熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FERT)課件

1、陳 同 生華南師范大學信息光電子科技學院熒光共振能量轉(zhuǎn)移Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)分子能級與熒光S0S1T1hn0hn1hn22. 熒光（Fluorescence)：當處于基態(tài)的分子吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即返回基態(tài)并以光的形式釋放能量，這種光稱為熒光。 4. 激發(fā)(Excitation, Ex)和發(fā)射(Emission, Em)光譜（Spectra):1. 能級（ Energy Level）：原子的可能狀態(tài)是不連續(xù)的，因此各狀態(tài)對應能量也是不連續(xù)的。包含電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動。3. 磷光（Phosphorescence）:

2、分子從激發(fā)三線態(tài)返回基態(tài)以光的形式釋放能量。CFPEx. 440nmEx. 470nmEm. 470nmYFPEm. 535nm熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象3. FRET現(xiàn)象的特征: 選擇性激發(fā)供體,卻能檢測到受體發(fā)射的熒光1. 供體(Donor, D)Donor2. 受體(Acceptor, A)AcceptorFRET 原理(Principle)FRET的條件發(fā)生FRET需要三個條件：1、供體分子的發(fā)射光譜和受體分子的吸收光譜必須有顯著的重迭，一般大于 30；2、供體分子和受體分子間的距離必須在 1 10 nm 之間. D和A間的FRET 效率： 3、供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩與受體分子的

3、吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量必須滿足一定的條件R0: E=50%時供體和受體分子間的距離.對于特定的供體受體對是常數(shù);R: 供體和受體分子間的距離.E: FRET效率. 對于R特別靈敏.舉例: 假設(shè) R0=5nm, 1） R=10nm, E=1.5%2） R=5nm, E=50%3） R=6nm, E=25% 450 500 550 600l (nm)D EmA Ex1)蛋白分子的共定位;2)蛋白分子聚合體;3)轉(zhuǎn)錄機制;4)轉(zhuǎn)換途徑;5)分子運動;6)蛋白折疊等生物學問題.FRET的應用通過 FRET 技術(shù)可以獲得有關(guān)兩個蛋白分子之間相互作用的空間信息。常用于解決如下問題:LaserLase

4、rDAFRET技術(shù)應用一:檢測兩個發(fā)光分子間的重合與共定位熒光標記利用FRET技術(shù)檢測不發(fā)光分子間相互作用的策略FRET技術(shù)應用二: 檢測分子間的相互作用LaserLaserFRET技術(shù)應用三: 檢測分子的折疊與構(gòu)象變化FRET技術(shù)應用舉例：細胞內(nèi)鈣離子濃度的實時測量Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887(b) BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED在FRET實驗中經(jīng)常使用的供體-受體熒光分子對2. 綠色熒光蛋白類(Green Fluorescent Proteins, GFPs)1.染料類(Dy

5、e)FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5參考閱讀文獻Jonathan D. Violin,et al., A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899909Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395Rajesh B S. Fluorescence

6、 resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629633Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 1499715002Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599611 Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:13951398 思 考 題2.你認為FRET技術(shù)特別適合什