抗腫瘤藥物篩選方法

1、關(guān)于抗腫瘤藥物的篩選方法第一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、導(dǎo)論二、整體動(dòng)物水平的篩選三、細(xì)胞水平的篩選四、酶水平的篩選五、展望第二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、導(dǎo)論 1. 腫瘤發(fā)病率和死亡率 全球每年癌癥新發(fā)病例都在1200萬(wàn)以上，因癌癥死亡人數(shù)達(dá)760多萬(wàn)，到2010年底全球腫瘤病人總數(shù)已逾5500萬(wàn)人 (WHO)。心臟病腦血管病腫瘤25%消化系統(tǒng)病肺病其他第三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月中國(guó)每年新增腫瘤病人200萬(wàn)人，死亡130-170多萬(wàn)人左右，目前全國(guó)腫瘤患者總數(shù)約450萬(wàn)人，并以每年3%的速度遞增。腫瘤已經(jīng)成為中國(guó)公民的頭號(hào)殺手，每

2、年因惡性腫瘤而死亡的人口占到總死亡率的22%。2009年中國(guó)居民主要疾病死亡率及死亡原因構(gòu)成死亡原因死亡率(1/10萬(wàn))占總死亡人數(shù)百分率惡性腫瘤13522%腦血管病111 20%心臟病9618%呼吸系統(tǒng)病7215%損傷和中毒315%消化系統(tǒng)病175%糖尿病171%(中國(guó)衛(wèi)生年鑒)第四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月9年中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤的死亡率 我國(guó)居民常見(jiàn)癌癥死亡率: 胃癌列腫瘤死亡率首位; 其次肝癌、肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌等。第五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 腫瘤的治療方法外科手術(shù)治療放射線(xiàn)治療化學(xué)藥物治療第六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.

3、 常用的化療藥物烷化劑 環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺抗代謝藥物 甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷抗腫瘤抗生素 柔紅霉素、阿霉素、絲裂霉素、多柔比星鉑類(lèi)化合物 順鉑、卡鉑、奧沙利鉑抗腫瘤植物藥 長(zhǎng)春新堿、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇激素類(lèi) 血管新生抑制劑 貝伐珠單抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼 第七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月化療藥物的主要不良反應(yīng)骨髓抑制（血細(xì)胞減少）胃腸道反應(yīng)（惡心、嘔吐、食欲不振等）全身反應(yīng)（脫發(fā)、發(fā)熱、皮疹）對(duì)各器官影響 （心臟毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性）泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性腎?。┚植快o脈炎致畸、致突變、致癌第八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.

4、天然產(chǎn)物與抗腫瘤藥物 天然產(chǎn)物在新藥及新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著不可替代的作用，是結(jié)構(gòu)新穎和作用獨(dú)特的抗腫瘤化合物的重要來(lái)源。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）從1955年開(kāi)始從天然產(chǎn)物中篩選抗腫瘤藥物。目前世界上被批準(zhǔn)廣泛使用的抗腫瘤藥物中,以上來(lái)源于天然產(chǎn)物。第九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、整體動(dòng)物水平的篩選 非實(shí)體瘤動(dòng)物模型腫瘤名稱(chēng)代號(hào)宿主腫瘤名稱(chēng)代號(hào)宿主艾氏腹水瘤ECAKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤腹水型S180AKM小鼠BALB/c小鼠肝癌腹水瘤HepAKM小鼠BALB/c小鼠白血病L1210DBA小鼠白血病P388KM小鼠BALB/c小鼠白血病P615615小鼠常用小鼠

5、腹水瘤動(dòng)物模型表（細(xì)胞株及動(dòng)物）國(guó)內(nèi)外推薦模型第十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 腫瘤移植方法： 1）無(wú)菌操作 2）接種部位：腹腔 3）癌細(xì)胞懸液的制備及接種 接種710天小鼠處死，酒精消毒，穿過(guò)腹 部肌肉吸取腹水24 mL*，置冰塊上保存。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，PBS稀釋制備1x107/0.1 mL細(xì)胞濃度懸液，每只小鼠注射0.2 mL 腫瘤細(xì)胞懸液注射到腹腔。5天左右，小鼠出現(xiàn)腹水即為造模成功。 *腹水應(yīng)為白色濃稠液體，若為黃色或紅色應(yīng)棄去第十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月給藥及藥效評(píng)價(jià)：動(dòng)物分組：隨機(jī)分五組（溶劑對(duì)照組、陽(yáng)性藥組、高、中、低 給藥組）；每組8-10只。

6、藥品制備：藥品溶解生理鹽水或PBS等緩沖鹽溶液給藥方式：連續(xù)給藥；1-2次/天;（ig,ip,iv）14天以上評(píng)價(jià)指標(biāo)：觀察記錄荷瘤小鼠的存活天數(shù)（30天） （7天死亡率20%或20%動(dòng)物存活超過(guò)4周，實(shí)驗(yàn)失敗 對(duì)照組存活時(shí)間14-20天）數(shù)據(jù)處理：生命延長(zhǎng)率(%) 治療組存活天數(shù)對(duì)照組存活天數(shù) 對(duì)照組存活天數(shù) 非腹腔給藥生命延長(zhǎng)率50% 腹腔給藥75%x100%第十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月. 實(shí)體瘤動(dòng)物模型1）動(dòng)物移植性腫瘤腫瘤名稱(chēng)代號(hào)宿主腫瘤名稱(chēng)代號(hào)宿主艾氏癌實(shí)體型ECSKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤S180KM小鼠BALB/c小鼠肝癌實(shí)體型HepSKM小鼠BALB/c

7、小鼠黑色素瘤B16C57BL/6小鼠BALB/c小鼠肺癌LewisC57BL/6小鼠BALB/c小鼠結(jié)腸癌C26BALB/c小鼠瓦克癌肉瘤W256Wistar大鼠結(jié)腸癌C38BALB/c小鼠常用小鼠、大鼠實(shí)體瘤動(dòng)物模型表（細(xì)胞株及動(dòng)物）國(guó)內(nèi)外推薦模型第十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 腫瘤移植方法： 1）無(wú)菌操作 2）接種部位：右前肢腋下 3）癌塊的制備及接種 接種710天小鼠處死，酒精消毒，切開(kāi)皮膚取出腫瘤塊，置于生理鹽水中，冰塊上保存。剪碎瘤塊成2-3 mm3的小塊或組織塊勻漿成細(xì)胞懸液，接種到右前肢腋下。5天左右，小鼠出現(xiàn)瘤塊即為造模成功。 7天后對(duì)照組20%小鼠腫瘤小于

8、400 mg或大于2g，實(shí)驗(yàn)失敗 第十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月給藥及藥效評(píng)價(jià)：給藥方式：連續(xù)給藥；1-2次/天;（ig,ip,iv）10-12天評(píng)價(jià)指標(biāo)：記錄小鼠的體重變化。12天后，處死小 鼠，撥瘤稱(chēng)重（對(duì)照組瘤重1 g左右）。 取脾臟和胸腺稱(chēng)重，并測(cè)定脾細(xì)胞數(shù)目數(shù)據(jù)處理：抑瘤率(%) 對(duì)照組瘤重治療組瘤重 對(duì)照組瘤重 抑瘤率30% 認(rèn)為有效x100%第十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月）人癌異種移植模型細(xì)胞：人源肝癌，胃癌，肺癌，結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞動(dòng)物： 裸鼠 （nude mice） 特點(diǎn)： 1）裸體，行似無(wú)毛； 2）不能執(zhí)行正常T細(xì)胞功能，免疫力低下 3

9、）B細(xì)胞功能正常，NK細(xì)胞活性高T淋巴功能缺陷先天性無(wú)胸腺小鼠 11號(hào)染色體上隱性 突變裸基因（nu）第十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 腫瘤移植和給藥方法： 1）無(wú)菌操作 2）接種部位：背部 3）細(xì)胞懸液的制備及接種 細(xì)胞懸液濃度1x108/mL，接種0.1mL到背部。7天左右，瘤塊達(dá)到50 mm3體積即為造模成功，開(kāi)始給藥。 4）給藥時(shí)間：根據(jù)藥效確定，一般12-60天。 第十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月陽(yáng)性藥 5-Fu （5-氟尿嘧啶） ADM （阿霉素） Taxol（紫杉醇） CTX（環(huán)磷酰胺） 選擇性對(duì)照藥推薦劑量：1-20 mg/kg給藥方式：與測(cè)

10、試藥物相同;常隔天給藥 第十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月藥效評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)指標(biāo)：記錄小鼠的體重變化。結(jié)束治療后，處 死小鼠，撥瘤稱(chēng)重（對(duì)照組瘤重1 g左 右）。取脾臟稱(chēng)重，并測(cè)定脾細(xì) 胞數(shù)目。數(shù)據(jù)處理：抑瘤率(%)對(duì)照組腫瘤體積治療組腫瘤體積 對(duì)照組腫瘤體積 抑瘤率30% 認(rèn)為有效x100%第十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗腫瘤譜 Taxol （卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、食管癌、淋巴瘤） 5-Fu （乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、肝癌、宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌和頭頸部腫瘤） ADM （ 乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮膚癌）第二十張，PPT共一

11、百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月沙蟾毒精的體內(nèi)抗腫瘤作用 (Carcinogenesis, 2013, 34:1331)第二十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、細(xì)胞水平的篩選1. 抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)2. 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)3. 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)4. 抗腫瘤血管生成實(shí)驗(yàn)5. 腫瘤多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)6. 抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)7. 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)第二十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞株的選擇第二十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月. 抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)A) 噻唑蘭實(shí)驗(yàn)（MTT） 原理： 活細(xì)胞線(xiàn)粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的MTT，生成藍(lán)紫

12、色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在570 nm 處進(jìn)行測(cè)定。甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目。第二十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月MTT 原理示意圖甲臜生成量正比于活細(xì)胞數(shù)采用比色法（570 nm）測(cè)定甲臜生成量第二十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)方法1）細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)液：RPMI 1640、DMEM、MEM、 M199、McCoys5A等 血清： FBS、NBS、 抗生素：青霉素、鏈霉素、慶大霉素、 新生霉素等 胰酶： Trypsin-EDTA 、Collagenase 緩沖液： PBS、HB

13、SS等 生長(zhǎng)因子：EGF、B-27、N-2等第二十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2）細(xì)胞傳代 貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)3-5天，80%融合度。用胰酶消化1-3 min后，離心，調(diào)節(jié)適當(dāng)密度重新懸浮在培養(yǎng)液中。 3）細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞計(jì)數(shù)板第二十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 5）細(xì)胞接種 3000-10000細(xì)胞接種在96孔板，貼壁 24小時(shí)，或?qū)?shù)生長(zhǎng)期 6）加藥處理72 h（指定時(shí)間點(diǎn)） 7）MTT溶液（5 mg/ml） ，孵育2-4小時(shí) 8）棄去培養(yǎng)液，加入DMSO溶解生成的 甲臜 9）酶標(biāo)儀測(cè)定OD值 第二十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果處理：腫瘤

14、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（ OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn)）OD對(duì)照X 100%根據(jù)生長(zhǎng)抑制的量效曲線(xiàn)求出IC50 值腫瘤細(xì)胞存活率（%）=OD實(shí)驗(yàn)OD對(duì)照X 100%第二十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月AB問(wèn)題：根據(jù)上圖中細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線(xiàn)， 判斷化合物A和B哪一個(gè)具有較好的 腫瘤生長(zhǎng)抑制作用？ 第三十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月）磺酰羅丹明B （SRB）實(shí)驗(yàn)原理： SRB是粉紅色的氨基甲氧雜蒽類(lèi)化合物，是蛋白結(jié)合染料，與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合后呈粉紅色，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。 細(xì)胞中的蛋白含量與吸光度成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目和活性。第三十一張，PPT

15、共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月方法： 類(lèi)似于法，10-20%三氯乙酸固定1 h 后，加入0.5-1%染色30 min，洗去 染料，空氣干燥后，加入10 mM Tris 溶解 后，50 nm測(cè)定光密度結(jié)果處理：同法第三十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月）細(xì)胞排染法（酞酚藍(lán)）原理： 細(xì)胞損傷或死亡后細(xì)胞膜完整性被破壞，正 常細(xì)胞排染，而死亡細(xì)胞染成藍(lán)色。伊紅、苯胺黑等染料第三十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞死亡率（%）對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)給藥組活細(xì)胞數(shù)對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)X100%=結(jié)果：方法： 細(xì)胞懸液加入酞酚藍(lán)染色液混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞（未染色）和死細(xì)胞

16、數(shù)目（藍(lán)色）第三十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月. 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)NBT還原法原理：硝基藍(lán)四氮唑蘭(NBT) 還原法測(cè)定細(xì)胞株分化誘導(dǎo)。正常的中性粒細(xì)胞內(nèi)磷酸戊糖支路活躍, 細(xì)胞內(nèi)還原型輔酶含量增加, 將可溶性NBT還原為不溶性藍(lán)紫色顆粒, 而沉積于細(xì)胞漿內(nèi)。方法：HL-60 細(xì)胞株是篩選分化誘導(dǎo)劑的,藥物作用后, 細(xì)胞形態(tài)向粒細(xì)胞方向分化。結(jié)果：顯微鏡計(jì)數(shù)NBT還原陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算誘導(dǎo)分化率第三十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月對(duì)照組藥物處理組第三十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月. 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)）形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡）原理：細(xì)胞超微結(jié)

17、構(gòu)觀察方法：藥物處理后，收集細(xì)胞，4%戊二醛固定2 h以上，PBS清洗，1%俄酸固定1 h,酒精丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片做成銅網(wǎng)，經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察拍照。第三十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月對(duì)照組凋亡細(xì)胞正常細(xì)胞胞質(zhì)散在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜清楚、染色質(zhì)均勻、核仁明顯。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、致密，沿核分布形成新月體狀，有凋亡小體出現(xiàn)。對(duì)照組第三十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月壞死線(xiàn)粒體腫脹 凋亡細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的線(xiàn)粒體腫脹。壞死細(xì)胞細(xì)胞膜不完整，核膜破裂，染色質(zhì)呈蟲(chóng)蝕狀溶解。第三十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月B）DNA形態(tài)觀察（

18、Hoeschst333258）原理： Hoeschst333258與DNA特異性結(jié)合發(fā)出藍(lán)色熒光方法：腫瘤細(xì)胞用Hoeschst333258染色后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果：活細(xì)胞成均勻的淡熒光，調(diào)亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)強(qiáng)熒光的顆粒狀物質(zhì)。第四十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月對(duì)照組藥物處理組第四十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月C）染色體斷裂測(cè)定原理：凋亡細(xì)胞內(nèi)源性核酸酶激活，鏈被切割成200 bp不同倍數(shù)的片段，將這些片斷進(jìn)行電泳，可觀察到梯帶方法：裂解腫瘤細(xì)胞，消化蛋白，提取，上凝膠電泳，染色后，燈下觀察。結(jié)果：凋亡細(xì)胞顯示梯帶。第四十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)

19、作于2022年6月 CTLDRUG1DRUG2 MARKER第四十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月）PI/Annexin-FITC雙染色分析 原理：調(diào)亡細(xì)胞磷脂酰絲氨酸（PS）暴露于細(xì)胞表面，PS結(jié)合標(biāo)記熒光素FITC的Annexin-V但細(xì)胞膜仍然完整，熒光染料不能進(jìn) 入，而調(diào)亡晚期的細(xì)胞可同時(shí)受Annexin-V 和PI的雙標(biāo)記。 方法：腫瘤細(xì)胞同時(shí)加入Annexin-和染色，用流式細(xì)胞儀分析。第四十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月正常細(xì)胞Annexin-V (-)PI (-)晚期凋亡細(xì)胞Annexin-V (+)PI (+)早期凋亡細(xì)胞Annexin-V (+

20、)PI (-)Annexin-VPI第四十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PI/AnnexinV-FITC 雙染激光共聚焦分析結(jié)果PI紅色熒光細(xì)胞核AnnexinV-FITC綠色熒光細(xì)胞膜第四十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Annexin-V-FITCPI 對(duì)照組藥物處理組第四十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月. 抗腫瘤血管生成實(shí)驗(yàn) 腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與新生血管形成密切相關(guān)，當(dāng)腫瘤直徑超過(guò)2 mm時(shí),直接由微環(huán)境提供的營(yíng)養(yǎng)就不能滿(mǎn)足其生長(zhǎng)需要,此時(shí)腫瘤的生長(zhǎng)依賴(lài)于新生血管運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 腫瘤血管生成抑制劑能抑制血管生成,阻止腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，在治療腫

21、瘤中具有高效、廣普、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。第四十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月）血管內(nèi)皮細(xì)胞體外篩選模型原理：體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在含生長(zhǎng)因子條件下 能形成細(xì)胞條索，然后形成管狀。腫瘤血管生 成抑制劑能抑制細(xì)胞管腔的形成。方法：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在含有藥物和不含有TAI 藥物的膠原凝膠中分別培養(yǎng)后,在顯微鏡下比較 它們形成的管腔數(shù)目。 對(duì)照組藥物處理組第四十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月）雞胚絨毛尿囊膜血管新生模型原理：雞卵在胚胎發(fā)育過(guò)程中，尿囊膜上的血管生長(zhǎng)很旺盛，將不同藥物作用于尿囊膜，觀察該膜上的血管生長(zhǎng)。方法：雞胚胎放在直培養(yǎng)皿內(nèi), 在無(wú)菌

22、恒溫箱中孵育到第9 天的生長(zhǎng)高峰時(shí),將浸泡過(guò)藥物 的明膠海綿置于雞胚絨毛尿囊膜表面，培養(yǎng)天，在顯微鏡下隨機(jī)取幾個(gè)視野點(diǎn),記數(shù)“熱點(diǎn)”區(qū)的新生血管數(shù),計(jì)算平均值。第五十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月血管生成抑制率（%）對(duì)照組血管面積給藥組血管面積對(duì)照組血管面積X100%結(jié)果：CTL低劑量藥物高劑量藥物組第五十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月）斑馬魚(yú)血管新生模型 斑馬魚(yú)被廣泛地應(yīng)用于藥物篩選方面的研究。主要用于篩選抗血管生成藥物。 其胚胎早期發(fā)育的過(guò)程中,血管生成的模式比較簡(jiǎn)單, 主要出現(xiàn)在頭部和軀干部體節(jié)間,體節(jié)間的血管最初由背部的動(dòng)脈出芽形成于相鄰體節(jié)之間。斑馬魚(yú)胚

23、胎第五十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月方法：在96 孔板上用藥物處理胚胎,通過(guò)血管內(nèi)源 性堿性磷酸酶染色來(lái)顯示血管,進(jìn)而評(píng)價(jià)藥物對(duì)血管生成的作用。結(jié)果： 第五十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月耐藥性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 腫瘤細(xì)胞耐藥性，分先天性耐藥性和獲得性耐藥性，也可分為原藥耐藥性和多藥耐藥性。多藥耐藥性基因mdr1編碼表達(dá)P-糖蛋白（P-gp）是產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制。P-gp將化療藥物泵出體外，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度。 ）腫瘤耐藥性體外模型的建立 逐步增加腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中抗癌藥物的濃度（Dox）誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤耐藥株。用MT

24、T法檢測(cè)藥物對(duì)敏感株和耐藥株的細(xì)胞毒性，同時(shí)測(cè)定mdr1基因和P-gp表達(dá)水平。第五十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月耐藥株敏感株P(guān)-gp敏感株耐藥株第五十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2) 逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性作用的藥物篩選方法：采用MTT法測(cè)定加逆轉(zhuǎn)劑前后DOX對(duì)耐藥株的細(xì)胞 毒性。計(jì)算逆轉(zhuǎn)效果.FR (逆轉(zhuǎn)倍數(shù))=IC50(不加逆轉(zhuǎn)劑) / IC50(加逆轉(zhuǎn)劑）IC50 (耐藥性肝癌細(xì)胞株R-HepG2)FRDox 160 uMDox +Vep 31 uM5第五十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Effect of NSC23925 to reve

25、rse drug resisitance in MDR cell lines第五十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 用熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)加藥前后耐藥細(xì)胞株內(nèi)抗癌藥多柔比星Dox的含量。Control0.5 uM Dox +1 uM Vep0.5 uM Dox0.5 uM Dox +5 uM Vep0.5 uM Dox +10 uM Vep第六十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HepG/ADM ControlVerapamil 5 mMDrug 1.25 mMDrug 2.5 mMDrug 5 mM

26、多柔比星累積實(shí)驗(yàn)第六十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Rhm123累積實(shí)驗(yàn)ControlVerapamil 5 mMDrug 1.25 mMDrug 2.5 mMDrug 5 mM第六十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6. 抗腫瘤侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征腫瘤的遷移是一個(gè)多階段的復(fù)雜過(guò)程，Liotta等提出腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的三步學(xué)說(shuō)，即粘附、降解和移動(dòng)。粘附是腫瘤細(xì)胞侵襲的起始，腫瘤細(xì)胞通過(guò)表面特定受體與基底膜的層粘連蛋白、纖維連接蛋白和型膠原等相粘連，然后在蛋白水解酶和相關(guān)因子的作用下，侵襲基底膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)腫瘤細(xì)胞一旦突破基底膜，逃避免疫監(jiān)視，即

27、在基質(zhì)內(nèi)較快侵襲性生長(zhǎng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移。阻斷其中任何一個(gè)過(guò)程，都可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲第六十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月）粘附實(shí)驗(yàn)原理：將Matrigel鋪在96孔板上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結(jié)構(gòu)，可以有效地在體外模擬腫瘤細(xì)胞的粘附過(guò)程。 方法：將Matrigel包被96孔板，過(guò)夜，將藥物處理后的細(xì)胞接種在96孔板，1h后，棄去未粘附的細(xì)胞，加入MTT培養(yǎng)，測(cè)定吸光度。 結(jié)果：細(xì)胞粘附 抑制率（%）=（ OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn)）OD對(duì)照X 100%第六十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)）方法：細(xì)胞按30000個(gè)/孔密度接種于

28、6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到90%融合度，用20 uL移液器槍頭在每孔劃出十字形劃痕，PBS清洗后，加入藥物處理后（無(wú)血清培養(yǎng)基），顯微鏡下觀察拍照。第六十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月A B C D EA: Control; B: Drug 20 nmolL-1; C: Drug 30 nmolL-1; D: Drug 40 nmolL-1; E: Drug 50 nmolL-1細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)第六十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Transwell技術(shù)3）細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)第六十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原理：腫瘤細(xì)胞在趨化因子的作用下可 穿透

29、聚碳酸酯膜，從上室轉(zhuǎn)移到下室，有些藥物可抑制這種遷移。方法： （1）Transwell小室的制備 Matrix包被并水化基底膜（2）制備細(xì)胞懸液 110 x 105的細(xì)胞/200 uL（3）細(xì)胞接種 下室20% FBS的培養(yǎng)液，上室無(wú)血清培養(yǎng)液（4）細(xì)胞培養(yǎng)24-48 h（5）細(xì)胞染色，拍照并計(jì)數(shù)第六十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月A: Control; B: Drug 20 nmolL-1; C: Drug 30 nmolL-1; D: Drug 40 nmolL-1; E: Drug 50 nmolL-1細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)第六十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)

30、胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)A: Control; B: Drug 20 nmolL-1; C: Drug 30 nmolL-1; D: Drug 40 nmolL-1; E: Drug 50 nmolL-1第七十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6.自噬實(shí)驗(yàn)自噬： 是以細(xì)胞器的自我消化和更新為特征生化過(guò)程過(guò)程： 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。 生物功能：一般認(rèn)為自噬是保護(hù)細(xì)胞，但是也可以誘導(dǎo)細(xì)胞 發(fā)生自噬性死亡。第七十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于

31、2022年6月自噬過(guò)程第七十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月自噬的特征第七十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月自噬的檢測(cè)MDC法 原理：自噬小泡呈偏酸性，綠色的熒光 染料能選擇性聚集方法：加入（）處理15min 后， 激光共聚焦顯微鏡觀察第七十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月LC3-GFP原理：LC3-GFP綠色熒光蛋白克隆細(xì)胞株，出現(xiàn)自噬時(shí)伴隨LC3高表達(dá)，呈現(xiàn)綠色熒光染料方法：藥物處理預(yù)定時(shí)間后，激光共聚焦顯微鏡觀察第七十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月相關(guān)蛋白表達(dá)LC3Atg5Beclin 1p62第七十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作

32、于2022年6月四、酶水平的篩選拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑篩選 端粒酶酶抑制劑篩選 VEGFR 酪氨酸蛋白激酶酶抑制劑篩選 組蛋白去乙酰酶抑制劑篩選基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑篩選法基尼轉(zhuǎn)移酶抑制劑篩選絲裂原活化蛋白激酶抑制劑篩選第七十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑篩選 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種重要的核酶，通過(guò)DNA鏈斷裂和重接而改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)其空間構(gòu)型變化，在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用第七十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月方法：裂解細(xì)胞, 提取拓?fù)洚悩?gòu)酶, 測(cè)定酶總量或酶活 性的變化, 在酶反應(yīng)體系中，加入負(fù)超螺旋 pBR322 質(zhì)粒DNA, TOPO 酶

33、提液及不同濃度的藥 物，溫育30 min后，加入反應(yīng)終止液，在瓊脂糖 凝膠中電泳, 溴化乙錠染色紫外燈下觀察。結(jié)果：第七十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月端粒酶抑制劑篩選 端粒是染色體特殊結(jié)構(gòu), 起著保護(hù)染色體的完整和穩(wěn)定性的作用, 端粒酶是一種核糖核蛋白反轉(zhuǎn)錄酶, 可以自身RNA為模板合成端粒末端。正常細(xì)胞端粒酶活性是陰性, 而在腫瘤細(xì)胞株表達(dá)高活性。第八十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月方法：裂解細(xì)胞，提取蛋白，測(cè)定蛋白含量，擴(kuò)增，凝膠電泳，銀染色結(jié)果：端粒是由短DNA 重復(fù)序列組成,而端粒酶的作 用是維持端粒末端的長(zhǎng)度,因此PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 間接反映端粒酶活性。

34、第八十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性的影響第八十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月VEGFR酪氨酸蛋白激酶抑制劑篩選 VEGFR 受體酪氨酸蛋白激酶能特異性地將磷酸根轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上使其磷酸化，酪氨酸激酶的異常表達(dá)還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤新生血管的生成，腫瘤的化療抗性密切相關(guān)。 以酪氨酸激酶為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)成為國(guó)際上抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。第八十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)示意圖第八十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月腫瘤相關(guān)的受體酪氨酸激酶第八十五張，PPT共一百零五頁(yè)，

35、創(chuàng)作于2022年6月 ELISA方法： 以96孔酶標(biāo)板作為實(shí)驗(yàn)容器,加入包被液谷氨酸酪氨酸多聚多肽，孵育過(guò)夜。加入受試物和酪氨酸激酶反應(yīng)1 h后，加入辣根過(guò)氧化物 酶標(biāo)記的小鼠抗磷酸化酪 氨酸單克隆抗體,室溫反應(yīng) 30 min后, 用酶標(biāo)儀讀 取吸光度(OD)值。 第八十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Q and AODODODInhibition rate (%)Blank0.0140.0150.013CTL(1 U Trk)0.5740.5820.5980.5 uM VA(1 U Trk)0.4350.4120.4061 uM VA(1 U Trk)0.2560.2130.2

36、455 uM VA(1 U Trk)0.1020.0980.123 試求出不同濃度對(duì)酪氨酸蛋白激酶的抑制率第八十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月組蛋白去乙酰酶抑制劑篩選 組蛋白是核小體的重要組成部分，組蛋白的乙?；?，DNA構(gòu)象易于展開(kāi)，核小體的結(jié)構(gòu)松弛，利于轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄活化因子與DNA的接觸，激活基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。 第八十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 組蛋白乙?；福℉AC）和去乙酰化酶（HDAC）的協(xié)同調(diào)節(jié)作用決定了組蛋白和部分非組蛋白的乙?；?，是特定基因表達(dá)的切換開(kāi)關(guān)。 組蛋白去乙?；敢种苿┛赏ㄟ^(guò)組蛋白和非組蛋白的乙?；钄嗉?xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑某些蛋

37、白的活化，而發(fā)揮抗腫瘤活性。第八十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原理：含乙?；?lài)氨酸的短肽被HDAC區(qū)去乙酰 化后，發(fā)出熒光（353 nm 和448 nm）. Boc-(Ac)Lys-AMC + HDAC Boc-Lys-AMC 無(wú)熒光 熒光 方法：在96孔板中依次加入反應(yīng)緩沖液、短肽 底物、HDAC酶以及不同濃度的抑制 劑，37孵育30-60 min，加入顯色液 終止反應(yīng)，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度第九十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Trichostatin A抑制HDAC酶活性第九十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑篩選基質(zhì)金屬蛋

38、白酶（MMPs）為膠原酶，是一種金屬離子依賴(lài)的蛋白酶，可有效降解基底膜的主要成分膠原及明膠，它的異常表達(dá)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMPs其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì),參與血管形成、炎癥、腫瘤的侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等。 第九十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 原理：熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET） FRET肽段底物經(jīng)MMPs酶催化斷裂， EDAN片段發(fā)出熒光（340/490 nm）第九十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月方法：在96孔或84孔板中依次加入反應(yīng)緩沖 液、FRET肽底物、MMP酶及抑制劑混 勻，5-60 min 內(nèi)連續(xù)測(cè)量熒光強(qiáng)度。試驗(yàn)組設(shè)置: 陽(yáng)性對(duì)照組（含MMP酶） 抑制劑組（含MMP酶和抑制劑） 溶劑對(duì)照組（含MMP酶和測(cè)試溶劑） 底物對(duì)照組（僅有底物） 測(cè)試藥物組（含MMP酶和測(cè)試藥物）第九十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月法尼基轉(zhuǎn)移酶（Ras）抑制劑篩選 Ras蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的信號(hào)通路的重要元件, 是控制外來(lái)分子信號(hào)的分子開(kāi)關(guān)。Ras蛋白以GDP結(jié)合和GTP結(jié)合兩種形式存在。第九十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原理： (pull down ass