染色體與DNA課件

1、第二章染色體與DNA11. 染色體的組成與結(jié)構(gòu)2. DNA的組成與結(jié)構(gòu)3. DNA的復(fù)制4. DNA的修復(fù)5. DNA的重組本章主要內(nèi)容2染色質(zhì)：真核間期核中由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA所組成的復(fù)合體。直徑約1015nm。染色體：染色體已被普遍用于指存在于病毒、細(xì)菌、真核細(xì)胞及其細(xì)胞器內(nèi)所含的核酸分子。存在方式：DNA須經(jīng)高度壓縮，即形成一定的高級(jí)結(jié)構(gòu)后，才能裝入類核和核內(nèi)。1. 染色體（Chromosome)的組成與結(jié)構(gòu) 3 1.1 原核生物(prokaryote)的染色體由DNA和組蛋白樣堿性蛋白質(zhì)（即DNA結(jié)合蛋白）所組成的復(fù)合物DNA結(jié)合蛋白II的二聚體富含精氨酸的臂4（1）

2、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)練：整個(gè)染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成。 （2）存在多順反子mRNA的轉(zhuǎn)錄單元。（3）存在重疊基因：同一段DNA編碼不同的蛋白質(zhì)。 原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因，只有很少數(shù)基因（如rRNA基因）是以多拷貝形式存在的。 E.coli的DNA雙鏈長(zhǎng)達(dá)1.1-1.4mm，是菌體長(zhǎng)度的1000倍。 原核生物基因組的特點(diǎn)5原核基因重疊的方式：1）一個(gè)基因完全存在于另一個(gè)基因內(nèi)2）部分重疊3）兩個(gè)基因只有一個(gè)堿基對(duì)的重疊B在A內(nèi)，E在D內(nèi)；K與C部分重疊；D的終止密碼的最后一個(gè)堿基是J起始密碼的第一個(gè)堿基采蓮人在綠楊津，在綠楊津一闕新；一闕新歌聲漱玉，歌聲漱玉采蓮

3、人。采蓮人在綠楊津一闕新歌聲漱玉61.2 真核生物染色體的組成化學(xué)成分 作用 含量 DNA 遺傳信息的載體 30% 組蛋白 參與核小體的組成 與DNA質(zhì)量相當(dāng)非組蛋白 參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié) 2/3組蛋白量少量的RNA 少于10% DNA量 非組蛋白主要包括酶類及與細(xì)胞分裂有關(guān)的各種蛋白質(zhì)，如HMG蛋白（可能與DNA超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)）、 DNA結(jié)合蛋白（可能是與DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)節(jié)物）、A24等 染色體的組成7 組蛋白的特性(1) 進(jìn)化上的極端保守性 H1 H2A、H2B H3 、H4，(2) 無組織特異性(3) 肽鏈氨基酸分布的不對(duì)稱性(4) 組蛋白的可修飾性。在細(xì)胞周期的特定時(shí)間可發(fā)生

4、甲基化、乙?；⒘姿峄虯DP核糖基化等。修飾的意義：使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其它調(diào)控蛋白易于和染色質(zhì)相互接觸，從而間接影響轉(zhuǎn)錄活性。(5) H5組蛋白的特殊性8 核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)分子生成的八聚體和由大約200bpDNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體的外面。每個(gè)核小體只有一個(gè)H1。 核小體9 核小體組成的實(shí)驗(yàn)證明核酸酶的輕微處理核酸酶的廣泛處理凝膠電泳結(jié)果10染色體DNA核小體螺線體超螺線體.倍倍倍倍約萬倍 染色體形成過程中的長(zhǎng)度變化11染色體的組裝從DNA到染色體不論是形態(tài)還是長(zhǎng)度都相差很大。人類最長(zhǎng)的第一個(gè)染色體全長(zhǎng)僅10m ，但其DN

5、A卻長(zhǎng)達(dá)7.2cm。122. DNA的組成與結(jié)構(gòu)2.1 DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)2.1.1 化學(xué)組成與基本單位13 DNA和RNA中的堿基14 堿基、核苷和核苷酸15核苷酸=核苷+磷酸 單核苷酸的組成（舉例）16 核苷酸單鏈的組成序列的書寫規(guī)則: 5 3；5端在左, 3端在右。172.1.2 真核DNA序列的特點(diǎn) 單一序列(非重復(fù)序列) 中度重復(fù)序列 高度重復(fù)序列18 高度重復(fù)序列的衛(wèi)星DNA衛(wèi)星DNA，占1060%，重復(fù)次數(shù)達(dá)數(shù)百萬次，不轉(zhuǎn)錄，多位于著絲粒處，是異染色質(zhì)組分，可能與染色體穩(wěn)定有關(guān)。19 中度重復(fù)序列中的特殊成分 Alu家族Alu家族: 哺乳動(dòng)物和人類基因組中含量最豐富的一種中度重復(fù)序

6、列，長(zhǎng)約300bp，在單倍體基因組中重復(fù)達(dá)30萬-50萬次。因在其170bp處有一個(gè)限制性內(nèi)切酶Alu的酶切位點(diǎn)（AGCT） 而得名。重復(fù)單位長(zhǎng)約300bp；重復(fù)單位內(nèi)有一Alu(限制性內(nèi)切酶)的識(shí)別和切割位點(diǎn)AGCT，被切成170bp和130bp兩個(gè)片段；3-端有富含A的序列；兩端有720bp的正向重復(fù)作為分界，這部分與簡(jiǎn)單序列重復(fù)(衛(wèi)星)DNA非常相似；不同的Alu成員的側(cè)翼重復(fù)順序各不相同。下面是人類gDNA中的兩個(gè)Alu成員：GTTTAGATAAAGCTA25GTTTAGATAAAAAGAAATGGAGCTA25(GAAA)2NA4GA5GA6GAAAAAATAAATGG202.1.3

7、 三種常見的DNA短重復(fù)序列類型 反向重復(fù)（inverted repeat)：由反方向互補(bǔ)的兩個(gè)DNA片段組成。兩個(gè)反轉(zhuǎn)重復(fù)序列又叫回文序列(palindrome sequence),反轉(zhuǎn)重復(fù)。 鏡像重復(fù)(mirror repeat)：由反方向完全相同的兩個(gè)序列組成。 直接重復(fù)(direct repeat)：由同一方向完全相同的兩個(gè)序列組成。也叫正向重復(fù)序列、順向重復(fù)序列。21反向重復(fù)（回文序列）書臨漢字翰林書畫上荷花和尚畫22較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)(單鏈），可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(發(fā)夾結(jié)構(gòu))23較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)(雙鏈），可形成十字形結(jié)構(gòu)24判斷25鏡象重復(fù)26 C-值矛盾 C-值：指物種單倍體基因組DNA的總

8、量。 C-值悖理（C-value paradox)，C-值矛盾：某些物種C-值大小與其進(jìn)化復(fù)雜性程度之間不呈對(duì)應(yīng)關(guān)系的現(xiàn)象，即某些低等生物卻具有較大的C值。272.1.4 DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定282930桑格法序列分析的原理酶反應(yīng)電泳方向模板CCGGTAGCAACT35GG53引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCAT

9、CGTTA C G TAGTTGCTACC35TCAACGATGG53讀出模板互補(bǔ)序列讀出模板序列31 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型2.2 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)322.2.1 幾個(gè)概念 DNA結(jié)構(gòu)多態(tài)性：由于結(jié)構(gòu)參數(shù)存在一定的差異，而使DNA呈現(xiàn)為B-DNA、A-DNA以及Z-DNA等不同構(gòu)象類型的現(xiàn)象。 DNA構(gòu)象家族：每一類型的DNA（A-DNA 、B-DNA或Z-DNA），并非只代表單一的構(gòu)象，而是代表了一組相關(guān)的構(gòu)象。 結(jié)構(gòu)參數(shù)：指螺旋走向、每匝堿基對(duì)數(shù)、相鄰堿基對(duì)軸向距離、堿基平面與螺旋軸之夾角等。 33ABZ堿基傾角() 20 6 4堿基間距(nm) 0.26 0.34 0.37螺旋直徑(nm

10、) 2.6 2.0 1.8每匝堿基數(shù) 11 10 12螺旋方向 右 右 左 不同螺旋形式DNA分子的主要參數(shù)的比較 A-DNA B-DNA Z-DNA34A-DNA B-DNA Z-DNA35 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多態(tài)性 類型： A B C D E Z螺旋方向（手性） 右 右 右 右 右 左相對(duì)濕度： 75% 92% 66% 目前尚無證據(jù)說明生物體內(nèi)有C-DNA存在。D、E構(gòu)象僅適用于缺少G-C對(duì)的DNA分子。 362.2.2 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（1）A-DNA：A-DNA包括DNA-RNA、RNA-RNA。（2）B-DNA：近似于Waston-Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。（3）Z-DNA

11、：左旋鋸齒形DNA。 Z-DNA的功能：可能與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。 B-DNA向Z-DNA轉(zhuǎn)化的因素：胞嘧啶C5的甲基化；陽離子的結(jié)合；Z-DNA結(jié)合蛋白；負(fù)超螺旋。 B-DNA向A-DNA的轉(zhuǎn)化：B-DNA -（部分脫水） A-DNA 。 在生理狀態(tài)下，B-DNA、A-DNA和Z-DNA可能處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡之中。 螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素：堿基堆積力；氫鍵；與正離子、亞精胺和組蛋白等的結(jié)合。37T=A38CG39大溝的生物學(xué)作用 大溝是蛋白因子的主要識(shí)別部位；與DNA形成三級(jí)結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)可能形成氫鍵的基團(tuán)在大、小溝中的分布大溝 大溝小溝 小溝A - TG - C40 DNA結(jié)合蛋白與DN

12、A之間的相互作用相對(duì)來說,大溝能夠提供更多的用于形成氫鍵的信息。412.3 DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)2.3.1 DNA超螺旋 DNA超螺旋及其種類 超螺旋：是當(dāng)雙股螺旋進(jìn)一步盤繞和扭曲時(shí)所形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)。 超螺旋種類：正超螺旋和負(fù)超螺旋。雙螺旋的松纏將導(dǎo)致形成負(fù)超螺旋；而雙螺旋的擰緊則導(dǎo)致形成正超螺旋。 超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種普遍形式。天然的DNA都呈負(fù)超螺旋。42質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜示意圖 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)其電泳遷移率的影響43 DNA上述結(jié)構(gòu)的變化可用數(shù)學(xué)式來表示： L = T + WL：連接數(shù)（Linking number）， DNA兩條鏈間交叉的次數(shù)。 T：盤繞數(shù)（twist

13、ing number），一條鏈沿螺旋軸所形成的初級(jí)螺旋的周數(shù)。 W：扭曲數(shù)（writhing number），即超螺旋數(shù)。44 超螺旋的意義：（1）使DNA體積變小。使DNA形成高度致密的狀態(tài)，從而得以容納于有限的空間中。（2）利于DNA雙鏈分開或局部熔鏈。DNA特定區(qū)域中超螺旋結(jié)構(gòu)的增加有助于DNA的結(jié)構(gòu)變化，如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)等。 DNA超螺旋的產(chǎn)生： 細(xì)胞內(nèi)所有DNA超螺旋都是由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的催化作用而產(chǎn)生的。452.3.2 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶：催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體（topoisomer）相互轉(zhuǎn)化的酶（topoisomerase）。 催化反應(yīng)：DNA鏈的斷裂和連接。共價(jià)催化

14、。 分類： 型 型 每次作用于1條DNA鏈 作用于2條DNA鏈 不需ATP 需要ATP L每次改變數(shù)為1 L每次改變數(shù)為2 原、真核生物的拓?fù)洚悩?gòu)酶都參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組過程。46 DNA超螺旋的形成 拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶 負(fù)超螺旋 松馳型DNA 正超螺旋 溴乙錠 溴乙錠 雙螺旋分子的鏈間螺旋數(shù)發(fā)生變化（增多或減少幾圈），DNA分子內(nèi)部產(chǎn)生額外的張力而使分子內(nèi)部原子空間位置重排。 拓?fù)洚悩?gòu)酶與DNA共價(jià)結(jié)合形成蛋白質(zhì)DNA中間體，在其磷酸二酯鍵處造成暫時(shí)性裂口，使DNA的多核苷酸鏈得以穿越，從而改變分子的拓?fù)錉顟B(tài)。47 型拓?fù)洚悩?gòu)酶作用機(jī)理 型酶首先結(jié)合于DNA，使該處的DNA熔解，

15、隨后與單鏈區(qū)形成酶DNA復(fù)合物；切割DNA雙股中的一股，與切割點(diǎn)的5-P形成磷酯酰酪氨酸；DNA的另一股鏈穿越切割點(diǎn)，而斷裂的鏈重新連接，酶被釋放。48大腸桿菌topo I: 消除負(fù)超螺旋大腸桿菌topo II：產(chǎn)生負(fù)超螺旋493. DNA的復(fù)制50 Watson和Crick的推測(cè)半保留復(fù)制：雙鏈DNA在復(fù)制時(shí), 兩條單鏈分開，分別以每一條單鏈做模板,各自合成一條新的DNA單鏈，這樣新合成的子代雙鏈DNA分子中, 一條單鏈來自親代DNA，另一條單鏈?zhǔn)切潞铣傻?。DNA半保留復(fù)制意義：保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。51Semi-conservative Conservative Disper

16、sive52 Matthew Messelson Franklin Stahl 1958年Meselson和Stahl利用氮標(biāo)記技術(shù)在大腸桿菌中首次證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制（實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證） DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證53“Heavy” DNA“Hybrid” DNA“l(fā)ight” DNA “Hybrid” DNA54 幾個(gè)概念 復(fù)制原點(diǎn): 特定的復(fù)制起始點(diǎn)ori(或o）, 長(zhǎng)100200bp, 富含A、T。被特定的蛋白因子所識(shí)別。 質(zhì)粒、細(xì)菌染色體、噬菌體和其它病毒通常有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，而真核的則有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。 復(fù)制子（replicon）：即1個(gè)復(fù)制單位，包括復(fù)制原點(diǎn)在內(nèi)的一組基因及其控制下的

17、DNA區(qū)段。原核DNA構(gòu)成一個(gè)復(fù)制子，而真核的則構(gòu)成多個(gè)。 復(fù)制叉：復(fù)制時(shí)，解鏈酶等先將DNA的一段雙鏈解開，形成復(fù)制點(diǎn)，這個(gè)復(fù)制點(diǎn)的形狀象一個(gè)叉子，故稱為復(fù)制叉。55 半不連續(xù)復(fù)制：DNA復(fù)制時(shí)其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的。 前導(dǎo)鏈：指在DNA復(fù)制時(shí)，其延伸方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向一致并連續(xù)合成的鏈。 滯后鏈：指其延伸方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向相反，首先形成許多不連續(xù)的片段(岡崎片段)，最后再連成一條完整鏈的DNA單鏈。 幾個(gè)概念563.1 原核和真核細(xì)胞染色體DNA復(fù)制的特點(diǎn)1）半保留復(fù)制（從DNA復(fù)制的結(jié)果）2）半不連續(xù)復(fù)制（從新生單鏈合成的過程）3）雙向復(fù)制（從復(fù)制叉

18、延伸的方向）573.2 原核細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制3.2.1 復(fù)制的起始 大腸桿菌DNA的復(fù)制原點(diǎn)（oriC）58 大約20個(gè)DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個(gè)9bp保守序列相結(jié)合59 在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna復(fù)制起始復(fù)合物使3個(gè)13bp直接重復(fù)序列變性,形成開鏈 60 解鏈酶六聚體分別與單鏈DNA相結(jié)合(需DnaC幫助),進(jìn)一步解開DNA雙鏈61 1）DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA Topoisomerase)： 拓?fù)洚悩?gòu)酶：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例如：大腸桿菌中的蛋白。 拓?fù)洚悩?gòu)酶：該酶能暫時(shí)性地切斷和重

19、新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。例如：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）。3.2.2 參與大腸桿菌染色體DNA復(fù)制的主要蛋白因子623）單鏈結(jié)合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈、阻止復(fù)性、保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。 2）DNA 解螺旋酶 /解鏈酶（DNA helicase)：通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。 E. coli中的解螺旋酶Rep沿前導(dǎo)鏈模板的35移動(dòng)，而解螺旋酶(DnaB)I、II、III沿后隨鏈模板的5 3移動(dòng)。運(yùn)送和協(xié)同DnaBDnaC解開DNA雙鏈DnaBDnaA辨

20、認(rèn)起始點(diǎn)解螺旋酶634）引物合成酶（引發(fā)酶）： 此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。該酶是一種特殊的以DNA為模板的RNA聚合酶，是DnaG基因的產(chǎn)物。岡崎片段的合成需要RNA引物；前導(dǎo)鏈的合成也需要RNA引物。DNA復(fù)制時(shí)使用RNA引物的意義:提高DNA復(fù)制的保真性。64 染色體DNA復(fù)制時(shí)存在RNA引物的實(shí)驗(yàn)證明65性質(zhì) 聚合酶聚合酶聚合酶3 5外切活性+5 3外切活性+-5 3聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生鏈合成-+ 聚合酶：DNA復(fù)制的主要聚合酶，其3 5外切活性的校對(duì)功能，提高了DNA復(fù)制的保真性。 聚合酶(DNA Pol )，Kor

21、nberg酶: 主要是對(duì)DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時(shí)切除RNA引物并催化DNA合成以填補(bǔ)切除RNA引物后留下的缺口。 聚合酶：修復(fù)紫外光引起的DNA損傷。5）大腸桿菌的DNA聚合酶 是以DNA為模板的DNA合成酶（DdDp）。催化反應(yīng)時(shí)，以dNTP為底物；需要DNA模板；需要3-OH；新鏈合成方向?yàn)? 3 66E.coli 中的三種DNA多聚酶67 聚合反應(yīng)的基本過程都是通過新合成的鏈的3-OH對(duì)進(jìn)入的新的核苷三磷酸（用d NTP）的磷進(jìn)行親核攻擊，導(dǎo)致磷酯鍵斷裂，結(jié)果在鏈的3末端加上了一個(gè)新的核苷酸，即延長(zhǎng)了一個(gè)核苷酸。 釋放出的焦磷酸經(jīng)焦磷酸酶水解有利于聚合反應(yīng)的進(jìn)行。68 Kle

22、now片段 大腸桿菌DNA Pol 經(jīng)枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶處理后所得到的羧基端大片段,具5 3聚合和3 5外切功能。在體外，曾用于DNA測(cè)序和PCR反應(yīng)。69 Klenow片段的結(jié)構(gòu)70 大腸桿菌的DNA Pol III Pol 是一種非對(duì)稱二聚體，一個(gè)單體用于先導(dǎo)鏈的合成，另一個(gè)用于后隨鏈的合成。 核心酶: 由、三個(gè)亞基構(gòu)成， ：5- 3聚合。 ：3-5外切。：激發(fā)外切酶活性。延伸前導(dǎo)鏈和滯后鏈.復(fù)制速率:體內(nèi): 1000nt/sec。體外: 700nt/sec。71Each catalytic core of Pol synthesizes a daughter strand. Dna

23、B is responsible for forward movement at the replication fork.Coordinating synthesis of the lagging and leading strands.7273 6）DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）： 若雙鏈DNA中一條鏈有切口，切口一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。 DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用。連接酶基因的發(fā)現(xiàn) E. coli lig基因突變，并不導(dǎo)致DNA合成的終止，但引起岡崎片段的異常積累。 3535OHP74 連接酶的作

24、用機(jī)制 輔因子原核: NAD真核: ATP+753.2.3 DNA的復(fù)制過程（以大腸桿菌的為例）復(fù)制的起始解旋與解鏈：型拓?fù)洚悩?gòu)酶即DNA旋轉(zhuǎn)酶，引入負(fù)超螺旋，抵消復(fù)制叉推進(jìn)時(shí)所產(chǎn)生的正超螺旋。解鏈酶消耗ATP，打開雙鏈。RNA引物的合成：DNA引發(fā)酶結(jié)合到DNA上并合成一段短的RNA引物，從而引發(fā)復(fù)制叉處先導(dǎo)鏈的復(fù)制。引發(fā)體（primosome) 復(fù)合體在后隨鏈模板上移動(dòng)時(shí)，每隔1000-2000nt就合成1個(gè)RNA，用作合成岡崎片段的引物。DNA鏈的延伸：前導(dǎo)鏈和后隨鏈的引物都由DNA Pol 延伸。即，前導(dǎo)鏈和岡崎片段的合成均由DNA Pol 催化。RNA引物的切除及引物切除后所留缺口的

25、填補(bǔ)：由DNA Pol催化。崗崎片段的連接復(fù)制的終止76 大腸桿菌染色體DNA復(fù)制的終止 在與oriC約相對(duì)的位置,具有DNA復(fù)制終止位點(diǎn)- 20bp重復(fù)性終止子序列（Ter），此處可以結(jié)合一種特異的蛋白質(zhì)分子叫做Tus(tus基因的產(chǎn)物)，這種蛋白質(zhì)可能是通過抑制解鏈酶(Helicase)的活性而終止復(fù)制的。詳細(xì)的機(jī)制還不完全清楚。復(fù)制結(jié)束時(shí)，兩個(gè)子鏈仍是相扣的，它們由拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋，結(jié)果子代DNA隨著各自在細(xì)胞膜上的附著點(diǎn)移動(dòng)而相互分離，分配到2個(gè)子細(xì)胞中。77 一般每個(gè)細(xì)菌胞內(nèi)只有一個(gè)核區(qū)，當(dāng)細(xì)胞快速生長(zhǎng)時(shí)，由于DNA復(fù)制次數(shù)與細(xì)胞分裂次數(shù)不同步，一個(gè)胞內(nèi)可同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)甚至4個(gè)核區(qū)。 圖

26、78 DNA分子的復(fù)制過程793.2.4 DNA復(fù)制的其它方式 滾環(huán)型：?jiǎn)蜗驈?fù)制的一種特殊方式。如：174的雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RF） 幾個(gè)概念：基因的DNA正鏈 = 有義鏈 = 編碼鏈 基因的DNA負(fù)鏈 = 反義鏈 = 模板鏈 噬菌體基因組較小，是DNA復(fù)制研究的重要實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。其復(fù)制是在進(jìn)入寄主細(xì)胞后，主要利用寄主的基因產(chǎn)物進(jìn)行的。 E. coli噬菌體174的基因組是一個(gè)含5386nt的單鏈環(huán)型DNA。復(fù)制時(shí)，首先合成的是其互補(bǔ)鏈,形成RF型雙鏈分子,然后再以滾環(huán)復(fù)制方式產(chǎn)生其基因組DNA。(+) DNA RF (+) DNA80 X174以(+)鏈為模板合成RF型雙鏈DNA81 RF型

27、X 174滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生(+)鏈滾環(huán)復(fù)制過程及特點(diǎn)1）在正鏈的復(fù)制原點(diǎn)處切開。2）不需RNA引物，以負(fù)鏈為模板，延伸正鏈。3）只有一個(gè)復(fù)制叉，單向復(fù)制。82 復(fù)制型（RF）174雙鏈環(huán)狀DNA的滾環(huán)復(fù)制174(-)鏈合成是不連續(xù)的，相當(dāng)于E. coli DNA后隨鏈的合成，(+)鏈的合成是連續(xù)的，相當(dāng)于E. coli先導(dǎo)鏈的合成。83D-環(huán)復(fù)制D-環(huán)復(fù)制：?jiǎn)蜗驈?fù)制的一種特殊類型。Pol參與。有兩個(gè)單向復(fù)制叉。843.3.1 真核DNA聚合酶 Pol 存在部位 核 核 核 核 線粒體Pol ：可能主要負(fù)責(zé)RNA引物的合成。Pol : 可能與DNA修復(fù)有關(guān)。Pol ：負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制。Pol

28、：負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成 。Pol : 與滯后鏈合成有關(guān)；可能參與去除RNA引物, 并填補(bǔ)缺口；參與切除修復(fù)。3.3 真核DNA的復(fù)制特點(diǎn)8586 原核與真核染色體DNA復(fù)制的比較873.3.2 端粒DNA的復(fù)制端粒：真核染色體的末端結(jié)構(gòu)。端粒的功能: 保持染色體的穩(wěn)定。端粒DNA的序列特點(diǎn)：一般含許多串聯(lián)的短寡聚核苷酸序列，其一股鏈如為TxGy，其互補(bǔ)鏈就為CyAx，x和y在1-4范圍內(nèi)。端粒DNA序列具有一定的取向特征，在每一染色體的末端，富含G的一股鏈由53方向延伸而成為一個(gè)由1216nt構(gòu)成的單鏈突起。端粒酶：是一種含RNA的蛋白復(fù)合體,是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶。所含RNA(約長(zhǎng)150n

29、t)與端粒DNA末端的單鏈突起互補(bǔ),該RNA可作為模板, 延長(zhǎng)上述單鏈突起。端粒DNA的復(fù)制: 尺蠖模型88真核端粒DNA復(fù)制的尺蠖模型89 3.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的復(fù)制模式逆轉(zhuǎn)錄酶具有以下催化活性：（1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性； （2）DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性； （3）RNaseH的活性：專門降解RNA-DNA分子中的RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶（RNA-directed DNA polymerase）與RNA聚合酶一樣不具3-5外切酶活力。體外主要用于cDNA（complementary DNA）的合成。90 逆轉(zhuǎn)錄病毒 是一種真正的二倍體病毒，為正鏈RNA病毒。其基因產(chǎn)物的表達(dá)和后代病毒

30、的產(chǎn)生，都必須通過DNA中間體。HIV是AIDS（愛滋病）的病原體。(1) 基因組結(jié)構(gòu)：含2拷貝單鏈RNA和2個(gè)tRNA。 逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)基因gag，編碼核心蛋白；pol，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶等；env，編碼被膜蛋白。91 逆轉(zhuǎn)錄過程 逆轉(zhuǎn)錄過程需RdDp、DdDp、RNase H和RNA內(nèi)切酶92 逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄前后基因組組織結(jié)構(gòu)的比較933.5 病毒基因組復(fù)制及表達(dá)類型94DNA修復(fù)系統(tǒng)功能錯(cuò)配修復(fù)修復(fù)錯(cuò)配堿基和核甘酸切除修復(fù)切除突變的堿基和核甘酸DNA直接修復(fù)重組修復(fù)易錯(cuò)修復(fù)(SOS修復(fù))修復(fù)嘧啶二體或甲基化DNA同源單鏈的置換超越創(chuàng)傷的復(fù)制 扼要說明細(xì)胞中DNA修復(fù)系統(tǒng)有哪幾

31、種（8分） 中國(guó)科學(xué)院2019年碩士學(xué)位研究生入學(xué)分子遺傳學(xué)試題4 DNA的修復(fù)95 錯(cuò)配修復(fù)發(fā)生于GATC的臨近處，故也稱為甲基指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)。 參與錯(cuò)配修復(fù)的蛋白因子：Dam甲基化酶；MutH、MutS、MutL；DNA解旋酶；SSB；DNA聚合酶；核酸外切酶；DNA連接酶。 錯(cuò)配修復(fù)能使復(fù)制的保真性提高100-1000倍。已在大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)這一修復(fù)系統(tǒng)。所有錯(cuò)配都可由這一系統(tǒng)所修復(fù)。錯(cuò)配修復(fù)工作模型4.1 錯(cuò)配修復(fù)96 一些堿基自發(fā)脫氨基，然后改變配對(duì)性質(zhì)，造成氨基轉(zhuǎn)換突變腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤與胞嘧啶配對(duì)鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤與胞嘧啶配對(duì)胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏づc腺嘌呤配對(duì) 堿基轉(zhuǎn)換突變

32、 DNA糖苷消解酶，特異性切除受損DNA上的N 糖苷鍵，從而形成去除堿基位點(diǎn)（AP位點(diǎn)）。4.2 切除修復(fù)97 胞嘧啶脫氨基生成尿嘧啶98 胞嘧啶脫氨基生成尿嘧啶, 在DNA復(fù)制時(shí), 將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)突變99 堿基和核苷酸切除修復(fù)1）通過特異的核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位并在損傷部位的旁邊產(chǎn)生切口。2）由核酸外切酶水解包括損傷部位在內(nèi)的一段DNA片段。3）由DNA聚合酶以母鏈為模板復(fù)制合成一段新子鏈4）由DNA連接酶封閉切口。1004.3 DNA的直接修復(fù)在DNA光解酶作用下,將環(huán)丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物還原成為單體101 直接修復(fù)嘧啶二聚體的酶促光解1024.4 重組修復(fù) DNA復(fù)制時(shí),模板單鏈

33、若有大段損傷,則新鏈復(fù)制合成可越過損傷部位而在其下游約1000nt處開始。新鏈的缺少部分,由相應(yīng)的的同源單鏈部分通過同源重組而填補(bǔ)。然后再通過切除修復(fù),修復(fù)原模板單鏈的損傷部位。1034.5 易錯(cuò)修復(fù)(SOS修復(fù)) 這是一種無模板指導(dǎo)的超越創(chuàng)傷的復(fù)制修復(fù)，常易錯(cuò)配和致突變。1045.1 DNA重組的類型5.1.1 DNA重組的含義：DNA堿基順序的重新組合或DNA片段（或DNA分子）的重新連接。5.1.2 DNA重組的類型：根據(jù)對(duì)DNA序列和蛋白質(zhì)因子的要求不同，可將重組分為同源重組和非同源重組。5 DNA重組機(jī)制105（1）同源重組（homologous recombination） 發(fā)生于

34、DNA的同源序列之間，要求序列相同或相近的較大的DNA片段進(jìn)行交換，通常是兩個(gè)DNA分子互相交換對(duì)等的部分。如噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)菌的結(jié)合、真核生物非姊妹染色單體之間的交換等。106（2）非同源重組：兩個(gè)DNA分子不交換對(duì)等的部分。 1）轉(zhuǎn)座重組：不需要序列同源性和重組酶。 2）位點(diǎn)專一性重組：要求有限的序列同源性，即依賴于小范圍同源序列的聯(lián)會(huì)。如某些噬菌體基因組在宿主基因組上的整合作用。5.1.3 研究意義 重組機(jī)制的研究有助于了解基因的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)理；有助于進(jìn)行人類遺傳病的基因治療。107 5.2 同源重組 5.2.1 同源重組的機(jī)制 （1）斷裂重接假設(shè) 該假設(shè)的提出，是基于對(duì)真核細(xì)

35、胞染色體減數(shù)分裂的細(xì)胞學(xué)觀察。涉及到雙鏈DNA的斷裂和重接。染色體收縮所產(chǎn)生的張力導(dǎo)致染色單體斷裂，來自不同染色單體的斷裂端按一定順序交互重接；可發(fā)生于染色單體的不同區(qū)域；最終可產(chǎn)生相互重組的染色單體。108 斷裂重接假設(shè)109（2）單鏈交換模式 斷裂重接發(fā)生于兩個(gè)配對(duì)的雙鏈DNA分子的兩條同源單鏈之間，兩個(gè)配對(duì)的雙鏈DNA分子各自有一條單鏈（互為同源單鏈）斷裂，兩條同源單鏈交叉連接，形成Holliday結(jié)構(gòu)，交叉點(diǎn)“分支遷移”，在每個(gè)雙鏈分子上均形成異源雙鏈區(qū)。連接分子的拆分結(jié)果，或者形成含有異源雙鏈區(qū)的兩條DNA分子（新切點(diǎn)位于原來產(chǎn)生斷點(diǎn)的兩條同源單鏈上），或者形成重組DNA分子（新切點(diǎn)

36、位于原來未產(chǎn)生斷點(diǎn)的另外兩條同源單鏈上）。110 DNA單鏈交換模式111 （3）雙鏈斷裂模式 兩條雙鏈DNA分子配對(duì)，其中一條分子（受體分子）在核酸內(nèi)切酶的作用下雙鏈斷裂，并在核酸外切酶的催化下產(chǎn)生缺口，缺口處的一條單鏈3端被另一完整的雙鏈DNA分子（供體分子）攝入其雙鏈區(qū)，在該雙鏈區(qū)，入侵單鏈與其互補(bǔ)鏈配對(duì)，從而使其同源單鏈的部分區(qū)段被取代而形成D環(huán)結(jié)構(gòu)。入侵單鏈以其互補(bǔ)鏈為模板，得以合成而延伸，同時(shí)被置換出的D環(huán)單鏈不斷擴(kuò)大。112當(dāng)D環(huán)單鏈擴(kuò)至足以填補(bǔ)原受體分子的缺口時(shí)，即與缺口處的另一單鏈的3端退火，并以D環(huán)單鏈為模板，通過合成而延伸缺口處的3端單鏈，直至使缺口修復(fù)成為完整的雙鏈區(qū)。

37、連接分子拆分的結(jié)果，將產(chǎn)生含異源雙鏈區(qū)的DNA分子，其中有些為重組分子。該工作模式的意義在于，一條DNA分子上的損傷或錯(cuò)誤信息，可為其同源分子的對(duì)應(yīng)序列所修復(fù)或矯正。 113 雙鏈斷裂啟動(dòng)重組工作模型1145.2.2 大腸桿菌的DNA重組（1）重組酶1）Rec A蛋白：是由rec A基因編碼、催化重組基本反應(yīng)的酶。該酶催化DNA單鏈去置換雙鏈中的同源鏈，具有：i. 單鏈結(jié)合作用；ii. 依賴于單鏈的雙鏈解旋作用；iii. 依賴于單鏈DNA的ATPase作用；iv. 蛋白酶作用。1152）Rec BCD酶（核酸外切酶V）：其各個(gè)亞基分別是由rec B、rec C和rec D基因編碼，是一種有效的

38、DNA降解酶。具有解旋作用；ATPase活性；作用于雙鏈DNA，產(chǎn)生具自由末端的單鏈區(qū)域。3）Ruv A、Ruv B和Ruv C：分別由ruv A、ruv B和ruv C編碼。Ruv A：識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)。Ruv B：是一種ATP酶，為“分支遷移”提供力。Ruv C：一種核酸內(nèi)切酶，專一識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)連接點(diǎn)，切割連接點(diǎn)以拆分重組中間體。116（2）chi序列: chi位點(diǎn)具有恒定的8bp不對(duì)稱序列 ，可在大范圍內(nèi)激發(fā)重組。 指E.coli中由RecA介導(dǎo)遺傳重組的“熱點(diǎn)”序列，是具有較高同源重組活性的一段序列，即GCTGGTGG，既是recBC的識(shí)別序列，又是其激活序列。 （3）重組反應(yīng)： Rec BCD酶使供體雙鏈DNA解旋、切割而產(chǎn)生自由的末端單鏈，Rec A蛋白催化該單鏈侵入受體DNA的同源區(qū)，入侵單鏈與其互補(bǔ)鏈退火，置換出其同源單鏈（形成D-環(huán)），Ruv A、Ruv B使異源雙鏈區(qū)形成并擴(kuò)展（D-環(huán)擴(kuò)大），最后由Ruv C將重組中間體拆分。117 大腸桿菌的DNA重組機(jī)制1185.3 位點(diǎn)專一性重組5.3.1 特點(diǎn)：涉及較短的同源序列；在特定位點(diǎn)上發(fā)生斷裂和交互重接；是專一的酶促過程。5.3.2 位點(diǎn)專一性重組機(jī)制（1）噬菌體基因組特點(diǎn)及生活史簡(jiǎn)介1）噬菌體基因組特點(diǎn)：基因組全長(zhǎng)4