細(xì)胞調(diào)亡專題系列講座

1、細(xì)胞調(diào)亡專題系列講座生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，不但依賴細(xì)胞增殖和分化，也依賴于細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱編程性死亡(PCD;Programmed Cell Death)，是生物界重要的生命現(xiàn)象之一。 細(xì)胞凋亡是近年來生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的一個熱點。凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型 ，它還具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機制。對凋亡的研究不僅有助于對疾病過程中細(xì)胞死亡及其機制的深入闡明，而且將導(dǎo)致疾病新療法的問世。一:概述1:細(xì)胞凋亡的研究歷史NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 2 | JULY 2001 | 545VOG

2、T, C. Untersuchungen uber die Entwicklungsgeschichte derGeburtshelferkroete (Alytes obstetricians). Solothurn, Switzerland:Jent & Gassman, 1842.Flemming, W. ber die bildung von richtungsfiguren insugethiereiern beim untergang graafscher follikel. Arch.Anat. Physiol. 221244 (1885).Terre, L. Contribut

3、ion ltude de lhistolyse et de lhistognse du tissu musculaire chez labeille. C.R.Soc. Biol. (IIe Srie) 51, 896898 (1889).Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H. & Currie, A. R. Apoptosis: abasic biological phenomenon with wide-rangingimplications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 26, 239257(1972).凋亡一詞是1972年由澳大

4、利亞組織病理學(xué)家John Kerr首先提出的，本意是花瓣或樹葉從花或樹上掉落或凋落(dropping off, falling off)。1965年Kerr等結(jié)扎大鼠門脈左支，數(shù)小時內(nèi)大鼠肝左葉開始出現(xiàn)片狀壞死，但周邊部分仍然由肝動脈供血而存活，幾周后存活的細(xì)胞開始變小，變圓，皺縮，細(xì)胞膜將胞漿及斷裂的染色質(zhì)分割包圍成致密的顆粒，以后被周圍存活的細(xì)胞吞噬分解，在細(xì)胞死亡過程中始終保持細(xì)胞膜的完整性直到被吞噬消化為止，而且并未在局部發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤。終于在1972年將這種 細(xì)胞死亡現(xiàn)象歸為一種嶄新的細(xì)胞死亡類型即凋亡。2:細(xì)胞凋亡的概念細(xì)胞凋亡:細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是指細(xì)胞基因調(diào)控的一種

5、自主性的自殺現(xiàn)象?；蛘哒f細(xì)胞凋亡是在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自我結(jié)束生命的死亡方式。由于這種死亡方 式是由基因調(diào)控的死亡過程，因此又稱之為程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death)。 3:細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別3:細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別J Mol Med (1999) 77:824833細(xì)胞壞死:胞膜通透性增加，細(xì)胞外形發(fā)生不規(guī)變化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張；核染色質(zhì)不規(guī)則位移；線粒體及胞核腫脹；溶酶體破壞；胞膜破裂胞漿外溢； 被巨噬細(xì)胞吞噬。細(xì)胞壞死引起周圍炎癥反應(yīng)。凋亡細(xì)胞形態(tài)變化：細(xì)胞變圓，與鄰周細(xì)胞脫離；胞膜表面微絨毛減少或者消失；核質(zhì)固縮(Condensati

6、on)，邊移(Margination)；胞漿堅實(Compactness)；細(xì)胞器集中(Squeeze)；胞膜芽生(Bud)；凋亡小體 (Apoptotic-body)形成，最后被巨噬細(xì)胞或者鄰近吞噬細(xì)胞吞噬，或排入體腔例如腺腔及 血管腔等。這種死亡過程中，不發(fā)生溶酶體，線粒體及胞膜的破裂，沒有內(nèi)涵物的外泄，故不引起炎癥反應(yīng)及周圍組織的次級損傷。二:細(xì)胞凋亡的特征1:形態(tài)學(xué)特征 二:細(xì)胞凋亡的特征1:形態(tài)學(xué)特征凋亡細(xì)胞形態(tài)變化為：細(xì)胞變圓與鄰周細(xì)胞脫離；胞膜表面微絨毛減少或者消失；核質(zhì)固縮(Condensation)，邊移(Margination)；胞漿堅實(Compactness)；細(xì)胞器集

7、中(Squeeze)；胞膜芽生(Bud)；凋亡小體 (Apoptotic-body)形成，最后被巨噬細(xì)胞或者鄰近吞噬細(xì)胞吞噬，或排入體腔例如腺腔及 血管腔等。這種死亡過程中，不發(fā)生溶酶體，線粒體及胞膜的破裂，沒有內(nèi)涵物的外泄，故不引起炎癥反應(yīng)及周圍組織的次級損傷。2:細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)特征J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563（1）

8、鈣離子和蛋白激酶改變：細(xì)胞內(nèi)Ca2+的堆積和重 新分布，細(xì)胞核內(nèi)Ca2+的增多， 激活核酸內(nèi)切酶 的活性，蛋白激酶C在不同細(xì)胞類別和不同周期活 性表現(xiàn)不一。（2）核酸內(nèi)切酶激活把DNA內(nèi)切成180堿基對倍數(shù)的核 苷酸片段，呈梯狀電泳現(xiàn)象。（3）組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的積累并激活。（4）細(xì)胞骨架如肌動蛋白的變化。（5）細(xì)胞表面糖鏈、植物血凝素與玻連蛋白受體增加 ，磷脂酰絲氨酸的外露改變細(xì)胞表面的生化特性。生物化學(xué)特征NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 1 | NOVEMBER 2000 | 1253:凋亡的階段J Clin Pathol: M

9、ol Pathol 2000;53:5563(1)信號傳遞包括環(huán)境因素和體內(nèi)因素 通過受體介導(dǎo) 稱為死亡受體（death receptors, DR）， 配體（death ligands ） 結(jié)合激活死亡蛋白酶系（death caspase） 死亡受體有腫瘤壞死因子受體基因家族，CD95（Fas或Apol）和DR（或APO）系列 腫瘤壞死因子受體基因家族，CD95（Fas或Apol）和DR（或APO）。 死亡區(qū)域（death domain），參與激發(fā)蛋白酶系列和細(xì)胞產(chǎn)生凋亡調(diào)節(jié)機制。 (1)信號傳遞(2):中央調(diào)控線粒體包括Caspases激活因子的釋放，如細(xì)胞色素C(cytochrome C

10、,Cyt C)、電子傳遞鏈的改變、線粒體膜電位( m)的喪失、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀的改變、Bcl-2家族促進(jìn)和抑制凋亡蛋白的參與等。線粒體膜通透性的改變(permeability transition,PT)線粒體內(nèi)膜對細(xì)胞質(zhì)中分子量1 500 kD，如質(zhì)子、Ca2+、谷胱甘肽等通透性突然增加(可以通過OD540的降低或放射性標(biāo)記物如蔗糖、Ca2+等檢測出來)。PT孔道蛋白具有感受器的功能。NADH/NAD+、NADPH2/NADP+、pH值、二價陽離子的濃度、腺苷酸的濃度，這些參數(shù)的改變均能引起PT。細(xì)胞色素C在凋亡中作用Cyt C是一種水溶性蛋白，位于線粒體內(nèi)外膜之間，并與內(nèi)膜松弛相連。在胞質(zhì)

11、核糖體上合成去血紅素Cyt C，經(jīng)專門途徑無需信號肽、電化學(xué)勢和一般的蛋白轉(zhuǎn)運機制，進(jìn)入線粒體內(nèi)外膜之間，在得到一個血紅素分子后，成為完整的Cyt C,并帶上正電荷而不能通過外膜。 Apaf-1(apoptosis protease-activating factor 1)與Apaf-2(即釋放到胞質(zhì)中的Cyt C)及Apaf-3(Caspase 9)結(jié)合促進(jìn)Caspase-3激活。Bcl-2對線粒體功能的調(diào)控抑制凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-XL、Mc11、Bfe1、A1等和促凋亡蛋白：Bax、Bcl-XS、Bad、Bak、Bik等，它們分布在線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。 Bcl-2抑制P

12、T的機理是阻止一些小分子如Ca2+從基質(zhì)中釋放以及AIF從內(nèi)外膜之間釋放到胞質(zhì)中。 細(xì)胞色素C在凋亡中作用Bcl-2對線粒體功能的調(diào)控（3）細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變：形態(tài)變化：細(xì)胞皺縮，核致密，微絨毛消失。 生化特點：多種酶活化及細(xì)胞核的改變。 caspases活化的DNA酶（CAD）進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)使染色體的DNA斷裂引起細(xì)胞死亡。CAD的抑制因子ICAD拮抗CAD。 三：凋亡的分子機制1：細(xì)胞凋亡的觸發(fā)因子 物理因素 ：射線，紫外線，加熱等。 糖皮質(zhì)激素； 細(xì)胞毒藥物：放射菌素，氨甲喋呤，順鉑， 阿糖胞苷等。 受體：APO-1/FAS抗體的受體，TCR-CD3特異抗體 的受體； 引起cAMP水平升高的化合

13、物：cAMP及其衍生物， 霍亂毒素，茶堿 細(xì)胞因子TNF-及TGF-等。 細(xì)胞凋亡的負(fù)性觸 發(fā)因子主要是一些生長因子包括NGF，CSF(G-CSF， GM-CSF)，IL(IL-2 ，IL-3，IL-4，IL-6)等。三：凋亡的分子機制1：細(xì)胞凋亡的觸發(fā)因子2：凋亡基因Bcl-2(B cell lymphoma/leuklemia-2，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2)基因家族。包括抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2、Bcl-X2、BHRF1和Bak及參與細(xì)胞存活調(diào)節(jié)的Mcl-1、A1和LMW5-HL等。人Bcl-2基因是從與濾泡性淋巴瘤相關(guān)的t(1418)染色體易位的斷裂點部位克隆到。Bcl-2從其正常定位(

14、18q-21)移位于14q-32的免疫球蛋白重鏈并列的位置。導(dǎo)致在淋巴瘤細(xì)胞中該基因的轉(zhuǎn)錄激活以及26kD Bcl-2 蛋白的過度表達(dá)。Bcl-2基因及其表達(dá)蛋白可抑制多種組織細(xì)胞的凋亡和延長細(xì)胞壽命，故將其稱為凋亡抑制其因。Bcl-2蛋日是一種與細(xì)胞器特別是線粒體膜關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定蛋白，它主要位于線粒體外膜、核被膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。高濃度Bcl-2蛋白抑制發(fā)生凋亡細(xì)胞內(nèi)質(zhì)中鈣離子的釋放。Bcl-2是通過直接或間接地與細(xì)胞信號傳遞蛋白(如P53蛋白)作用而調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bcl-2通過抗氧化作用或抑制氧自由基的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2有44同源并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)Bcl-X。Bcl-X分2種：B

15、cl-XL，Bcl-XS。Bcl-XL蛋白可抑制細(xì)胞凋亡，其功能相似于Bcl-2蛋白而較弱。Bcl-Xs的作用與Bcl-2、Bcl-XL相反。Bcl-Xs可能是作為Bcl-2的結(jié)構(gòu)抑制子，通過對其下游的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)子的作用而抑制Bcl-2的功能。 Bax蛋白，與Bcl-2有21同源性。Bax蛋白有對抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用。Bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例是決定對細(xì)胞凋亡抑制作用強弱的關(guān)鍵因素，Bcl-2Bax，細(xì)胞趨于存活；BaxBcl-2，細(xì)胞趨于凋亡。因此認(rèn)為Bax是極重要的促細(xì)胞凋亡基因之一。Bak是新近發(fā)現(xiàn)的基因，對Bcl-2有抑制作用，類似Bak/Bcl-Xs。Bak蛋白對

16、Bcl-2的抑制作用可能是通過其它蛋白質(zhì)信號傳遞途徑中介。Bak蛋白與Bcl-XL或E1B19K蛋白形成異源二聚體。P53 P53腫瘤抑制基因正常時分為野生型與突變型兩種，野生型P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，突變型P53抑制細(xì)胞凋亡。P53是一種核內(nèi)的磷酸蛋白，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。AJP November 2000, Vol. 157, No. 5GENES & DEVELOPMENT 13:18991911 1999C-Myc C-Myc原癌基因既有刺激細(xì)胞增生，亦有刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。Myc蛋白與Max蛋白形成二聚體作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因和誘導(dǎo)凋亡的基因。細(xì)胞在C-Myc基因作用

17、下出現(xiàn)哪種結(jié)果，取決于細(xì)胞接受的外來信號。C-Myc基因的作用機制尚不清楚。目前認(rèn)為，C-Myc可能直接參與啟動凋亡，當(dāng)Myc誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞并不需要進(jìn)入增殖周期狀態(tài)。 ICE(interleukin-1- converting enzyme，白介素1轉(zhuǎn)換酶)基因家族 該家族成員有Ced-3、ICE、Nedd-2/ICH-1、CPP32、TX等。ICE基因家族編碼蛋白酶在凋亡中發(fā)揮重要作用的蛋白酶，其作用底物有PARPpoly(ADP-ribose)polymerase，多聚ADP核糖聚合酶，U1-70kD、DNA-PK(DNA蛋白激酶)、HH1(H1組蛋白)、Lamins(層粘蛋白)、F

18、odrin(骨架蛋白)、actins(肌動蛋白)、PKC-(蛋白激酶C-)等。TXICECPP32死亡底物PARP早期凋亡事件。TXICECPP32死亡底物PARP早期凋亡事件。Bax是一個可溶性蛋白分子，主要位于細(xì)胞漿中，但當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，它從胞漿移到線粒體并與線粒體膜相結(jié)合。位于線粒體的Bcl-2確能與Bax相互作用，而后者也必須在線粒上發(fā)揮其誘導(dǎo)凋亡的作用。3:caspases蛋白酶:凋亡是一種進(jìn)化過程中保留下來的細(xì)胞自殺，發(fā)生的機制是蛋白溶解系統(tǒng)活化，涉及一組半胱氨酸蛋白酶家族，稱為caspases。Caspase可譯為胱冬肽酶家族，是一組與線蟲CED-3同源的調(diào)控哺乳動物細(xì)胞凋亡的蛋白

19、酶家族。蛋白酶前體可在天冬氨酸位點上被切斷成3部份，H2N-端是抑制區(qū)域被移去，另一端COOH-端斷裂成1大1小亞單位稱為死亡區(qū)域，2大2小亞單位結(jié)合成活化酶，可以作用下游效應(yīng)caspases，這種級聯(lián)反應(yīng)稱為caspases cascade。這種連鎖反應(yīng)的進(jìn)行有賴于caspases的調(diào)節(jié)蛋白、輔助因子、反饋關(guān)系和閾限等控制。如凋亡外界信號只作用于caspases前體（procaspases），前體可活化蛋白酶激發(fā)因子（initiator of caspases），激發(fā)因子可以活化蛋白酶效應(yīng)因子（effector of caspases），然后作用于底物蛋白，如核層蛋白（laminine），P

20、ARP（poly-ADP-ribos polymerase），DNA碎裂因子（DFF-45）和gelsolin等，蛋白分解引起凋亡。體內(nèi)合成時均以酶原（相對分子質(zhì)量30 00050 000）形式存在，包括3個功能區(qū):N端區(qū)、大亞單位（約20 000）、小亞單位（約10 000）；被激活的過程相似，即通過功能區(qū)間特異位點的蛋白酶解，繼而以大小亞單位形式形成異源二聚體。 3:caspases蛋白酶CHEMBIOCHEM 2001, 2, 20 29Progress in Neurobiology 62 (2000) 215249CHEMBIOCHEM 2001, 2, 20 29四:細(xì)胞凋亡的調(diào)控

21、J. Clin. Invest. 109Fas and FaslIGF-INATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 2 | APRIL 2002 | 277J. Clin. Invest. 109NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 3 | FEBRUARY 2002 | 115DRUG DEVELOPMENT RESEARCH 52:505507 (2001)Biochemical and Biophysical Research Communications 279, 307312 (2000)Progress in Neurobiology 62 (2000) 215249Nature Immunology 3, 221 - 227 (2002) Cell, Vol. 108, 153164, January 25, 2002, Copyright .2002 by Cell PressGrowth factorNATURE CELL BIOLOGY VOL 4 JUNE 2002Cancer and ApoptosisProgress in Neurobiology 62 (20