分子生物學實驗原理-課件(PPT 150頁)

1、分子生物學實驗原理第1頁，共150頁。第一節(jié) 分子生物學發(fā)展概述第2頁，共150頁。分子生物學molecular biology是在分子水平上研究生物的結(jié)構(gòu)、組織和功能的科學。1950年，Astbury在一次學術(shù)報告中，首次提出并使用了分子生物學這一名詞術(shù)語。廣義和狹義之分醫(yī)學分子生物學是應(yīng)用分子生物學技術(shù)和理論來闡明人體正常生理活動和病理過程及其調(diào)控的分子機理。第3頁，共150頁。分子生物學理論與實際應(yīng)用的成就理論方面1.關(guān)于腫瘤的發(fā)生： 提出了腫瘤起源于細胞增殖和分化調(diào)控的失常和細胞同它周圍組織關(guān)系的紊亂。 癌基因：100多種；抑癌基因：20多種 細胞周期調(diào)控系統(tǒng) 細胞凋亡 端粒酶第4頁，

2、共150頁。2.關(guān)于艾滋病 Acquired Immune Deficiency Syndrome HIV序列；疫苗3.關(guān)于慢性病chronic disease，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松，發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因及其多態(tài)性。4.關(guān)于生長、發(fā)育與進化的統(tǒng)一理論，也深入到了分子水平。第5頁，共150頁。實際應(yīng)用方面1.轉(zhuǎn)基因植物目前已鑒定和克隆化的用于轉(zhuǎn)基因植物的基因有100多個?？钩輨?、抗昆蟲、抗病毒、抗不良環(huán)境因素（抗寒、抗鹽堿地、抗旱、抗?jié)常?、提高作物的產(chǎn)量、提高蛋白質(zhì)含量、改善氨基酸構(gòu)成等。第6頁，共150頁。2.轉(zhuǎn)基因動物 1983年，超級小白鼠，體重是正常鼠的2倍。隨后出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬

3、、羊、雞、兔、牛、鯉魚等。我國目前研究了金魚、鯉魚、圓頭魴。3.基因工程多肽藥物與疫苗 主要指DNA體外重組技術(shù)所研制的產(chǎn)品，轉(zhuǎn)基因動物和植物所研制的產(chǎn)品，以及蛋白質(zhì)工程技術(shù)所研制或改進的產(chǎn)品。第7頁，共150頁。 4.基因診斷與基因治療 基因診斷gene diagnosis是指通過直接探查基因的存在狀態(tài)或缺陷，從而對疾病作出診斷的方法。 目的物：DNA或RNA 方法：核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、 DNA芯片技術(shù) 疾病：遺傳性疾?。粋魅静』蚋腥拘约膊〉?頁，共150頁。基因治療gene therapy 指將正常的外源基因?qū)肷矬w靶細胞內(nèi)，以彌補所缺失的基因，關(guān)閉或降低異常表達的基因，以達到

4、治療疾病的目的。治療疾?。?遺傳病 惡性腫瘤 傳染病第9頁，共150頁。5.環(huán)境監(jiān)測與凈化 area survey and depollution 監(jiān)測：可檢測環(huán)境中的病毒和細菌 凈化：改造細菌分解環(huán)境中的石油、殘留的農(nóng)藥和有毒金屬6.克隆動物Clone animal 1997年“多利”克隆羊 克隆器官（干細胞stem cell技術(shù)）第10頁，共150頁。7.人類基因組計劃human genome project;HGP1990年，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH） 和美國能源部聯(lián)合發(fā)表了人類基因組計劃。30億個堿基對，估計有3萬4萬個人類基因。2000年6月26日，首次繪成人類基因組“工作框架圖”

5、 。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6國科學家及領(lǐng)導人宣布人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)。 第11頁，共150頁。 意 義與“阿波羅”登月計劃相媲美1996年諾貝爾化學獎得主羅伯特柯特認為，20世紀是物理學和化學的世紀，21世紀將是生物學的世紀。推動分子生物學更加快速地發(fā)展：蛋白質(zhì)組學、代謝蛋白質(zhì)組學、藥物蛋白質(zhì)組學、毒物蛋白質(zhì)組學、營養(yǎng)蛋白質(zhì)組學及各種計劃第12頁，共150頁。對其他相關(guān)學科的影響1.向其他學科滲透2.形成了許多新興的邊緣學科 基礎(chǔ)醫(yī)學方面：腫瘤分子生物學、免疫分子生 物學、神經(jīng)分子生物學等 預防醫(yī)學方面：分子營養(yǎng)學、分子毒理學、分

6、子流行病學、遺傳流行病學、人 類基因組流行病學、 公共衛(wèi)生 遺傳學第13頁，共150頁。在預防醫(yī)學中的應(yīng)用及發(fā)展方向1.慢性病的研究 慢性病的發(fā)病原因絕大多數(shù)是基因與外界環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。2.環(huán)境因素對人類遺傳物質(zhì)損傷的研究及“三致”毒性的研究：生物標志物的研究和評價方法的建立3.環(huán)境監(jiān)測與污染物的凈化。第14頁，共150頁。4.遺傳病的產(chǎn)前診斷（基因型預防）及早期診斷（表型預防）。5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。 6.對環(huán)境因素敏感基因及易感人群的研究環(huán)境基因組計劃（環(huán)境基因組學） （1）環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)基因 （2）篩選多態(tài)性及易感性 （3）根據(jù)易感性制定不同的干預計劃第15頁，共1

7、50頁。一、分子生物學一些重要的理論知識1.分子生物學發(fā)展史上一些重要的事件（1）1865年，“遺傳學之父”G.Mendel根據(jù)豌豆雜交試驗結(jié)果，創(chuàng)立了遺傳因子學說，即遺傳的分離律和自由組合律。（2）1903年W.Sutton提出染色體是Mendel遺傳單位的載體的概念。（3）1909年，W.Johannsen將這種在染色體上的遺傳單位定名為基因（gene）。第16頁，共150頁。（4）1910年，現(xiàn)代實驗遺傳學奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蠅的遺傳規(guī)律時發(fā)現(xiàn)了基因的連鎖律和交換律。（5）1944年，OT.Avery等人（3人）分離出細菌 DNA，并發(fā)現(xiàn)DNA是攜帶生命遺傳物質(zhì)的

8、分子。（6）1950年，Astbury在一次演講中，首次使用了 “分子生物學” 術(shù)語。（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，揭示了遺傳物質(zhì)自我復制的機制。第17頁，共150頁。（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick 等人破譯了DNA遺傳密碼，1966年 破譯了64個遺傳密碼。 提出了遺傳信息由DNA RNA蛋白質(zhì)傳遞的中心法則。 （9）1969年，Jonathan Beckwith及其同事在哈佛大學成功分離出第一個基因。（10）1970年，發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。（11）1961年，F(xiàn).Jacob和J.Monod提出了乳糖操縱子學說。第18頁，共

9、150頁。（12）自1946年起的20年當中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多質(zhì)粒；1968年至1970年又發(fā)現(xiàn)了許多限制性內(nèi)切酶，為DNA體外重組提供了有利工具。（13）1973年，重組DNA技術(shù)問世。（14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技術(shù)（15）1990年，人類基因組計劃。第19頁，共150頁。 2.三個重要理論important theory(1)DNA的結(jié)構(gòu)、復制、中心法則基本構(gòu)成單位是核苷酸核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸構(gòu)成。堿基分別是腺嘌呤 (A)、鳥嘌呤 (G)、胸腺嘧啶 (T)和胞嘧啶(C)。相鄰的兩個核苷酸以磷酸二酯鍵相連進一步盤旋、折疊，形成三級或四級結(jié)構(gòu)第20頁，共150頁。

10、RNA與DNA有如下不同點：五碳糖為核糖(不是脫氧核糖)；堿基中有尿嘧啶U(uracil)而沒有胸腺嘧啶RNA為單鏈，不是雙鏈，但RNA單鏈之間相鄰的堿基可由氫鍵作用形成局部雙鏈。 DNA存在于細胞核的染色體、線粒體以及染色體以外的質(zhì)粒中(質(zhì)粒是一些雙鏈，閉環(huán)的DNA分子)。第21頁，共150頁。 DNA(或RNA) 結(jié)構(gòu)給我們的啟示 DNA(或RNA)是水溶性的。這是由于含有磷酸基因、羥基和氨基。在核酸提取過程中，我們保留的是水相、而不是有機相。核酸是兩性電離，既帶正電荷，又帶負電荷。它的等電點(PI)為22.5。在中性溶液中帶負電荷。對核酸進行電泳時，點樣時應(yīng)點在負極；雜交時選擇尼龍膜時，

11、最好選擇帶正電荷的尼龍膜。(核酸帶負電荷，容易吸附到帶正電荷的膜上，牢固，不掉) 第22頁，共150頁。DNA在細胞中存在部位不同(細胞核、線粒體、質(zhì)粒)，所以應(yīng)注意提取方法的不同 由于DNA空間構(gòu)象不同，在電泳時遷移率不同。根據(jù)堿基互補配對原則，可設(shè)計引物和探針雜交。由于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和RNA易由于分子內(nèi)氫鏈作用形成二級結(jié)構(gòu)，所以在進行雜交等反應(yīng)時，首先應(yīng)加熱變性，破壞二級結(jié)構(gòu)。第23頁，共150頁。 在解旋酶的作用下，打開DNA雙鏈 在特定的復制起始點 以每條DNA鏈為模板 在DNA聚合酶的催化下 以4種脫氧核苷酸為前體物，合成一條互補DNA鏈。DNA的復制雙稱為半保留復制。DNA的復

12、制第24頁，共150頁。DNA 半 保 留 復 制第25頁，共150頁。DNA在復制起始點，由解旋酶打開雙鏈，形成復制叉，合成新鏈的方向為5-3端前導鏈與后隨鏈后隨鏈的合成是不連續(xù)的。 先合成RNA引物 再合成不連續(xù)的小片段(岡崎片段，1001000核苷酸長度) 最后在DNA連接酶作用下，將小片段連接起，形成完整的DNA鏈。 第26頁，共150頁。DNA 半 不 連 續(xù) 復 制第27頁，共150頁。DNA的復制給了我們一些啟示 PCR技術(shù)的原理：在體外要靠溫度(90以上)打雙鏈，而不是解旋酶，也是以DNA為模，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP為前體。PCR與體內(nèi)(細胞內(nèi))DNA復制的最大

13、差異是溫度。檢測核分裂指數(shù)：在細胞培養(yǎng)中，加入3H標記的dNTP前體物，被細胞攝取后，參與DNA復制，復制速度越快，參入的3H標記的dNTP越多，可用液閃計數(shù)儀檢測放射性強度，據(jù)此判斷。第28頁，共150頁。遺傳信息的傳遞是： DNARNA多肽(蛋白質(zhì))在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA蛋白質(zhì)以上就是完整的中心法則理論，亦可稱為基因的表達(expression)。中心法則第29頁，共150頁。中 心 法 則第30頁，共150頁。 轉(zhuǎn)錄(transcription) 以DNA為模板，合成RNA的過程。 非模板鏈稱為有意義鏈，而模板常稱為反義鏈。 轉(zhuǎn)錄的過程大致是這樣的： 以

14、DNA一條鏈為模板， 誘導RNA聚合酶活性、RNA聚合酶識別并結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點 以ATP、GTP、CTP和UTP為前體，合成(轉(zhuǎn)錄)RNA 當遇到轉(zhuǎn)錄終止信號時，轉(zhuǎn)錄即停止。第31頁，共150頁。有意義鏈反義鏈第32頁，共150頁。轉(zhuǎn)錄后的初級產(chǎn)物剪切掉內(nèi)含子，并將外顯子連接起來，這樣才能變成成熟的RNA分子還需要在5-端加一個特殊的核苷酸，7-甲基鳥嘌呤核苷酸，這個過程叫戴帽另外，mRNA的，這一過程又叫穿靴， 3-端還要加上一串腺苷酸(AMP)poly(A)或多聚腺苷酸化。同一機體不同的細胞具有相同的DNA或基因，但基因在不同細胞的表達是不同的，具有組織特異性，使不同的細胞具有不同的功能

15、第33頁，共150頁。由RNA 蛋白質(zhì)的過程，又叫翻譯。只有聚合酶II催化的反應(yīng)產(chǎn)物是mRNA，而只有mRNA才翻譯成蛋白質(zhì)?；?DNA)上三個相鄰的堿基組成一個密碼子，一個密碼子決定一種特定的氨基酸，共有43=64個密碼子。在轉(zhuǎn)錄過程中，基因上的三聯(lián)密碼子轉(zhuǎn)錄成mRNA上的三聯(lián)密碼子。mRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細胞漿中的核糖體上，以三聯(lián)密碼子指導合成蛋白質(zhì)。翻譯后的蛋白質(zhì)需要加工修飾。 第34頁，共150頁。中心法則給了我們一些啟示：遺傳信息由DNA上的基因決定。一旦基因發(fā)生突變，將最終導致所翻譯的蛋白質(zhì)發(fā)生改變，從而導致生理功能改變，甚至出現(xiàn)疾病，如癌癥、肥胖等。 mRNA更能準確簡便地反映D

16、NA上基因所攜帶的遺傳信息。因此對基因序列的分析，常分析mRNA的序列即可。第35頁，共150頁。 基因的表達有組織特異性，且受許多因素的影響，使mRNA的表達增強、降低甚至關(guān)閉，從而影響機體正常生理功能，甚至出現(xiàn)疾病。因此常需要檢測mRNA的表達的豐度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Real time)PCR等。這里需要特別強調(diào)：在檢測mRNA(或蛋白)表達時，一定要先弄清該基因在某種組織中是否有表達。第36頁，共150頁。 根據(jù)中心法則，可以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。 根據(jù)mRNA的3端有poly(A)的特點

17、，在進行反轉(zhuǎn)錄時，就以poly(A)為模板設(shè)計了引物。并且純化mRNA的方法，也是根據(jù)poly(A)的原理設(shè)計的。根據(jù)最后的翻譯蛋白質(zhì)去向的不同，建立不同的蛋白質(zhì)提取方法，如在線粒體，在細胞核、在細胞漿、分泌到血液中。 第37頁，共150頁。（2）基因表達調(diào)控 以乳糖操縱子學說為例 乳糖操縱子的基本組成元件 調(diào)節(jié)基因 結(jié)構(gòu)基因 I P O 抑制基因(I) ：是阻遏物編碼區(qū)啟動基因(P) ：有cAMP受體蛋白(CRP) 和RNA聚合酶的結(jié)合位點操縱基因(O)：是阻遏物結(jié)合位點 ：-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因：透過酶結(jié)構(gòu)基因：轉(zhuǎn)乙酰酶的結(jié)構(gòu)基因第38頁，共150頁。調(diào)節(jié)方式 當乳糖時,cAMP含量增高 c

18、AMP與CAP (分解產(chǎn)物激活劑蛋白)結(jié)合成CRP該復合物與啟動基因上對應(yīng)的位點結(jié)合后使DNA雙鏈不穩(wěn)定；隨后RNA聚合酶則容易與啟動基因緊密結(jié)合；若此時操縱基因上無阻遏物，則基因被打開RNA聚合酶從DNA的5端開始滑動，即開始轉(zhuǎn)錄，并合成了3種酶。第39頁，共150頁。當葡萄糖cAMPCRPRNA聚合酶則不能與啟動基因結(jié)合，也就不能轉(zhuǎn)錄和合成3種酶。抑制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成阻礙蛋白，并與操縱基因結(jié)合,阻止RNA聚合酶滑動而抑制轉(zhuǎn)錄。這種情況又稱為負調(diào)節(jié)如果阻遏蛋白與誘導物結(jié)合(此處為乳糖) 。則這個復合物不能與操縱基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄和翻譯就能進行。 第40頁，共150頁。操縱子學說擴大了基因的概念。

19、即結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因發(fā)揮正、負調(diào)節(jié)受細胞內(nèi)外環(huán)境因素的影響。形成了基因調(diào)控和表達的概念?；虮磉_調(diào)控理論，不僅有助于理解生命現(xiàn)象的本質(zhì)，而且對基因工程的建立是至關(guān)重要。 第41頁，共150頁。 （3）DNA重組(基因工程)基因工程的兩個重要工具：一是內(nèi)切酶，能特異地識別DNA的堿基序列，并在DNA鏈當中將DNA切開。二是載體，如質(zhì)粒、噬菌體、病毒。載體的共同特點： 環(huán)狀DNA；都能專一感染某一類細胞；具有某種選擇性標記；都具有一些內(nèi)切酶位點；都能隨著染色體的復制而復制，隨著細胞分裂而擴增。 第42頁，共150頁?；蚬こ痰幕境绦颍?取得所需要的目的基因； 將目的基因同載體連接； 再將

20、這個重組環(huán)狀DNA引入受體細胞(或稱寄主細胞)； 使目的基因得以表達，即基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)。第43頁，共150頁。第二節(jié) 核酸的提取技術(shù)extractive technique of nucleic acid 第44頁，共150頁。 1. 結(jié)合狀態(tài) 2.形態(tài)：分線形和環(huán)形；分雙鏈和單鏈 3.分布： DNA分布在細胞核和細胞； RNA 分布在細胞質(zhì)、細胞核和細胞器（一）核酸在細胞中的存在狀態(tài)和分布第45頁，共150頁。（二）核酸分離提取的原則、要求 1.原則：(1)應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； (2)排除其它分子的污染，純度要高。 2.對于核酸純度的要求： (1)對于核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有

21、抑制作用 的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； (2)其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子 污染應(yīng)降低到最低程度； (3)排降其它核酸分子的污染，如提取DNA時， 應(yīng)去除RNA，反之亦然。 第46頁，共150頁。3.注意事項 (1)盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞(2)減少化學因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的 破壞，操作多在pH410條件下進行。第47頁，共150頁。(3)減少物理因素對核酸的降解。物理因素主要是機械剪切力，其次是高溫。機械剪切力主要來源于溶液的快速振蕩，攪拌等。常規(guī)操作溫度為04。(4)避免生物因素對核酸的降解。細胞內(nèi)外均存

22、在核酸酶，尤其是RNA酶存在廣泛、穩(wěn)定，極易降解核酸。因此提取過程中，應(yīng)注意采用核酸酶抑制劑和破壞方法。第48頁，共150頁。 (三)DNA的提取、純化 真核細胞染色體DNA的制備(提取、純化) 根據(jù)不同的實驗要求，可有不同的DNA提取方法，如酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃棒纏繞法，異丙醇沉淀法等。但這些方法在基本原理及大致步驟上是基本相同的。而且酚抽提法比較經(jīng)典常用，下面就以此方法為例進行介紹。第49頁，共150頁。 酚抽提法 酚抽提法的基本原理：用SDS和蛋白酶K破壞和消化細胞用酚去除水相中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)通過鹽和乙醇沉淀獲得DNA。 第50頁，共150頁。試劑： 1 磷酸鹽緩沖液PBS

23、 2 DNA抽提緩沖液： 10mmol/L Tris.cl (緩沖溶液的pH值，pH8.0)。 0.1mol/L EDTA(金屬離子絡(luò)合劑，可抑制DNA聚合酶活性)。 20g/ml 胰RNA酶(破壞降解RNA) 0.5% SDS(表面活性劑，破壞細胞) 。 蛋白酶K (消化細胞、破壞細胞)第51頁，共150頁。320mg/ml蛋白酶K，消化細胞，破壞細胞4酚（用0.5 mol/L TrisCl，pH 8.0飽和），主要作用是沉淀蛋白質(zhì)等510 mol/L NH4Ac，其作用是沉淀DNA6乙醇，其作用是沉淀DNA7TE（Tris和EDTA混合液），是溶解保存DNA的最好溶液8透析液： 50 mm

24、ol/L TrisCl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA，pH 8.0第52頁，共150頁。 樣品前處理 (1)生物組織：新鮮的生物組織，先用剪切刀清除組織中筋膜等結(jié)締組織，吸干血液。若不能馬上進行DNA提取，可將生物組織貯存于液氮中或-70冰箱中。a.取13g左右的組織，用8層紗布包好，外層再包多層牛皮紙，浸入液氮中使組織結(jié)凍，取出后用木錘將其敲碎。b.將敲碎的組織放入搪瓷研缽中，加入少許液氮，用研杵碾磨。需反復添加液氮。第53頁，共150頁。C.在離心管中加入10ml DNA抽提液，用玻璃棒邊攪動邊加入組織粉末，然后37保溫1小時。(先加抽提液，后加組織粉末，有利于充分溶解，用玻

25、璃棒而不用金屬棒，減小損傷DNA的機率，37保溫1小時，一方面有利于SDS破壞細胞，更主要是為了使溶液平衡溫度達到37，為下一步反應(yīng)準備適宜條件)。 第54頁，共150頁。(2)培養(yǎng)的細胞 a.收集細胞，懸浮培養(yǎng)(生長)的細胞；可以直接經(jīng)1500g離心(4,10分鐘)，以收集細胞；貼壁生長的細胞，用胰酶消化后再離心收集。細胞數(shù)應(yīng)在5107左右。 b.漂洗細胞，將離心沉淀的細胞用冰預冷的PBS液或生理鹽水，漂洗1次再離心，棄上清收集細胞?？芍貜推?-2次(目的去除培養(yǎng)液成分和細胞分泌的蛋白) c.保溫，再用10ml DNA抽提液將細胞沉淀懸浮，并在37保溫1小時。第55頁，共150頁。 (1)

26、消化 向上述預處理好的樣品溶液中(樣品溶解在DNA抽提液并保溫1小時)，加入20mg/ml的蛋白酶K，至終濃度為100g/ml，邊加邊用玻璃棒輕輕攪拌，使溶液至粘稠狀(細胞破裂，蛋白、核酸釋放)。將反應(yīng)液在50水浴上，保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應(yīng)不時輕輕搖勻反應(yīng)液。 DNA提取步驟第56頁，共150頁。(2)加酚混勻 將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入等容積已飽和的酚溶液，輕輕地上下轉(zhuǎn)動離心管，混勻兩相，反復該動作10min，直至水相與酚相混勻并成乳狀液。若沒有達到這種效果，可用多角度振蕩器溫和地混勻1小時(3)離心 室溫5000g，離心15min，使兩相分開(水相在上層，酚相在下層)，

27、(DNA在水相，因水溶性，帶負電荷)。(4)取上層水相用酚重復抽提兩次，取上層水相時，應(yīng)用大口徑(0.3cm)吸管，因水相粘稠 第57頁，共150頁。(5)又分兩種情況 a.透析處理：為提取大分子量DNA(200Kb以上)，在第3次酚抽提后，將DNA溶液裝入透析袋中，并放入4透析液中。每次透析液1升，換4次透析液，直至透析物OD270小于0.05，才算透析完畢。b.沉淀處理，對于100150Kb大小的DNA提取，在第三次酚抽提后，將上層水相移入一個新的離心管中，加入0.2倍容積的10mol/L乙酸銨和2倍容積95%乙醇。室溫下輕輕搖動，立刻就可看到乳白色絲狀沉淀出現(xiàn)，用一個前端為鉤狀的玻璃棒(

28、挑)出DNA纖維，立即放入70%乙醇中漂洗2次。室溫5000g，離心5min，棄上清。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。但注意不要使DNA沉淀完全干燥。然后加TE(pH8.0)溶解DNA 1224h 。第58頁，共150頁。(6)測定樣品在260nm和280nm的OD值，計算DNA含量和A260/A280比值。 260nm處，是核酸的最大吸收波長，在280nm處是蛋白質(zhì)最大吸收波長。 在260nm紫外線下，1OD的光密度值相當于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA或RNA為40g/ml。因此根據(jù)核酸的OD值，計算核酸樣品的濃度或含量。第59頁，共150頁。根據(jù)A260/A280比值，可判斷所提取核酸(D

29、NA)的純度。DNA純度比較理想的比值是1.8，RNA比值是2.0。若DNA比值高于1.8，說明有RNA的污染，低于1.8或1.75，則認為是蛋白質(zhì)或酚污染。RNA比值小于2.0，則認為也是蛋白質(zhì)或酚的污染。DNA樣品純度不符合要求(尤其是A260/A280比值小于1.8時) 可用酚或酚/氯仿和氯仿抽提2-3次， 用乙醚除去殘留氯仿，再揮掉乙醚。 最后用鹽和乙醇沉淀，用TE溶解。第60頁，共150頁。 本方法需要說明的幾點：(1) 5107細胞提取產(chǎn)量為200g左右。(2)對于上層水相比較粘稠，吸取上層水相時，會牽動兩相之間的蛋白質(zhì)沉淀層。此時可用吸管插到管底吸取酚相(采用負壓)，至蛋白質(zhì)層時

30、，停止。并離心(5000g,20分鐘)，沉淀蛋白質(zhì)，吸取上清液。(3)由于0.5% SDS的存在，可抑制部分胰RNA酶活性，故應(yīng)加大該酶用量，一般為20 g/ml(4)所用酚，應(yīng)重蒸酚，并用水飽和。第61頁，共150頁。（四）RNA的分離與純化1. 創(chuàng)造一個無RNA酶(RNase)的環(huán)境RNA酶在環(huán)境中無處不在：空氣中灰塵、微生物，人體汗液、唾液，以及各種器皿和試劑等，均存在RNase 。RNase非常穩(wěn)定，耐熱、耐酸，耐堿。蛋白質(zhì)變性劑可使之暫時失活。 RNase活性不需要輔助因子，因此EDTA對此酶無抑制作用。第62頁，共150頁。 (1)去除外源性RNase的污染空氣中的細菌、霉菌等微生

31、物都含有RNase，所以整個操作過程應(yīng)在比較清潔的環(huán)境中進行。因此有必要對操作場所的空氣進行消毒。操作者操作應(yīng)戴口罩和手套、帶帽子。玻璃器皿常規(guī)洗凈后，應(yīng)用0.1%DEPC(二乙基焦碳酸鹽)浸泡處理(37，2h)，再用滅菌去離子水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后250烘烤4h以上或200干烤過夜。第63頁，共150頁。塑料器材最好使用滅菌的一次性塑料用品。Eppendorf管，微量加樣吸頭最好是新的，使用前進行高壓消毒。所有溶液應(yīng)加DEPC至0.05-0.1%，室溫過夜，然后高壓消毒。以去除殘留的DEPC。RNA提取所用的酚，應(yīng)單獨配制和使用。配制飽和酚鹽溶液時，使用的水應(yīng)預先以DEPC處

32、理且高壓消毒，酚飽和以后，加入8-羥基喹啉至0.1%。8-羥喹啉不但抗氧化，而且有一定的RNA酶抑制作用。 第64頁，共150頁。DEPC的分子式為C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5二乙基焦碳酸鹽。是一種粘性液體，對核酸酶有很強的抑制作用。作用機制是通過與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。DEPC又能與RNA或單鏈DNA反應(yīng)，破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤，但它破壞單鏈核酸的濃度要比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100-1000倍。使用DEPC的一個原則是，在達到使用目的后，一般要高溫處理以便破壞除掉DEPC，使DEPC不與RNA接觸。 第65頁，共150頁。DEPC可與Tris發(fā)生反應(yīng)，分解成C

33、O2和乙醇，使pH值下降（所以要去除）配制Tris溶液時，先將所用水用DEPC處理高壓消毒配完Tris溶液后，再經(jīng)高壓消毒。DEPC與肝素聯(lián)合使用，增強使用效果。DEPC應(yīng)在4或液氮中保存，以防降解。第66頁，共150頁。 (2)抑制內(nèi)源性RNase的活性。細胞裂碎的同時，RNase釋放出來。原則上應(yīng)盡早去除細胞內(nèi)蛋白，加入RNase抑制劑，力爭在提取的起始階段對RNase活力進行有效地抑制。不同組織細胞中內(nèi)源性RNase的數(shù)量不同，胰腺、脾組織細胞中RNase的含量極為豐富，在對這些組織提取RNA時，更要使用強有力的RNase抑制劑。 第67頁，共150頁。抑制劑可分為以下幾類： 低特異性R

34、Nase抑制劑，如皂土、復合硅酸鹽、肝素、多胺等，因作用較弱，現(xiàn)已不大使用。去除蛋白質(zhì)物質(zhì) 蛋白質(zhì)變性劑，蛋白K、陰離子去污劑，常與RNA酶抑制劑聯(lián)合使用，以加強對RNase的抑制作用。凡能破壞蛋白質(zhì)的物質(zhì)，對RNase均有一定作用，因為酶本身就是蛋白質(zhì)。 第68頁，共150頁。a.酚、氯仿 這類有機溶劑不但能使核蛋白與核酸解聚(但不能破壞核酸)，而且對蛋白質(zhì)有變性作用。因而對酶(RNase)有抑制作用。酚不能完全抑制RNase活性，但酚一般都加入了8羥基喹啉(一種抗氧化劑，一種指示劑)，因而加強了對RNase的抑制效果。氯仿的抑制效果比較強，因此酚與氯仿常聯(lián)合使用。 蛋白酶K也能抑制RNas

35、e活性。有一種情況挺特殊，即該酶在12的SDS存在下，其活性反而會增加。第69頁，共150頁。 b.去污劑 包括SDS(十二烷基硫酸鈉)，十二烷酰肌氨酸鈉，脫氧膽酸鈉等陰離子去污劑。這些陰離子去污劑可使核酸與蛋白質(zhì)解聚，并可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上帶正電荷的基團結(jié)合，在高濃度KCl存在下，形成SDS蛋白質(zhì)復合物而沉淀。 c.解偶劑（胍類）鹽酸胍，異硫氰酸胍，作用非常強的一種蛋白變性劑，可完全破壞蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，從而使細胞結(jié)構(gòu)降解，核酸與核蛋白分離，所以又稱解偶劑。第70頁，共150頁。 RNase的特異抑制劑a. RNase阻抑蛋白(RNasin)，是一種酸性糖蛋白可與RNase以非共價鍵的形式結(jié)合，從

36、而抑制RNase活性， RNasin最好不與蛋白質(zhì)變性劑一同使用，因變性劑亦可破壞RNasin ，從而使其喪失作用。但可與二巰基乙醇一同使用，可增強RNasin的使用效果。b.氧釩核糖核苷復合物，這也是一種RNase特異性抑制劑，幾乎可完全抑制RNase的活性。 為達到完全、徹底抑制RNase活性的目的，常聯(lián)合使用，而且有些抑制劑(去除蛋白質(zhì)物質(zhì))一般有4種作用；破壞細胞膜，使核酸與蛋白質(zhì)分離，沉淀蛋白質(zhì)、抑制RNase活性。因此幾乎包括了RNA提取、分離、純化的所有目的。第71頁，共150頁。 2.RNA的分離、提取方法步驟： (1)創(chuàng)造一個無RNase環(huán)境； (2)組織或細胞的勻漿，同時得

37、加入RNase抑制劑 (3)裂解細胞； (4)去除蛋白、DNA等大分子物質(zhì)； (5)沉淀RNA； (6)漂洗； (7)溶解RNA。 第72頁，共150頁。 酚：使核酸與核蛋白分離、變性沉淀蛋 白質(zhì)，抑制RNase活性。異硫氰酸胍：破壞裂解細胞，使核酸與核蛋白分離，變性沉淀蛋白質(zhì)，同是具有很強的RNase抑制作用。這是一個關(guān)鍵的試劑，由于它是萬能的，所以實驗步驟變得簡單。Trizol試劑盒所提供的試劑：第73頁，共150頁。自己需要配制的試劑氯仿：蛋白質(zhì)變性作用，增強對RNase抑制作用。異丙醇：沉淀RNA。75乙醇：漂洗、去除鹽、殘留有機溶劑等雜質(zhì)。無RNase水或0.5%SDS溶液(后者較好

38、)(必須用DEPC處理)。第74頁，共150頁。 勻漿化 a.組織：取50-100mg組織放在勻漿管中，加1ml Trizol試劑，然后進行勻漿，此時裂解細胞和RNase抑制同時進行。 b.貼壁生長細胞：倒掉培養(yǎng)液，然后直接向培養(yǎng)瓶(皿)中加入Trizol試劑(按10cm2加1ml Trizol試劑計算加入量)。 c.懸浮生長細胞：離心收集細胞，然后加入Trizol試劑（按510106或1107細菌加入1ml比例計算加入量)。操作步驟第75頁，共150頁。兩相分離 將勻漿化的樣品在1530環(huán)境中放置5min，以便核酸蛋白復合物充分解聚。（加Trizol試劑之前，樣品一定要保持低溫，防止RNas

39、e 發(fā)揮作用，在研磨過程中可加液氮）然后按每1ml Trizol試劑加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿。蓋緊試管蓋，用手劇烈振蕩15秒，之后在1530條件保溫23min。離心：12000g離心15min，離心時溫度要控制在28。（12000g離心是一個關(guān)鍵步驟，也是該方法獨到之處，可將蛋白質(zhì)，DNA等大分子沉淀)。離心之后，就會形成三相：下層是紅色的酚和氯仿（含有蛋白質(zhì)和DNA）；中間層是白色的DNA和蛋白質(zhì)沉淀；上層是水相，RNA就在此層，水相大約占總體積的60第76頁，共150頁。 RNA沉淀 將水相轉(zhuǎn)移到一個新的試管中，并加入異丙醇混勻，加入量按每ml Trizol試劑加0.5ml異丙醇計

40、。在1530條件下，保溫10min。然后在28條件下，12000g離心10min，此時就會在管底或底部邊上出現(xiàn)RNA沉淀，離心之前，RNA沉淀通常看不見，離心之后常?？煽匆娔z樣沉淀。 RNA漂洗 移去上清液，加入75乙醇至少1ml，渦旋振動幾次，然后以7500g離心5min(溫度28)，又可形成RNA沉淀，并移去上清液。第77頁，共150頁。 重新溶解RNA 將RNA沉淀在空氣中放量510min，以便揮發(fā)掉殘留的乙醇。注意干燥時間不宜太長，以防RNA完全干燥。完全干燥的RNA很難溶解。最后用無RNase水或0.5SDS溶液溶解RNA，并用移液管吹打幾次，并在55 60保溫10min，以便使RN

41、A完全溶解。 第78頁，共150頁。判定純度和計算含量，用紫外分光光度計測量溶液的吸光度質(zhì)（A）。A260/280在1.61.8之間表明比較純凈，符合實驗要求。1OD值40g RNA,據(jù)此再計算RNA含量。第79頁，共150頁。 一般來講，該方法可從1mg組織中提取的RNA含量分別為：肝和脾為610g ；腎34g ，肌肉和腦為15g ，胎盤14g 。對培養(yǎng)的細胞來講，1106個上皮細胞中可提取815g ，成纖維細胞57g 。 用Trizol試劑盒法提取的RNA，基本上可滿足所有實驗的需要，如Northern blot，斑點雜交，mRNA分離、體外翻譯，分子克隆等。 該方法操作簡便，提取的RNA

42、完整，整個提取過程僅需1h，故現(xiàn)在廣泛使用。第80頁，共150頁。第三節(jié) 核酸分子雜交技術(shù) 第81頁，共150頁。 1.探針的概念：在化學及生物學意義上的探針(Probe)，是指能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用的分子，并可被特殊的方法所探知(檢測到)。所謂核酸分子探針則是指特定的已知核酸片段，并帶有標記物，能與互補核酸序列退火雜交，因此可以用于待測核酸樣品中特定基因順序的探測（可定性、定量）。(一)探針的概念、種類及其選擇、探針的標記第82頁，共150頁。2.探針的種類、選擇及特點種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探 針、寡核苷酸探針選擇：寡核苷酸探針 寡核苷酸探針是指人工合成的短

43、鏈核苷 酸片段，并帶有標記物特點：人為控制，雜交時間短，特異性高，可 以用于點突變檢測；缺點是靈敏度低 第83頁，共150頁。 設(shè)計寡核苷酸探針應(yīng)遵循的（以下）幾個原則： 探針長度：一般要求1050bP。過短則特異性降低，過長，則合成困難、雜交時間延長，亦會出現(xiàn)非特異性雜交。應(yīng)不短不長。 （一般20bp） G：C堿基對含量應(yīng)占4060；過少，則不易雜交，或雜交雙鏈不穩(wěn)定；過多，則會產(chǎn)生非特異性雜交，應(yīng)不多也不少。（一般AT、GC各占50%） 探針內(nèi)部的互補堿基對不應(yīng)大于4bP，否則會形成探針內(nèi)部的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)。 同一堿基的連續(xù)出現(xiàn)次數(shù)不應(yīng)超過4次。 探針設(shè)計完后，最好利用基因庫軟件進行分析，并

44、與已知的各種基因序列進行同源性比較，如果該探針與非目的基因序列有70以上的同源性，或連續(xù)有8個以上的堿基序列相同，則應(yīng)重新設(shè)計探針序列。第84頁，共150頁。3.探針的標記物與標記 標記物： 放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I 非放射性標記物：半抗原（生物素、地高辛）；配體；熒光素；化學發(fā)光物第85頁，共150頁。 根據(jù)待測核酸分子存在的部位不同，可分固相雜交（膜上印跡雜交、細胞原位雜交）和液相雜交。其中膜上印跡雜交應(yīng)用廣泛。 膜上印跡雜交是指將待測核酸序列片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標記的核酸探針進行雜交的過程。 （二）雜交第86頁，共150頁。 首先用

45、凝膠電泳方法將待測核酸片段分離，然后用印跡技術(shù)將分離的核酸片段轉(zhuǎn)移到特異的固相支持物上（轉(zhuǎn)移后的核酸片段將保持其原來的相對位置不變）。 再用標記的核酸探針與固相支持物上的核酸片段進行雜交。 最后洗去未雜交的游離的探針分子，通過放射自顯影等檢測方法顯示標記的探針的位置及量的多少。 概括起來，雜交主要包括三個步驟：印跡、雜交和檢測。膜上印跡雜交的基本操作流程第87頁，共150頁。1.印跡技術(shù) 印跡技術(shù)是指將待測核酸分子轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物上的方法。 印跡技術(shù)主要包括兩個關(guān)鍵因素：選擇良好的固相支持物；有效的轉(zhuǎn)移方法。 第88頁，共150頁。 固相支持物的選擇 具有良好的機械性能，如柔軟性好

46、，韌性強，以便操作 時不易損壞；具有較強的結(jié)合核酸分子的能力；與核酸分子結(jié)合后，應(yīng)不影響其與探針分子的雜交反應(yīng)；與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定、牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等操 作過程，而不會脫落或脫落極少；非特異性吸附較少，即使有，在洗膜時也易被洗脫掉。 第89頁，共150頁。硝酸纖維素濾膜尼龍膜化學活化膜濾紙其中前2種更為常用 目前常用的固相支持物第90頁，共150頁。硝酸纖維素濾膜 具有較強的吸附結(jié)合單鏈DNA和RNA的能力，特別是在高鹽濃度，其結(jié)合力可達80g/cm2100g/cm2。這種結(jié)合主要靠疏水作用。非特異性吸附核酸（探針）能力較弱，因此雜交信號本底值較低。 常用于Southern、North

47、ern斑點印跡及克隆篩選等實驗。第91頁，共150頁。缺點：與核酸的結(jié)合力較弱（因為是靠疏水作用），在雜交及洗脫的進程中，核酸會慢慢脫落，特別是在高溫情況下，更容易脫落，從而使雜交率下降。另外硝酸纖維素膜對于小分子量DNA片段結(jié)合力更弱，因此不太適合小分子DNA片段的雜交。硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆，特別是經(jīng)烘烤后更易破損，因此操作不方便，須特別小心。另外值得注意的是，硝酸纖維素膜與核酸的結(jié)合，有賴于高鹽濃度，而高鹽溶液又不適合于電轉(zhuǎn)印跡法（電流大，產(chǎn)熱）。第92頁，共150頁。尼龍膜 尼龍膜是目前較理想的一種核酸固相支持物，它有多種類型。有的尼龍膜未經(jīng)特殊處理，叫普通尼龍膜。有些則是經(jīng)過了正電荷基

48、團的修飾，又叫特殊尼龍膜。特殊尼龍膜帶有正電荷，核酸帶有負電荷，因此二者可靠靜電吸引牢固結(jié)合。因此尼龍膜對核酸的結(jié)合力要比硝酸纖維素膜強好多倍。特別是經(jīng)短波紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的帶正電荷的氨基相互交聯(lián)，從而使結(jié)合更加牢固。因此特別適用于小分子核酸片段的雜交。另外堿處理也可使核酸牢固地結(jié)合在尼龍膜上，因此使DNA的變性、吸附和固定可一步完成，特別適用于菌落原位印跡法。第93頁，共150頁。 尼龍膜質(zhì)地堅韌，不易損壞，操作方便，可 進行多次重復雜交。另外，在低離子強度條件下，也可與核酸牢固結(jié)合，因此適用于電轉(zhuǎn)印跡法。 缺點：由于結(jié)合力強，非特異性吸附較多，雜交信號本底較高，應(yīng)

49、注意封閉。第94頁，共150頁。 印跡方法 轉(zhuǎn)移方法不同，可分為斑點或狹縫印跡，即直接將核酸樣品點樣于固相支持物上；虹吸印跡法，利用毛細管虹吸作用，由轉(zhuǎn)移緩沖液帶動核酸分子轉(zhuǎn)移到固相支持物上；電轉(zhuǎn)印跡法，即利用電場力的作用將核酸帶到固相支持物上；真空轉(zhuǎn)移法，即利用真空抽濾作用，將核酸分子帶到固相支持物上。第95頁，共150頁。 根據(jù)要轉(zhuǎn)印核酸品種的不同，又可分為 Southern印跡法：是指將電泳分離的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。 Northern印跡法：是指RNA的印跡過程。第96頁，共150頁。 步驟： a.DNA分子經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切。酶切變成合適長度的DNA片段（根據(jù)實驗目的

50、而定，突變檢測則短，定性定量則長）。一般理想的是0.510Kb，因片段大小直接影響轉(zhuǎn)移效率。 b.在瓊脂糖凝膠中進行電泳。分離DNA片段，經(jīng)EB（溴化乙錠）染色后觀察DNA片段大小，并與DNA分子量標準參照物比較（Marker）。記錄或照像各DNA片段位置。尤其留意我們所感興趣的DNA片段。（瓊脂糖電泳常用于核酸，一般為水平板電泳 SDS電泳常用于蛋白質(zhì)，一般為垂直板電泳）Southern印跡法第97頁，共150頁。 c.將凝膠浸泡于適量的變性液中(1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室溫1h，其目的使DNA變性，即將雙鏈DNA變成單鏈DNA。如果DNA片段較大(大于15k

51、b)，可在變性前，用稀鹽酸（0.2mol/L）處理10min，脫嘌呤后，再進行堿變性處理，使之降解為小片段，因為片段的大小直接影響轉(zhuǎn)移速率。小于15Kb，轉(zhuǎn)移1h，大于15Kb則需要18h。 d.印跡(轉(zhuǎn)移)方法：虹吸印跡法，電轉(zhuǎn)印跡法和真空印跡法。其中常用的是后兩種，本教研室常用后一種，真空印跡法。不論采用哪種方法，均是將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上（硝酸纖維素膜、尼龍膜）。 e.固定，上一步驟雖然將DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，但結(jié)合還不牢固，需進一步固定。方法有：對于硝酸纖維膜，可真空下80烘烤2h(亦可無真空)，對尼龍膜還可用短波紫外線（波長254nm）照射幾分鐘進行固定，固定后方可進行

52、下一步的雜交。 第98頁，共150頁。 Northern印跡法是指將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。從而可用于雜交反應(yīng)以鑒定其中特定mRNA的豐度。 基本原理與Southern印跡相同，但RNA變性方法與DNA不同，不能用堿變性，因為堿導致RNA水解。RNA的變性常與電泳同時進行，常有3種方法，即聚乙醛和二甲基亞砜變性電泳；甲醛變性凝膠電泳和甲基氧化汞電泳，常用的是第二種。 Northern印跡法第99頁，共150頁。 RNA經(jīng)變性電泳后，一般可進行轉(zhuǎn)移（印跡），其印跡方法與Southern方法相同。但對含甲醛的凝膠，可用DEPC預處理水漂洗，以去除甲醛。如果凝膠較濃（大

53、于1）、較厚（如大于0.5cm）或待測RNA片段較大（大于2.5kb），可預先將凝膠放在0.05mol/L NaOH溶液中浸泡20分鐘，以便充分使RNA變性。然后DEPC處理過的水漂洗，最后用20SSC浸泡45min。 固定方法，常用真空烘烤（80）2h。第100頁，共150頁。2雜交（固液相雜交）技術(shù) DNA分子雜交實際上是雙鏈DNA的變性和具有同源序列的兩條單鏈的復性過程。RNA分子雜交也涉及變性和復性過程（這種變性是單鏈RNA分子內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開過程），其基本原理和方法與DNA雜交基本一致。因此以DNA分子雜交為例進行介紹。第101頁，共150頁。（1）變性 即打開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，變成

54、單鏈DNA的過程。 變性的方法有：加熱變性 有機溶劑變性 高濃度鹽變性 堿變性等 常用方法是加熱變性和堿變性。 DNA變性時，在260nm處的紫外吸光度增加，這種現(xiàn)象又稱增色效應(yīng)。當增色效應(yīng)達到最大值的50%時溫度，稱熔解溫度（melting temperature Tm值），Tm值表明DNA溶液中一半的DNA雙鏈已解離為單鏈，也就是說，Tm值反映了DNA變性的程度和難易，Tm值越大，變性越難，反之，變性容易。第102頁，共150頁。 大多數(shù)DNA的Tm值在8590左右。但Tm值并不是一個固定常數(shù)，常受許多因素影響。 DNA的堿基組成。A：T堿基對只有兩個氫鏈，而G：C堿基對有3個氫鍵。因此T

55、m值主要受G：C堿基對數(shù)量多少的影響，有一個經(jīng)驗公式為： Tm(G+C)%0.4169.3 溶液的離子強度。DNA鏈上的磷酸基團帶負電荷，它們之間的靜電具有相互排斥作用，可導致DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，比如：在無鹽的水中，DNA在室溫條件下就會變性，而加入鹽后，正電荷離子可以封閉磷酸基團的負電荷，使DNA雙鏈的穩(wěn)定性增加，Tm值亦會升高。第103頁，共150頁。 pH值，pH值在59之間范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯，即DNA雙鏈比較穩(wěn)定，在高pH值情況下，可使堿基失去形成氫鍵的能力。當pH值大于11.3時，所有氫鍵均被破壞，DNA完全變性。這就是堿變性的原理。 變性劑：變性劑可以干擾堿堆積力和氫鍵的

56、形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑是甲酰胺和脲。通常用50的甲酰胺可以使Tm值降低30。 第104頁，共150頁。（2）復性 變性DNA的兩條互補單鏈，或兩條具有同源性的單鏈核酸重新締合成雙鏈的過程，稱為復性或退火。 復性并不是變性反應(yīng)的一個簡單逆反應(yīng)過程。復性的過程是相當復雜的。變性過程可以在一個極短的時間內(nèi)完成（幾秒鐘），而復性則需要相對較長的時間才能完成。復性的時間與碰撞機率或有效配對有關(guān)。分子碰撞機率越大，復性速度越快，一開始往往錯誤碰撞，只有正確配對才是復性的開始。如果使熱變性的DNA溶液迅速冷卻，則只能形成一些不規(guī)則的堿基對，而不會完全恢復DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。要想使變性DNA完全恢

57、復天然的雙鏈結(jié)構(gòu)，則要在低于Tm值25的溫度下維持相當長的時間才能完成。 第105頁，共150頁。 復性的（速度）過程要受到許多因素的影響。 DNA的濃度：DNA濃度直接影響到DNA單鏈間碰撞的機率，濃度越大、碰撞機率越大，復性速度越快。 DNA的分子量：大分子量的DNA擴散速度較慢，碰撞機率較少，同時又很難形成正確配對，因此復性速度較慢；但一旦復性，又難于變性。 溫度：溫度過高，有利于DNA變性而不利于復性；而溫度過低，碰撞機率減少，一旦形成局部錯誤配對，又不易解離，難以繼續(xù)尋找正確配對，因而使復性速度降低；適宜的溫度是較Tm值低1525。 第106頁，共150頁。 離子強度：離子強度過低，

58、不利于復性。 pH值：pH值在59范圍內(nèi)，不影響復性速度，過低或過高則影響。 DNA分子的復雜性：DNA總量一定時，基因組越復雜，其中特定順序的拷貝數(shù)就越少，互補順序的濃度就越低，因而復性反應(yīng)速度越慢。第107頁，共150頁。（3）雜交體系的建立要考慮以下幾因素 DNA濃度：DNA濃度越高，復性速度越快。其方法有：加入足夠的DNA；盡量減少雜交的體積，一般以每平方厘米濾膜面積加50100l雜交液為宜。 DNA探針的長度：在雜交過程中，待測DNA固定在膜上，只有探針可以自由擴散，探針越長，擴散越慢，變性越慢。因此探針的長度不宜過長，一般以1050bp（一般探針20bp）。第108頁，共150頁。

59、 離子強度：離子強度對變性影響較大。一般常用5或6SSC（1SSC為0.15mol/L Nacl和0.015mol檸檬酸鈉）。 溫度：溫度對于雜交（復性）反應(yīng)的快慢和洗膜時去掉非特異雜交是至關(guān)重要的因素。 一般認為雜交溫度為：68（不含甲酰胺（作用：降低Tm值）；當含50甲酰胺時，在42進行雜交。 洗膜溫度一般認為5565。 對于寡核苷酸探針的雜交溫度，應(yīng)根據(jù)下列公式推算：Tm=4G：C對數(shù)量2A：T對數(shù)量。而雜交溫度一般比Tm值低5，即55。 Tm值的推算：與G：C對數(shù)量，離子強度，變性劑等有關(guān)。第109頁，共150頁。 雜交時間：一般應(yīng)為CoT1/2的13。 Yz Yz 小時/Cot1/2

60、 510X 510X Co單鏈DNA濃度，t1/2反應(yīng)一半時的時間，Y為探針DNA的復雜性，即片段大?。↘b），Z為雜交體系的體積(ml)。經(jīng)驗雜交時間816h，過夜。第110頁，共150頁。 減少或抑制非特性雜交。一般在雜交前先進行預雜交，以便將非特異性DNA位點封閉，同時也將膜上非特異性吸附位點封閉。采用鮭魚精子DNA（Salmon Sperm DNA）或小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA）封閉DNA非特異位點；采用Dehardt氏液（含聚蔗糖400，聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白），除封閉DNA非特異位點外，更主要封閉膜上非特異吸附位點。近年來采用脫脂奶粉代替Denhardt氏