藥物鑒別試驗(yàn)(identificationtest)

1、藥物鑒別試驗(yàn)(identificationtest)一、 概 述(Introduction) 藥物的鑒別試驗(yàn)(identification test) 是根據(jù)藥物的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)，采用化學(xué)、物理化學(xué)或生物學(xué)方法來(lái)判斷藥物的真?zhèn)?。僅適用于貯藏在有標(biāo)簽容器中的藥物，用以證實(shí)是否為其所標(biāo)示的藥物。二、 鑒別試驗(yàn)的項(xiàng)目(Item of Identification Test)（一）性狀 藥物的性狀反映了藥物特有的物理性質(zhì)，一般包括外觀、臭、味、溶解度以及物理常數(shù)如熔點(diǎn)、比旋度、吸收系數(shù)等。1.外觀：指藥物的聚集狀態(tài)、晶型、色澤以及臭、味等性質(zhì)。2.溶解度：是藥物的一種物理性質(zhì)，在一定程度上反映了藥

2、物的 純度，以極易溶解、易溶、溶解、略溶、微溶、極微溶解、幾乎不溶或不溶來(lái)描述。3.物理常數(shù)測(cè)定：不僅對(duì)藥品鑒別有意義，也反映了純雜程度。藥典收載的物理常數(shù)包括：相對(duì)密度、餾程、熔點(diǎn)、凝點(diǎn)、比旋度、折光率、黏度、酸值、皂化值、羥值、碘值、吸收系數(shù)。 測(cè)定一些物理常數(shù)（如折光率、旋光度、比旋度、凝點(diǎn)、熔點(diǎn)、相對(duì)密度等可以作為定性鑒別的一種手段。（1）熔點(diǎn)：指一種物質(zhì)按規(guī)定方法測(cè)定，由固體熔化成液體溫度、熔融同時(shí)分解的溫度或在熔化時(shí)自初熔至全熔的一段溫度。 （2）旋光度和比旋度：在一定波長(zhǎng)與溫度下，偏振光透過(guò)長(zhǎng)1dm且每1ml中含有旋光性物質(zhì)1g的溶液時(shí)測(cè)得的旋光度為比旋度。20，用鈉光譜的D線(

3、589.3nm)測(cè)定旋光度，除另有規(guī)定外，測(cè)定管長(zhǎng)度為1dm。比旋度 為測(cè)得的旋光度 l 為測(cè)定管長(zhǎng)度dm d 為液體的相對(duì)密度 區(qū)分或檢查藥品的純雜程度，或測(cè)定含量 薄荷油“折光率 應(yīng)為（附錄VII F ） 旋光度 取本品，依法測(cè)定（附錄VII E），旋光度應(yīng)為-17至-24 ” （3）吸收系數(shù)：在給定的波長(zhǎng)溶劑和溫度的條件下，吸光物質(zhì)在單位濃度、單位液層厚度時(shí)的吸收度稱為吸收度。 有兩種表示方式：摩爾吸收系數(shù)和百分吸收系數(shù)。后者是中國(guó)藥典收載的方法，它是指在一定波長(zhǎng)下，溶液濃度為1（W/V)，厚度為lcm時(shí)的吸收度。 用于考查藥品的質(zhì)量，定量分析。（4）折光率20，用鈉光譜的D線(589.

4、3nm)測(cè)定供試品相對(duì)于空氣的折光率。區(qū)分不同的油類或檢查藥品的純雜程度（5）相對(duì)密度比重瓶和韋氏比重秤檢查樣品的純雜程度（6）凝點(diǎn)比重瓶法毛細(xì)管法測(cè)定熔點(diǎn)(二)一般鑒別試驗(yàn) (General Identification Test) 一般鑒別試驗(yàn)：是根據(jù)藥物的性質(zhì)，選擇一些明顯的、易于察覺(jué)的化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)進(jìn)行的，為保證試驗(yàn)的可靠性，凡影響反應(yīng)結(jié)果特征變化的因素，如溶液的酸堿度、濃度、反應(yīng)溫度，共存物質(zhì)及反應(yīng)的介質(zhì)等，均應(yīng)嚴(yán)格控制。無(wú)機(jī)藥物：藥物中的陰離子和陽(yáng)離子的特殊反應(yīng)； 有機(jī)藥物：典型的官能團(tuán)反應(yīng)。 因此，一般鑒別試驗(yàn)只能證實(shí)是某一類藥物，而不能證實(shí)是哪一種藥物。通常一般鑒別試驗(yàn)不

5、適用于數(shù)種化學(xué)藥物的混合物鑒別或在有干擾物質(zhì)存在時(shí)鑒別。 一般鑒別試驗(yàn)僅供確認(rèn)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中單一的化學(xué)藥物，如為數(shù)種化學(xué)藥物的混合 物或有干擾物質(zhì)存在時(shí)，除另有規(guī)定外，應(yīng)不適用。一般鑒別試驗(yàn)所包括的項(xiàng)目有：丙二酰脲類、托烷生物堿類、芳香第一胺類、有機(jī)氟化物類、無(wú)機(jī)金屬鹽類(鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鈣 鹽、鋇鹽、銨鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋁鹽、鋅鹽、銅鹽、銀鹽、汞鹽、鋇鹽、銻鹽、亞錫鹽)、有機(jī)酸鹽 (水楊酸鹽、枸櫞酸鹽、乳酸鹽、苯甲酸鹽、酒石酸鹽)、無(wú)機(jī)酸鹽(亞硫酸鹽或亞硫酸氫鹽、 硫酸鹽、硝酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽與碳酸氫鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物等。1.有機(jī)氟化物（1）鑒別方法：供試品（有機(jī)破

6、壞，水、NaOH收）（加茜素氟藍(lán)）（加NaAc的稀HAc液）（加硝酸亞鈰）顯藍(lán)紫色（2）反應(yīng)原理：有機(jī)氟化物經(jīng)氧瓶燃燒破壞，被堿性液吸收成為無(wú)機(jī)氟化物，與茜素氟藍(lán)、硝酸亞鈰在溶液中形成藍(lán)紫色絡(luò)合物。2.有機(jī)酸鹽 (1) 水楊酸 1)鑒別方法 供試品(稀溶液)-加FeCl3紫色 2)反應(yīng)原理 本品在中性或弱酸性條件下,與FeCl3生成配位化合物,中性時(shí)呈紅色,弱酸性時(shí)呈紫色. (2) 酒石酸鹽 1) 鑒別方法 供試品(中性溶液)-置潔凈試管-加氨制AgNO3數(shù)滴-水浴加熱-銀游離附在內(nèi)管壁成銀鏡.3. 芳香第一胺類 (1) 鑒別方法 供試品(50mg)-稀鹽酸(1ml)-緩緩煮溶,放冷-加亞硝酸

7、鈉(0.1mol/L)數(shù)滴-滴加堿性 -萘酚數(shù)滴-橙黃色到猩紅色沉淀。4. 托烷生物堿類 (1) 鑒別方法 供試品(約10mg)-發(fā)煙硝酸(5滴)-水浴蒸干-黃色殘?jiān)?放冷-乙醇(23滴)-固體氫氧化鉀一小顆-深紫色。 (2) 反應(yīng)原理 托烷生物堿類均具有莨菪堿結(jié)構(gòu),有Vitali反應(yīng),顯紫色.5. 無(wú)機(jī)金屬鹽（1）鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽的焰色反應(yīng)：鉑絲-鹽酸潤(rùn)濕，無(wú)色火焰中燃燒顯色。（2） 銨鹽：鑒別方法： 加NaOH-加熱分解發(fā)生NH3臭-遇濕潤(rùn)紅色石蕊試紙變藍(lán)。6. 無(wú)機(jī)酸鹽(1) 氯化物 鑒別一： 加HNO3呈酸性-加硝酸銀-生成白色凝乳沉淀-分離沉淀加NH3試液溶解-加HNO3沉淀復(fù)生成。

8、 鑒別二 ：供試品-置試管中加等量MnO2,混勻-加硫酸潤(rùn)濕-緩緩加熱,發(fā)生Cl2-使?jié)駶?rùn)的碘化鉀試紙顯藍(lán)色。(2) 硫酸鹽 鑒別一： 供試品-加氯化鋇-白色沉淀-分離沉淀不溶于硝酸或鹽酸 鑒別二 ：供試品-加PbAc-白色沉淀-分離，在NH4Ac或NaOH試液中溶解.(三)專屬鑒別試驗(yàn) (Specific Identification Test) 藥物的專屬鑒別試驗(yàn)是證實(shí)某一種藥物的依據(jù)，它是根據(jù) 每一種藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異及其所引起的物理化學(xué)特性的不同，選用某些特有的靈敏定性反應(yīng)，來(lái)鑒別藥物真?zhèn)蔚摹?一般鑒別試驗(yàn)是以某些類別藥物的共同化學(xué)結(jié)構(gòu)為依據(jù)，根據(jù)其相同的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行藥物真?zhèn)蔚蔫b別

9、以區(qū)別不同類別的藥物。而專屬鑒別試驗(yàn)，則是在一般 鑒別試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用各種藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，來(lái)鑒別藥物，以區(qū)別同類藥物或具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)部分的各個(gè)藥物單體，達(dá)到最終確證藥物真?zhèn)蔚哪康??；瘜W(xué)反應(yīng)鑒別微量升華鑒別熒光分析鑒別光譜鑒別色譜鑒別結(jié)論（是否符合規(guī)定）指紋圖譜鑒別三、鑒別方法(Identification Method)(一) 化學(xué)鑒別法目的：要把需要鑒別的化學(xué)成分提取出來(lái)，以排除其他成分的干擾，得出正確的檢驗(yàn)結(jié)果。 1. 呈色反應(yīng)鑒別法： 如三氯化鐵呈色反應(yīng)； 異羥肟酸鐵反應(yīng)； 茚三酮呈色反應(yīng)； 重氮化-偶合呈色反應(yīng)； 氧化還原呈色反應(yīng)及其它顏色反應(yīng)。2. 沉淀生成反應(yīng)鑒別 如：與重

10、金屬離子的沉淀反應(yīng)； 與硫氰化鉻銨(雷氏鹽)的沉淀反應(yīng)； 其它沉淀反應(yīng)。3.熒光反應(yīng)鑒別法：如：藥物本身在可見(jiàn)光下發(fā)射熒光； 藥物溶液加硫酸使呈酸性后在可見(jiàn)光下發(fā)射熒光； 藥物和溴反應(yīng)后于可見(jiàn)光下發(fā)射出熒光； 藥物與間二苯酚反應(yīng)后發(fā)射出熒光； 其它反應(yīng)后發(fā)射熒光。4. 氣體生成反應(yīng)鑒別法： 如產(chǎn)生氨氣; 硫化氫氣體; 含碘有機(jī)藥物經(jīng)直火加熱,可生成紫色碘氣; 含醋酸脂和乙酰胺類藥物經(jīng)硫酸水解后,加乙醇產(chǎn)生醋 酸乙脂的香味.5. 測(cè)定生成物的熔點(diǎn)。(二) 光譜鑒別法 利用光譜法對(duì)中藥制劑進(jìn)行定性鑒別，主要有熒光鑒別法，可見(jiàn)紫外分光光度法、紅外分光光度法，而其它的鑒別法較少應(yīng)用。1. 紫外光譜鑒別

11、法：常見(jiàn)的鑒別方法有： 1、規(guī)定吸收波長(zhǎng)法：（最常用）樣品經(jīng)適當(dāng)處理后，測(cè)定其吸收光譜，在一定波長(zhǎng)處有最大吸收； 2、對(duì)照品對(duì)比法：取對(duì)照品或?qū)φ账幉募肮┰嚻方?jīng)處理后，制成對(duì)照品溶及供試品溶液，分別測(cè)定吸收光譜，比較二者吸收光譜的一致性； 3、規(guī)定吸收波長(zhǎng)和吸收度法：取樣品經(jīng)處理后，測(cè)定吸收光譜，在吸收光譜的規(guī)定波長(zhǎng)下應(yīng)有若干個(gè)吸收峰，并有相應(yīng)的吸收度值； 4、規(guī)定吸收波長(zhǎng)和吸收度比值法：樣品在一定波長(zhǎng)下應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的吸收峰，并且吸收度與對(duì)照峰的吸收度比值應(yīng)在一定的范圍之內(nèi)，此法的條件是要有對(duì)照品或參照物； 5、多溶劑光譜法：選用不同極性的溶劑按一定次序提取樣品，將樣品為分若干個(gè)溶劑組，然后測(cè)定

12、各組的吸收光譜，根據(jù)所得到的特征吸收光譜或?qū)?shù)光譜進(jìn)行鑒別。2. 紅外光譜鑒別法（ 4000-400cm-1）： 紅外光譜法是一種專屬性很強(qiáng)、應(yīng)用較廣(固體、液體、氣體樣品)的鑒別方法.主要用于組分單一,結(jié)構(gòu)明確的原料藥。 1、在4000-400cm-1范圍間測(cè)定中藥制劑樣品紅外吸收光譜。 2、制樣方法：取樣品直接制樣，或經(jīng)溶劑提取后制樣。 3、該法具有取樣少、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，但目前用于中藥制劑的鑒別報(bào)道不多。 廠家A批次1廠家A批次2廠家B不同廠家不同批次清開(kāi)靈注射液IR圖譜比較 廣西藥檢所曾應(yīng)用紅外分光光度法對(duì)牛黃真?zhèn)芜M(jìn)行研究, 在17001550cm-1范圍內(nèi), 天然牛黃有三個(gè)較

13、強(qiáng)的特征吸收倒峰, A 1663 9cm-1; B 1628 4cm-1;C 1566 10-1, 因牛黃系混合物, 其化學(xué)組成及各成分含量上不盡相同, 故特征吸收峰位波動(dòng)范圍稍大, 但多次實(shí)驗(yàn)表明, 仍具有穩(wěn)定的鑒別意義。還有報(bào)道對(duì)大黃及其偽品、厚樸及其偽品、西洋參及其偽品(人參)、白芍和赤芍的紅外光譜進(jìn)行研究。 3 .熒光鑒別法： 1. 本身能發(fā)出熒光 2. 經(jīng)化學(xué)處理后能發(fā)出熒光(三) 色譜鑒別法1 . 薄層色譜法2 . 薄層掃描法3 . 紙色譜法4 . 氣相色譜法5 . 高效液相色譜法 1. 薄層色譜鑒別法： 實(shí)際工作中,一般采用對(duì)照品(或標(biāo)準(zhǔn)品)比較法,要求供試品斑點(diǎn)的Rf值與對(duì)照品

14、斑點(diǎn)一致。延胡索TLC鑒別 展開(kāi)劑：正己烷-三氯甲烷-甲醇（：4：1） 顯色：碘蒸氣，紫外光燈（365nm）1-3供試品，4陰性對(duì)照，5對(duì)照藥材，6延胡索乙素對(duì)照品 2 .薄層掃描法 薄層掃描法系指用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜有吸收紫外光或可見(jiàn)光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于中藥制劑的鑒別。 操作方法：薄層板制備、樣品液與對(duì)照液制備、點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色（或定位）、上機(jī)掃描、色譜峰確認(rèn)。 本法主要用于定量，用于鑒別較少. 例如：冠心蘇合丸的薄層掃描鑒別（蘇合香、冰片、乳香（制）、檀香、青木香）乳香鑒別薄層掃描圖蘇合香鑒別薄層掃描圖陰性對(duì)照陽(yáng)

15、性對(duì)照供試品3 .紙色譜鑒別法 斑點(diǎn)的位置（Rf）、顏色（或熒光），與對(duì)照品相比較紙色譜法是以紙為載體，以紙上所含水或其它物質(zhì)為固定相，用展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)的分配色譜。一般采用在相同實(shí)驗(yàn)條件下與對(duì)照物質(zhì)對(duì)比以確定其異同。用于藥物的鑒別時(shí)，供試品在色譜中所顯主斑點(diǎn)的位置、顏色（熒光）應(yīng)與對(duì)照品相同。 4.高效液相色譜和氣相色譜鑒別法： 保留時(shí)間應(yīng)一致，含量測(cè)定方法為內(nèi)標(biāo)法時(shí),可要求供試品和對(duì)照品試液色譜圖中藥物峰的保留時(shí)間與內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間比值應(yīng)相同。平胃舒膠囊HPLC色譜圖鹽酸小檗堿對(duì)照品（上）、平胃舒膠囊（中）和黃連陰性樣品（下）5.其他鑒別方法高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）X-射線衍射法導(dǎo)數(shù)光譜

16、法指紋圖譜分子生物學(xué)技術(shù)從植物、微生物、合成化合物中篩選活性成分（抗菌、抗真菌, 抑制膽堿酯酶以及清除自由基和抗氧化等活性）；從廢水、飲用水、生物樣品、食用原料、食品等中檢查抗生素或其他活性成分；藥物的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。(四) 生物學(xué)法(五)藥物鑒別方法新動(dòng)向 1.儀器方法用于藥物的鑒別數(shù)量增加，尤其是紅外光譜法和高效液相色譜法； 2.制劑廣泛采用IR法鑒別； 3.鑒別條目簡(jiǎn)練，選擇專屬的方法進(jìn)行鑒別。影響鑒別反應(yīng)的因素主要有: (一)溶液的濃度 鑒別試驗(yàn)多采用觀測(cè)沉淀、顏色或各種光學(xué)參數(shù)(max、 min、A、百分吸收系數(shù)等)的變化，來(lái)判定結(jié)果。藥物和有關(guān)試劑的濃度直接影響上述的各種變化，必須

17、嚴(yán)格規(guī)定。 (二)溶液的溫度 溫度對(duì)化學(xué)反應(yīng)的影響很大，一般溫度每升高10，可使反應(yīng)速度增加24倍。 四、鑒別試驗(yàn)條件(Require of Identification test)(三)溶液的酸堿度 許多鑒別反應(yīng)都需要在一定酸堿度的條件下才能進(jìn)行。溶液酸堿度的作用，在于使各反應(yīng)物有足夠的濃度處于反應(yīng)活化狀態(tài)使反應(yīng)生成物處于穩(wěn)定和易于觀測(cè)的狀態(tài)。(四)干擾成分的存在 在鑒別試驗(yàn)中，如藥物結(jié)構(gòu)中的其它部分或藥物制劑中的其它組分也可參加鑒別反應(yīng)。產(chǎn)生干擾鑒別試驗(yàn)結(jié)果的現(xiàn)象，就會(huì)混淆試驗(yàn)結(jié)果。解決方法：選擇專屬性更高的鑒別反應(yīng)將其消除或?qū)⑵浞蛛x。 (五)試驗(yàn)時(shí)間 有機(jī)化合物的化學(xué)反應(yīng)和無(wú)機(jī)化合物不同

18、，一般反應(yīng)速度較慢，達(dá)到預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果需要較長(zhǎng)的時(shí)間。這是因?yàn)橛袡C(jī)化合物是以共價(jià)鍵相結(jié)合化學(xué)反應(yīng)能否進(jìn)行，依賴于共價(jià)鍵的斷裂和新價(jià)鍵形成的難易。因此、使鑒別反應(yīng)完成需要定時(shí)間。（六）反應(yīng)的介質(zhì) 多以水為介質(zhì)，但有些以乙醇或其他溶媒為介質(zhì)，介質(zhì)不一樣結(jié)論不一樣。五、鑒別實(shí)驗(yàn)的靈敏度 (Identification Tests sensitivity) (一) 反應(yīng)靈敏度和空白實(shí)驗(yàn) 1、反應(yīng)靈敏度 在一定條件下，能在盡可能稀的溶液中觀測(cè)出盡可能少量的供試品，反應(yīng)對(duì)這一要求所能滿足的程度,即稱為反應(yīng)的靈敏度（ sensitivity），以最低檢出量（ minimum detectable quantity ）和最低檢出濃度（ minimum detectable concentration ）來(lái)表示。 最低檢出濃度就是應(yīng)用某一反應(yīng)，在一定條件下，能夠觀測(cè)出供試品的最低濃度，通常以1：G(或1：V)表示，其中G(V)表示含有1g重某供試品的溶液的克(ml)數(shù)。 2、空白試驗(yàn) 為了消除試劑和器皿可能帶來(lái)的影響,應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)以供對(duì)照，所謂空白試驗(yàn)（blank test），