不同組織取材檢測胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移的價值

1、不同組織取材檢測胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移的價值 陳國強(qiáng)1 唐仕明2【摘 要】 目的 探討大網(wǎng)膜、小網(wǎng)膜及盆腹膜不同組織取材在胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移檢測中的價值。方法 應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR檢測36例胃癌患者大網(wǎng)膜、小網(wǎng)膜及盆腹膜CK20mRNA，另以6例胃癌組織作為陽性對照，6例經(jīng)腹手術(shù)非胃癌患者同類標(biāo)本作為陰性對照，通過統(tǒng)計學(xué)分析研究三種組織取材方式在胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移檢測中的應(yīng)用價值。結(jié)果 36例胃癌患者中，大網(wǎng)膜檢測陽性率為41.62%（15/36）、小網(wǎng)膜檢測陽性率為13.89%（5/36）、盆腹膜檢測陽性率為36.11%（13/36）。大網(wǎng)膜檢測陽性率高于小網(wǎng)膜和盆腹膜，但與盆腹膜差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2、6例胃癌組織檢測均為陽性，6例經(jīng)腹手術(shù)非胃癌患者同類標(biāo)本檢測均為陰性。結(jié)論 大網(wǎng)膜檢測胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移陽性率高于盆腹膜和小網(wǎng)膜，且取材方便，無副損傷及并發(fā)癥，可作為組織取材首選方式?！娟P(guān)鍵詞】 組織取材 檢測 胃癌 腹膜微轉(zhuǎn)移 The Value of Detecting Gastric Cancer Peritonum Micrometastasis with Different TissueChenGuoqiang,TangShimingAbstract Objective: To explore value of great omentum,small omentum and basin

3、peritonum in gastric cancer peritonum micrometastasis detection. Methods: Fluorescence quantitative RT-PCR was used to detect CK20mRNA in great omentum small omentum and basin peritonum 0f 36 gastric cancer patients , 6 cancer tissue were detcted as positive comparision and 6 benign disease abdomina

4、l surgery patients simillar tissue were taken as negative comparision.Stastical method was used to analyze all results . Results: In 36 cases,CK20mRNA positive rate of great omentum was 41.62% (15/36), small omentum was 13.89% (5/36) and basin peritonum was 36.11% (13/ 36). The positive rate of grea

5、t omentum of was higher than small omentum and basin peritonum,but differance between great omentum and basin peritonum had no stastical signfence .And 6 cancer tissue ware all positive while 6 benign disease abdominal surgery patients simillar tissue were all negative .Conclusion: Great omentum pos

6、tive rate was higher than small omentum and basin peritonum in detecting gastric cancer peritonum micrometastasis ,it was collected conviently and without vice-damage ,so it may be first choice of tissue sellection. Key words Different Tissue; Detecting; Gastric Cancer; Peritonum Micrometastasis 胃癌腹

7、膜微轉(zhuǎn)移檢測是胃癌微轉(zhuǎn)移檢測研究的熱點，取材方式以腹腔沖洗液為主；組織取材較多采用盆腹膜，膈腹膜和大網(wǎng)膜有少量報道。而不同組織取材方式的對比研究尚少見報道，我們收集我院2009年8月至2010年3月36例手術(shù)治療胃癌患者的大網(wǎng)膜、小網(wǎng)膜及盆腹膜，通過檢測微轉(zhuǎn)移發(fā)生情況探討三種取材方式的應(yīng)用價值，以期尋找一種更好的取材方式。資料與方法1.1病例資料 本組36例，男22例，女14例，年齡48-78歲，平均年齡63歲。均無肉眼腹膜轉(zhuǎn)移，術(shù)后病理證實漿膜浸潤13例，未浸潤漿膜23例，均有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；低、中分化腺癌20例，高分化腺癌10例。另取6例非腫瘤開腹手術(shù)患者同類標(biāo)本作為陰性對照，排除假陽性；3例

8、胃癌組織標(biāo)本做陽性對照，排除假陰性。1.2實驗室資料 7300 Real-Time PCR Systems擴(kuò)增儀：購自美國Applied Biosystems 公司， MG96G梯度PCR儀：購自杭州郎基科學(xué)儀器有限公司。TaKaRa試劑盒：RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒（購自大連寶生物工程有限公司）。引物及序列：內(nèi)參照基因-actinmRNA,引物序列：（上游）5-CAG AGC CTC GCC TTT GCC-3 ，（下游）5-ATG CCG GAG CCG TTG TCG-3；目的基因CK20mRNA引物序列：（上游）5-TTT GAT GAC CTA CAT A-

9、3，（下游）5-CTT CAT ACT TCT GCC TCA TTT C-3（由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成提供）。1.3 方法 1.3.1 標(biāo)本收集 開腹后切口徹底止血，探查腹腔轉(zhuǎn)移情況，有肉眼腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)本棄用；. 沿網(wǎng)膜血管1、2級分支切取小塊網(wǎng)膜組織，距病灶最近處切取小塊小網(wǎng)膜，盆底腹膜鉗夾提起切取小塊組織，標(biāo)本分別肝素鈉生理鹽水（125mg加入250ml生理鹽水稀釋）漂洗去除血液，分別裝入凍存管并標(biāo)記后液氮凍存；. 胃癌大體標(biāo)本離體后在癌灶中心外緣至病灶周邊之間切取小塊胃癌組織，液氮凍存；非胃癌陰性對照組織開腹止血后按上述方法切取并處理，分別裝入凍存管并標(biāo)記后液氮凍存。1.3.2

10、 實驗方法 組織懸液制備采用冷凍研磨法，提取所有樣本總RNA后-80冰箱保存。引物驗證符合實驗要求后，陰性對照和陽性對照在同一體系檢測，取濃度和純度均較高的胃癌組織作為標(biāo)準(zhǔn)品，以相對值最高的胃癌組織樣本作為樣本檢測的標(biāo)準(zhǔn)品。樣本檢測分3次完成，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋104-108分裝2管作為主副管繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。定量方法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量，結(jié)合微轉(zhuǎn)移定義，參照國際通用RNA質(zhì)量與細(xì)胞數(shù)量的對應(yīng)關(guān)系，以104稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品（近似于10個癌細(xì)胞總RNA）檢測值作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)（系統(tǒng)檢測值為1），將內(nèi)參基因檢測值轉(zhuǎn)換為0-2數(shù)量級，相對值1為結(jié)果陽性。具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 因樣本含量4

11、0，組間差異比較采用Fisher確切概率法。2. 結(jié)果 2.1 三種組織取材檢測陽性率 2.2 大網(wǎng)膜標(biāo)本擴(kuò)增曲線 陽性 陰性 P 陽性率大網(wǎng)膜（a） 15 21 0.405a-b 41.62% 盆腹膜（b） 13 23 0.028b-c 36.11%小網(wǎng)膜（c） 5 31 0.008a-c 13.89%3.討論 胃癌是我國常見腫瘤，發(fā)病率和死亡率均占據(jù)惡性腫瘤首位。腹膜轉(zhuǎn)移是進(jìn)展期胃癌主要死因，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的及時診斷并進(jìn)行針對性的治療是改善胃癌整體療效的關(guān)鍵1。 胃癌腹膜轉(zhuǎn)移診斷的主要取材方式是腹腔沖洗液，日本胃癌處理規(guī)約將腹腔沖洗液癌細(xì)胞的存在作為胃癌臨床分期的獨立指標(biāo)，多因素研究也表明腹

12、腔游離癌細(xì)胞的存在是影響胃癌患者預(yù)后的獨立因素2。但多數(shù)研究表明，腹腔游離癌細(xì)胞的存在并不一定發(fā)展為腹膜轉(zhuǎn)移，因此，腹腔游離癌細(xì)胞檢測對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移僅具有預(yù)測意義。組織取材檢測相關(guān)報道相對較少，主要取材方式是盆腹膜，依據(jù)在于重力作用下腹腔癌細(xì)胞隨腹腔液一起具有向盆腔聚集的趨勢，故此處更易檢測到腹膜轉(zhuǎn)移。大網(wǎng)膜及膈腹膜取材也有少量報道。組織取材作為檢測標(biāo)本的意義在于對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移具有確定診斷價值，對于胃癌臨床分期及治療方案的判斷能提供更精確的依據(jù)。動物實驗表明，腹膜乳斑缺乏連續(xù)的間皮細(xì)胞并表達(dá)粘附相關(guān)的媒介分子，是腹腔惡性腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移的優(yōu)先選擇性位點，大網(wǎng)膜是乳斑含量最豐富的部位，因此腹腔惡性腫

13、瘤常首先轉(zhuǎn)移至大網(wǎng)膜3。但在人體，這種現(xiàn)象尚少見專門的研究報道。多數(shù)胃癌位于小彎測，小網(wǎng)膜是距癌灶最近的腹膜部分。所以，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移較早發(fā)生的部位存在三種可能：乳斑含量最多的大網(wǎng)膜，站立時位置最低的盆腹膜，或距腫瘤最近的小網(wǎng)膜。我們的研究以上述三種組織作為檢測對象，采用靈敏度最高的實時熒光定量RT-PCR，以組織特異性較好的CK20mRNA為標(biāo)記物，考察癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況。我們的研究表明，大網(wǎng)膜檢測陽性率為41.62%，高于盆腹膜和小網(wǎng)膜。Sakakura 等4利用RT-PCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)胃癌大網(wǎng)膜乳斑上CEA mRNA 陽性率為53. 3 % ,而同時檢測腹腔沖洗液CEA mRNA 的表達(dá)率

14、僅為33. 3 % ,認(rèn)為此方法對預(yù)測腹膜轉(zhuǎn)移較腹腔沖洗液及傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)為優(yōu)。Kodera 等5以CEA mRNA 為檢測靶點,利用實時RT-PCR 技術(shù)檢測90 例胃癌患者網(wǎng)膜組織及腹腔沖洗液,并進(jìn)行傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查,3 種檢測方法的靈敏度、特異度分別為46 %和90 %、77 %和94 %、31 %和100 %。認(rèn)為以網(wǎng)膜為檢測對象查找癌細(xì)胞是一種有前途的新方法。我們的研究與上述報道相似。盡管在本研究中，大網(wǎng)膜與盆腹膜陽性率差異不顯著（P0.05），但大網(wǎng)膜作為胃癌術(shù)中常規(guī)切除的組織，不僅取材方便，而且不會引起副損傷及出血等并發(fā)癥，可作為組織取材檢測胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的首選方式。不過，大網(wǎng)膜乳斑主要

15、分布于網(wǎng)膜1、2級分支血管附近6，此處取材無法完全避免血液污染。但胃癌患者血液中即使存在微轉(zhuǎn)移，含量也較低，如果同時進(jìn)行血液樣本檢測，則能更好排除假陽性。另外，由于納入病例較少，我們未進(jìn)行大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移與臨床病理因素關(guān)系的分析，需進(jìn)行更廣泛的研究以得出更科學(xué)的結(jié)論。參考文獻(xiàn)1. 何運勝姜淮蕪，進(jìn)展期胃癌多模式治療的研究進(jìn)展，中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志.2008，1 （15 ，1） ：31-342. 陳峻青.日本胃癌處理規(guī)約第13版重要修改內(nèi)容簡介J.中國實用外科雜志，2000，20(1)：60-623. Yoshinari Mochizuki1, Hayao Nakanishi2, Yasuhiro

16、Kodera3, et.al .TNF- promotes progression of peritoneal metastasis as demonstrated using a green fluorescence protein (GFP)-tagged human gastric cancer cell line J .Clinical & Experimental Metastasis ，2004,21: 394. 吳濤.胃癌腹膜轉(zhuǎn)移預(yù)測和治療進(jìn)展J. 國外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊，2005，32：61. 5. Yoshitaka Yamamura1, Seiji Ito1, Yoshinari Mochizuki1, et.al Distribution of free cancer cells in the abdominal cavity suggests limitations of bursectomy as an essential component of radical surgery for gastric carcinoma J .Gastric Cancer ,2007,10: 24. 6. Nicola Di Paolo,1Giovanni Sacchi, G