立：式中下標1為標樣參數(shù)，2為樣品參數(shù)。將Mark-Houwink方程(=KM)代入，即得到：從而得出： 33漸進試差法(寬分布標樣校正法)不需要窄分布標樣，只需要寬分布標樣標樣和樣品為同一種物質(zhì)標樣數(shù)量最少可以只有1個

15、標樣的分子量Mw和Mn必須已知標樣校正曲線呈線性34漸進試差法(寬分布標樣校正法)在一定條件下，有：(1)將標樣色譜峰分成若干個切片，則：(2)根據(jù)定義，有： (3) (4)將公式(2)代入公式(3)和(4)，則：(5) (6)標樣的Mw和Mn已知，將Hi,Vi代入，軟件自動算出A,B值。35GPC分析大致步驟根據(jù)樣品的特點選擇合適的GPC柱子和標樣，并且確定采用的GPC校正方法配制標樣和樣品，用LCsolution進樣得到色譜圖用LCsolution GPC生成校正曲線并計算樣品平均分子量，制作報告36GPC系統(tǒng)安裝注意事項安裝色譜柱柱子串聯(lián)時排阻極限大的接前面管路選擇使用全不銹鋼流路，不能

16、有PEEK材質(zhì)的部件存在溶劑更換水和氯仿不互溶最高壓力設置柱子串聯(lián)時將最高壓力設為所有柱子允許承受的最高壓力之和柱子使用注意事項一定要嚴格按照說明書使用色譜柱(部分柱子不能用甲醇沖洗)氯仿柱子要用氯仿沖洗柱子，THF柱子要用THF沖洗，氺相柱子一般用60水40乙腈保存37安裝色譜柱通常而言，分析結(jié)果與色譜柱組安裝的順序無關(guān)。盡管如此，為了提高分離度和延長色譜柱壽命，應按孔徑由大到小順序安裝色譜柱，即排阻極限大的接前面，排阻極限小的接后面。原因在于，孔徑越大，越粗糙，越能承受外來物質(zhì)的積累污染。而且，樣品中高分子量的物質(zhì)對樣品的粘度影響最大。如果大分子先被分離，粘度下降更快，對色譜柱的壓力降低。

17、38GPC分析注意事項如何配制標樣和樣品系統(tǒng)平衡柱子沖洗及保存校正曲線有效時間親水性聚合物分析39GPC標樣配制由于凝膠色譜中濃度檢測通常使用示差折光檢測器，其靈敏度不太高，所以試樣的濃度不能配置得太稀。但另一方面色譜柱的負荷量是有限的，濃度太大易發(fā)生“超載”現(xiàn)象。一般情況下，進樣濃度按分子質(zhì)量大小的不同在0.050.5%（質(zhì)量分數(shù)）范圍內(nèi)配置。分子質(zhì)量越大，溶液濃度越低。標樣配制應該嚴格按照標樣說明書進行。通常室溫靜置12小時以上，然后輕輕混勻。絕對不能超聲或者劇烈振蕩來加速溶解。溶液進樣前應先經(jīng)過過濾，以防止固體顆粒進入色譜柱內(nèi)，引起柱內(nèi)堵塞，損壞色譜柱。40GPC標樣配制一種分子量的標樣

18、進樣一次得到標樣色譜圖，這樣的結(jié)果是最理想的。通常，為節(jié)約時間，可以將分子量相差較大(峰不會重合)的兩種標樣配制在一個瓶中，然后進樣，可以節(jié)約一半的標樣分析時間。如8個不同分子量的標樣可以按右表編成4組分別進樣。組分子量1853000480002380000237003186000122004100000580041進樣濃度范圍及體積分子量范圍 樣品濃度低于5,000 1.0%5,00025,000 0.5%25,000200,000 0.25%200,0002,000,000 0.1%高于2,000,000 0.05%進樣體積50-100uL之間(濃度在0.05%-0.5%之間)42GPC系

19、統(tǒng)平衡安裝色譜柱之前，用兩通管連接管路，用流動相替換系統(tǒng)后換上GPC柱子。(注意溶劑互溶情況)RID平衡操作分析開始前，用流動相沖洗檢測器流路。流動相流速1ml/min，切換到R Flow，使流動相通過檢測池的樣品池和參比池，沖洗20min左右。然后切換R Flow 流路數(shù)次，將氣泡趕出檢測池。關(guān)閉R Flow，等待基線平穩(wěn)。當Balance 值高于50，進行Balance 調(diào)整。色譜柱平衡等溶劑峰出峰后在經(jīng)過約一次分析時間后基線才能走平。43GPC柱子沖洗及保存如果在24h內(nèi)再次使用色譜柱，無需特別的處理步驟。如果長時間不使用，應用保存溶劑沖洗色譜柱，拆下色譜柱，上緊堵頭，放入色譜柱盒子中保

20、存。嚴格按照柱子說明書中允許條件下使用。避免振動和機械撞擊。專柱專用，經(jīng)常改變樣品和溶劑會加速色譜柱惡化，降低分離度。44GPC校準曲線有效時間每周用標樣評價標準曲線，如果偏差大于0.10M（10%），重做標準曲線。更換色譜柱后，需重做標準曲線。45親水性聚合物分析注意事項使用親水性 GPC 柱Shodex OHpak SB-800 HQ seriesTOSOH TSK-GEL PW series 使用葡聚糖，聚乙二醇和聚氧化乙烯作為標準物使用鹽如(50mmol/L) NaCl, NaNO3, LiCl 等以消除離子間引力使用有機溶劑如甲醇、乙腈等以消除疏水性作用力46GPC分析例色譜柱：Sh

21、odex GPC KF-804,802,801三根串聯(lián)保護柱：Shodex GPC KF-G流動相：THF流 速：1.0ml/min柱 溫：50進樣量：50ul檢測器：示差折光檢測器RID-10A標準品：PS(聚苯乙烯）(8個不同分子量標樣)47標準品及樣品配制方法 分子量校準曲線所用的標準品為PS，有8種不同分子量的標品。將它們按下表分為4組，每組含2種標品，各稱約4mg左右，然后用20ml流動相溶解，配成4個標樣。稱量5mg樣品，加入4ml流動相溶解過夜。PS Standard分子量稱量值(mg)STD_15600004.2206504.1STD_21560004.0116004.0STD_3660004.270004.1STD_4285004.029504.248標樣圖譜四種顏色分別表示四個標樣的圖譜49分子量校準曲線50樣品分析結(jié)果MnMwMzMz1Mw/MnMz/Mw43679731781013771251211.675341.3853651PS1和PS2為同一操作人員測定同一樣品的兩次測定結(jié)果PS3為另一實驗室