生物工程生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)英語(yǔ)翻譯

1、第八章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)獲得的產(chǎn)品及生產(chǎn)過(guò)程8.1歷史盡管很多研究者很早以前曾經(jīng)研究在試管中培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞的性質(zhì)，最早將這類(lèi)細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的是J.F.Eeders，他在1949年發(fā)表文獻(xiàn)，說(shuō)明脊髓灰質(zhì)炎病毒可以在靈長(zhǎng)類(lèi)的神經(jīng)組織或其它組織中生長(zhǎng)。導(dǎo)致這一開(kāi)創(chuàng)性成果的出現(xiàn)可以簡(jiǎn)要概括如下。早在1880年，Annold發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞可以在體外分裂，隨后又有人發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物離體組織在浸泡在血清、淋巴或腹水等組織液中可以生長(zhǎng)。通過(guò)R.Harrison發(fā)明的懸滴培養(yǎng)法是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，其方法是將蝌蚪脊髓放入特殊的中空的載玻片，里面裝入淋巴液，上面用蓋玻片封住。Correl又對(duì)這項(xiàng)工作進(jìn)行拓展，他發(fā)展出一種巧妙的方法

2、，可以使培養(yǎng)細(xì)胞保持不受外來(lái)雜菌的污染，這在當(dāng)時(shí)很少有人能夠做到。再后來(lái)，培養(yǎng)基中加入促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，到了1928年，能夠在試管中培養(yǎng)的雞胚或小鼠的碎組織中使病毒生長(zhǎng)，這些方法被Enders借鑒，他和他的同事在培養(yǎng)過(guò)程中使用了剛剛在10年前發(fā)明的抗生素，這對(duì)他的試驗(yàn)大有幫助。在20世紀(jì)50年代初期，Salk通過(guò)滾管培養(yǎng)猴腎組織或睪丸組織的方法制成了脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗。這種方法建立起來(lái)以后，其它疫苗也通過(guò)雞胚或靈長(zhǎng)類(lèi)胚細(xì)胞生產(chǎn)。8.2 從動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中獲得產(chǎn)品的類(lèi)型動(dòng)物病毒至今仍然是從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的最多的商業(yè)產(chǎn)品。目前，每年大約生產(chǎn)1.5109劑量的口蹄疫病毒疫苗，針對(duì)家禽新城病和馬克

3、萊氏病的疫苗數(shù)量與之相當(dāng)。人類(lèi)病毒疫苗每年的投藥量每年不超過(guò)108劑量。生產(chǎn)干擾素的方法仍然處于發(fā)展中，將來(lái)會(huì)接近或超過(guò)動(dòng)物疫苗的規(guī)模，但是現(xiàn)在而言，從特殊合成的雜交瘤中提取的免疫生物制劑仍然是人們不熟悉的領(lǐng)域，然而，這方面無(wú)疑將是未來(lái)十年會(huì)取得重要進(jìn)展的領(lǐng)域。8.3產(chǎn)品獲得的方法綜述從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得產(chǎn)品的基本路線(xiàn)已經(jīng)在圖中列出。基本上有三個(gè)時(shí)期組成。第一個(gè)時(shí)期是準(zhǔn)備期，第二個(gè)時(shí)期涉及到動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。第三個(gè)時(shí)期是產(chǎn)品獲得。最后一個(gè)時(shí)期在有些產(chǎn)品的生產(chǎn)中并不涉及細(xì)胞的分離，而其它產(chǎn)品可能還要用病毒感染細(xì)胞或者加入誘導(dǎo)劑。在生產(chǎn)過(guò)程中，人們做了很多努力來(lái)控制各種成分的質(zhì)量，現(xiàn)在許多產(chǎn)品的生

4、產(chǎn)過(guò)程中的參數(shù)可以在線(xiàn)或者離線(xiàn)監(jiān)控。質(zhì)量監(jiān)控的目的是，確保培養(yǎng)基中所加入的物質(zhì)可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且不會(huì)污染細(xì)胞培養(yǎng)物。培養(yǎng)基的配制是相當(dāng)費(fèi)力的，并且需要技術(shù)熟練。許對(duì)確定的物質(zhì)相對(duì)來(lái)說(shuō)比較容易控制，然而水和血清這兩種組分并不容易控制。水可以有廣泛的獲得來(lái)源，但是即使通過(guò)蒸餾和去離子之后，水中仍然可能含有對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害的物質(zhì)。由于這個(gè)原因，將格陵蘭冰河深層中冰塊的融化水作為對(duì)照是有好處的。儲(chǔ)存準(zhǔn)備好的水也是很困難的，因?yàn)檎麴s水在室溫下可以產(chǎn)生大量的細(xì)菌，它們對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)是有害的。這可以通過(guò)我們將準(zhǔn)備好的水放在80攝氏度下保存，在該溫度下通常認(rèn)為蒸餾水是無(wú)菌的。通過(guò)處理將抗體出去的血清在細(xì)胞培

5、養(yǎng)中是非常有用的，可以避免抗體對(duì)病毒的影響。但是，購(gòu)買(mǎi)和檢測(cè)血清的費(fèi)用是高昂的，因此可以在實(shí)驗(yàn)室中生產(chǎn)。對(duì)血清質(zhì)量的完全控制是試驗(yàn)可重復(fù)的重要因素。一般將血清置于20攝氏度的環(huán)境下，避免血清變質(zhì)。小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中是比較常用的，但是它比較稀少和昂貴。并且其中有可能含有支原體和噬菌體的污染。動(dòng)物細(xì)胞可以通過(guò)兩種基本的方式進(jìn)行培養(yǎng)。大多數(shù)的動(dòng)物細(xì)胞，當(dāng)它們碰到固體培養(yǎng)基或其它固體表面時(shí)，這種環(huán)境可以誘導(dǎo)它們進(jìn)行分類(lèi)。還有一些細(xì)胞，可以在液體中懸浮生長(zhǎng)。前者被稱(chēng)為單層細(xì)胞，因?yàn)楸M管在連續(xù)培養(yǎng)的條件下它們可以形成幾層細(xì)胞，但是通常它們只能形成一層細(xì)胞。不用通過(guò)固體培養(yǎng)基的細(xì)胞稱(chēng)為懸浮細(xì)胞。一般認(rèn)為只

6、能進(jìn)行單層生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)原癌基因較少，而懸浮細(xì)胞中較多，因此，懸浮細(xì)胞一般不用于人類(lèi)免疫制品。很多時(shí)候表明，單層細(xì)胞與懸浮細(xì)胞相比，可以生產(chǎn)更多類(lèi)型的病毒。然而，一旦病毒可以通過(guò)懸浮細(xì)胞獲得，大規(guī)模的生產(chǎn)將更加容易。獸用產(chǎn)品多通過(guò)該方法來(lái)獲得，例如干擾素就是通過(guò)雜交瘤生產(chǎn)的免疫生物制劑。盡管用于后兩種制品的細(xì)胞在檢測(cè)中被證明具有致癌性，但是在生產(chǎn)過(guò)程中或者在使用過(guò)程中也不具有危險(xiǎn)性，因?yàn)樵谑褂弥埃瑫?huì)把細(xì)胞出去。8.4單層細(xì)胞生長(zhǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)所需的培養(yǎng)基可以分為兩種類(lèi)型。增加設(shè)備數(shù)量可以擴(kuò)大處理規(guī)模。獲得細(xì)胞需要多個(gè)處理步驟，通過(guò)增加設(shè)備的規(guī)模，也可以擴(kuò)大處理的規(guī)模。單層細(xì)胞培養(yǎng)的多步處理通

7、常，可以在靜止玻璃瓶中或培養(yǎng)皿中生產(chǎn)單層細(xì)胞。這些瓶子具有不同的結(jié)構(gòu)，分別以以Brockway，Rorx，Carrel，Baxter或醫(yī)用flat命名。這些瓶子可以使用蘇打玻璃，但是最好使用硅硼玻璃，因?yàn)楸M管后者價(jià)格較高，但是硅硼玻璃較為結(jié)實(shí)并且易于修補(bǔ)。這些瓶子可以單獨(dú)使用，但是為了運(yùn)輸方便，它們通常堆放在瓶架上。固定瓶培養(yǎng)系統(tǒng)已經(jīng)有了一些發(fā)展，可以確保細(xì)胞在瓶子所有的內(nèi)表面而不是瓶子的底部生長(zhǎng)，這需要轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中，盡管固定在夾子上的方形瓶子也可以轉(zhuǎn)動(dòng)，但是在該系統(tǒng)中通常采用圓柱形的瓶子。在該種培養(yǎng)系統(tǒng)中，有許多不同規(guī)格的瓶子，有些瓶子的長(zhǎng)度達(dá)到了180cm。這些瓶子放置在可以通過(guò)

8、機(jī)械方式轉(zhuǎn)動(dòng)的瓶架上。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)瓶設(shè)備可以放置72個(gè)瓶子，610個(gè)這樣的瓶架可以組成一個(gè)適宜規(guī)模的生產(chǎn)單元。轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)已經(jīng)在意大利的Zooprofilattico Sperimentale研究所發(fā)展到了極至，在那里，每四個(gè)培養(yǎng)箱中可以同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)7000個(gè)瓶子。向這么多瓶子中間添加培養(yǎng)基、細(xì)胞和病毒的同時(shí)又要保證培養(yǎng)不被細(xì)菌污染，這是一個(gè)困難的但并不是不可克服的問(wèn)題，該研究所的高度自動(dòng)化控制也提高了這種方法的經(jīng)濟(jì)活力。單層細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的處理單元單層細(xì)胞培養(yǎng)處理單元的發(fā)展始于20世紀(jì)60年代中期，現(xiàn)在已經(jīng)成為被廣泛接受的實(shí)用技術(shù)。近年來(lái)各地許多作者對(duì)這方面許多發(fā)展的細(xì)節(jié)被做了回顧。下面我們將要討

9、論的是不同系統(tǒng)中的最粗略的框架和最新進(jìn)展。處理單元是在多步處理可信成功的操作之后發(fā)展起來(lái)的，設(shè)計(jì)單處理的目的是取代多步處理步驟。因此，單元處理是在平皿固定架子上發(fā)展起來(lái)的，使人聯(lián)想起固定瓶子的架子。這些平皿是由一次性的聚苯乙烯或聚碳酸酯做成的，而不是鈉玻璃。后來(lái)，平皿架有了改進(jìn)，通過(guò)垂直轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，近年來(lái)，通過(guò)水平方向轉(zhuǎn)動(dòng)平皿。后者已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；壳氨粡V泛應(yīng)用于干擾素或呈纖維干擾素的生產(chǎn)。這種生產(chǎn)系統(tǒng)的規(guī)?；诩?xì)胞培養(yǎng)和清洗等方面面臨著工程和操作上的困難。 容器內(nèi)的表面積的是受到限制的，這將導(dǎo)致兩方面的后果：圓盤(pán)的兩面都要被利用產(chǎn)品以很稀的方式得到，因?yàn)樗械钠矫笾械呐囵B(yǎng)基是充滿(mǎn)或者至少是半

10、充滿(mǎn)的狀態(tài)。滾管技術(shù)的發(fā)展可以從多管細(xì)胞繁殖器中得以展現(xiàn)。這種系統(tǒng)已經(jīng)達(dá)到了200L體積的規(guī)模。Gyrogen，一個(gè)具有很大表面積的細(xì)胞培養(yǎng)儀器，是由很多平行的管子組成，這些管子通過(guò)額外的驅(qū)動(dòng)力在100L體積的圓柱形外殼內(nèi)旋轉(zhuǎn)。這種昂貴的設(shè)備可以工作，但是用這種設(shè)備生產(chǎn)是否經(jīng)濟(jì)上可行還沒(méi)有討論。利用纖維中空管的收縮性質(zhì)取得了很多具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的進(jìn)展。在小規(guī)模條件下，它可以模擬動(dòng)物組織生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)基通過(guò)纖維腔滲透過(guò)來(lái)。這種系統(tǒng)在兩個(gè)方面具有優(yōu)勢(shì)，廢物和產(chǎn)物都能夠從生產(chǎn)細(xì)胞中借助半透膜加以分離。該系統(tǒng)中半透膜的孔徑已經(jīng)發(fā)展到0.21個(gè)尺度，并且已經(jīng)用于商業(yè)生產(chǎn)，其自動(dòng)化與檢測(cè)系統(tǒng)都已比較完善。旋轉(zhuǎn)膜或

11、者旋轉(zhuǎn)袋也已經(jīng)被使用了，但是這些系統(tǒng)只能在小規(guī)模得以應(yīng)用，商業(yè)規(guī)模應(yīng)用的計(jì)劃還沒(méi)有啟動(dòng)。目前很多公司利用填充床生產(chǎn)細(xì)胞或相關(guān)產(chǎn)品如干擾素或者口蹄疫病毒和豬水皰病毒。填充材料有所不了同，有的采用包有聚苯乙烯的不銹鋼小球，有的采用玻璃珠。通過(guò)采用填充床，培養(yǎng)基可以循環(huán)使用，許多控制動(dòng)作可以方便的集中在輔助培養(yǎng)基貯池，它在大多數(shù)系統(tǒng)中都是常見(jiàn)的。它們相對(duì)來(lái)說(shuō)容易操作，便于擴(kuò)大規(guī)模，因?yàn)椴僮鹘y(tǒng)一的填充柱的機(jī)械問(wèn)題很好解決。由于玻璃常用作基質(zhì)，操作的可信性提高，并且細(xì)胞和玻璃表面的親和性與在實(shí)驗(yàn)室中沒(méi)有變化。更重要的是，當(dāng)從這種細(xì)胞熟悉的基質(zhì)上生產(chǎn)某一生物產(chǎn)品時(shí)，在控制產(chǎn)品散播方面幾乎不會(huì)遇到問(wèn)題。顯然

12、，固定填充床培養(yǎng)也不是沒(méi)有自身的問(wèn)題。沿著填充床存在著一定的梯度，并且培養(yǎng)物如果不放在顯微鏡下進(jìn)行觀察，很難對(duì)培養(yǎng)進(jìn)行監(jiān)控。雖然后一個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)檢測(cè)更容易檢測(cè)的循環(huán)培養(yǎng)基來(lái)克服，但是系統(tǒng)中的不均一性的問(wèn)題仍然存在。Quasi均質(zhì)系統(tǒng)是由Wezel開(kāi)發(fā)的生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的系統(tǒng)。在1967年他闡明細(xì)胞可以在直徑為0.2mm的包有火棉膠的DEAE葡聚糖顆粒上生長(zhǎng)。這些顆粒可以在攪拌很輕的情況下懸浮在溶液中，因此細(xì)胞可以附著在這些微載體上生長(zhǎng)。從這以后，許多研究者證明這些微載體上培養(yǎng)細(xì)胞規(guī)?？梢赃_(dá)到500L。最近的類(lèi)似報(bào)道是利用綠猴腎細(xì)胞系的現(xiàn)代微載體，它們用聚苯乙烯，聚丙烯或者玻璃珠制成。然而，似

13、乎葡聚糖微載體更適合作為微載體。懸浮細(xì)胞產(chǎn)物的處理懸浮動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物的處理與細(xì)菌培養(yǎng)物的處理幾乎相同。進(jìn)來(lái)的一些綜述描述了控制的一些參數(shù)。所用的設(shè)備是標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵設(shè)備，稍加改動(dòng)，使攪拌強(qiáng)度和通氣量有所下降。這樣的系統(tǒng)已經(jīng)是傳統(tǒng)的方法，可以擴(kuò)大規(guī)模到8000L。在這樣的規(guī)模下，可以通過(guò)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞或者其它的倉(cāng)鼠細(xì)胞系，IFFA3，商業(yè)化生產(chǎn)口蹄疫病毒。并且，干擾素也是通過(guò)淋巴細(xì)胞系Namalwa通過(guò)近似的設(shè)備和規(guī)模進(jìn)行生產(chǎn)的。這些設(shè)備的攪拌系統(tǒng)做了一些改變，與氣體攪拌發(fā)酵類(lèi)似。原料的混合通過(guò)發(fā)酵罐底部的氣泡來(lái)實(shí)現(xiàn)，因?yàn)檫@對(duì)移動(dòng)液體非常有效，并且不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害。常規(guī)噴霧，可以增加氣泡的表面積，會(huì)對(duì)動(dòng)

14、物細(xì)胞造成嚴(yán)重的損害。溶氧水平本身不會(huì)有害，除非它低于在標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力下培養(yǎng)基溶氧量的15或者高于標(biāo)準(zhǔn)溫度壓力下培養(yǎng)基中的溶氧量，但是細(xì)胞在氣液界面的相互作用降低細(xì)胞的活性。奇怪的是，快速的物理攪拌似乎對(duì)細(xì)胞并無(wú)多大影響，但是，這些參數(shù)對(duì)質(zhì)量影響的明確的研究仍需繼續(xù)進(jìn)行。 8.5下游處理許多應(yīng)用于通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)稀有物質(zhì)的下游處理技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用，這些技術(shù)與蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域的有些技術(shù)類(lèi)似，下面我們要詳細(xì)討論動(dòng)物細(xì)胞下游處理技術(shù)中獨(dú)特的地方。一些操作在其它的領(lǐng)域也是常用的，比如過(guò)濾，離心，沉淀，色譜等，在此不做討論。滅活盡管許多疫苗是通過(guò)有感染性的病毒顆粒制成的，但是還有一些是通過(guò)殺死的活滅火的病毒制

15、成的。在第二種情況中，保證接受者不會(huì)被疫苗中殘留的病毒感染是非常重要的。用于滅活的常用的試劑有甲醛，丙酸內(nèi)酯用于滅活狂犬病毒。最近，亞胺用于滅活口蹄疫病毒。亞胺可以稍稍瓦解口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)，甲醛可以使衣殼粒發(fā)生交聯(lián)，使基本結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。其它的滅活方法，比如紫外輻射或者利用縮水甘油醛也被采用，在所有的應(yīng)用中，要保證待處理的病毒單分散，否則失活劑無(wú)法到達(dá)病毒簇的內(nèi)部。亞基形成如果滅后不徹底，病毒疫苗對(duì)于接受者來(lái)說(shuō)是危險(xiǎn)的，因此我們通過(guò)利用去垢劑將病毒分解，可以制造亞基病毒疫苗，最終的疫苗通過(guò)病毒均有免疫原性的部分制得。制備這種亞基病毒的最好候選者是狂犬病毒疫苗和乙肝疫苗，皰疹疫苗，巨細(xì)胞病毒疫苗和

16、流感疫苗。目前為止，對(duì)分離的流感病毒的凝血素糖蛋白抗原試驗(yàn)表明，這種疫苗是有效的，雖然沒(méi)有天然病毒引起免疫反應(yīng)有效，到那時(shí)如果注射足夠的劑量，也可以得到足夠強(qiáng)度的免疫反應(yīng)。產(chǎn)品闡述活體病毒疫苗通常含有14種不同的病毒類(lèi)型，每一種代表約1000個(gè)活的病毒顆粒。這些物質(zhì)在有生物保護(hù)劑的條件下被凍干，如蔗糖，牛血清或者白蛋白和磷酸根離子。死體病毒疫苗與之不同，改種疫苗每劑量含有1011病毒顆粒并和稱(chēng)為佐劑的物質(zhì)混合，佐劑可以增加抗原的效果。佐劑由不同的化學(xué)物質(zhì)組成，比如強(qiáng)心甘皂素，各種鋁鹽和各種含油物質(zhì)，病毒的水相懸液可以乳化形成油包水的乳化液，在含有去垢劑的鹽溶液存在的情況下，隨后轉(zhuǎn)變成水包油的乳化液。這些物質(zhì)在激發(fā)免疫系統(tǒng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，使抗原激發(fā)出最激烈的免疫反應(yīng)。8.6基因工程動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌將限定序列核酸片段插入到原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞中，然后收集產(chǎn)品，比如蛋白質(zhì)，這種能力將對(duì)細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞的生物工