免疫熒光染色方法介紹

1、細(xì)胞免疫熒光-多重染色1.原理介紹我們現(xiàn)在來(lái)考慮一下多重染色。使用多個(gè)標(biāo)簽進(jìn)行免疫染色的目的，是在同一細(xì)胞或 組織切片里，同時(shí)對(duì)兩個(gè)或多個(gè)抗原進(jìn)行染色定位。各個(gè)抗原分別使用不同的標(biāo)簽，以便 區(qū)分。抗原可以是共定位的，即它們的亞細(xì)胞定位一致，或者是分開的。熒光的作用原理。熒光分子能吸收特定波長(zhǎng)的光，然后發(fā)射更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。在發(fā)出熒 光之前，熒光分子跟環(huán)境相互作用失去能量，從而達(dá)到這一目的，這一現(xiàn)象叫內(nèi)轉(zhuǎn)換。電子可以是基態(tài)或靜止態(tài)S0，也可以是較高能量的激發(fā)態(tài)S1和S2。在每一個(gè)電子 態(tài)，熒光染料存在的振動(dòng)能級(jí)可以有多種，包括0級(jí)、1級(jí)和2級(jí)。室溫下，能量不足以 使電子激發(fā)到激發(fā)態(tài)S1和S2或基態(tài)的

2、較高振動(dòng)能級(jí)。所以，只有當(dāng)光存在時(shí)，吸收才 發(fā)生在振動(dòng)能態(tài)最低的分子上。熒光染料在吸收光后，通常被激發(fā)至一個(gè)較高的振動(dòng)能級(jí)S1或S2，然后再回到S1 的最低振動(dòng)能級(jí)，從而完成內(nèi)轉(zhuǎn)換過(guò)程。此過(guò)程與光子發(fā)射過(guò)程結(jié)合形成熒光。熒光染料 可多次重復(fù)這一激發(fā)發(fā)射循環(huán)，直至熒光消失，也就是光漂白。相較而言，有些熒光素更 容易發(fā)生光漂白。例如，F(xiàn)ITC重復(fù)激發(fā)發(fā)射循環(huán)約30000次后發(fā)生光漂白。而第二代熒 光染料，如Alexa Fluor系列的光漂白沒有這么快，由于它們有較高的消光系數(shù)，比較明 亮，更適合用于多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，如本幻燈片圖像所示常用到的一種傳統(tǒng)染料的組合是：DAPI藍(lán)色染料、FITC綠色染料、TR

3、ITC黃色染料 和Cy5紅色染料。而相應(yīng)的第二代染料組合是：DAPI藍(lán)色染料、Alexa Fluor 488綠 色染料、Alexa Fluor 555黃色染料和Alexa Fluor 647紅色染料設(shè)計(jì)熒光多重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以采取以下幾個(gè)步驟，以最大限度的減小或消除串色現(xiàn) 象。首先，分析待選熒光素的吸收光譜和發(fā)射光譜，結(jié)合顯微鏡濾光片組的特點(diǎn)，評(píng)估是 否兼容。盡量選擇發(fā)射帶寬窄的熒光素，以最大限度的減小與其它熒光素光譜的重疊。使 用最明亮的熒光素來(lái)標(biāo)記表達(dá)豐度最低的蛋白。如果蛋白的豐度相近，則適當(dāng)降低波長(zhǎng)最 短的熒光素的使用濃度，從而減小到較長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光素的串色程度。仔細(xì)選擇顯微鏡的濾光 片組，

4、盡可能的匹配每種熒光素的吸收光譜和發(fā)射光譜。調(diào)整顯微鏡的曝光，增益與減光鏡設(shè)置，微調(diào)過(guò)強(qiáng)的熒光信號(hào)。最后，在多重染色之 前，分別進(jìn)行單染預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用其它濾光片來(lái)觀察評(píng)估串色問(wèn)題。并根據(jù)上述參數(shù)調(diào)整實(shí) 驗(yàn)設(shè)計(jì)。2.方法現(xiàn)在讓我們來(lái)討論多重染色技術(shù)。簡(jiǎn)言之，多重染色實(shí)驗(yàn)是同時(shí)使用兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽 的染色技術(shù)。多重染色方案以本次講座前半部分為基礎(chǔ)，必要時(shí)加上孵育和清洗步驟。無(wú)論何種情況，都強(qiáng)烈推薦使用預(yù)吸附的二抗，有助于盡可能的減少交叉反應(yīng)。在多重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)烈建議先單獨(dú)優(yōu)化每種單標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)條件，然后才將它們組合起來(lái)主要關(guān)注 點(diǎn)是怎樣避免每一檢測(cè)體系的單個(gè)成分之間發(fā)生交叉反應(yīng)多重染色技術(shù)可分為兩種方

5、法：同步法，一抗同時(shí)孵育；逐步法，一個(gè)單標(biāo)記染色技術(shù)做 完后再做另一個(gè)。首先我們來(lái)看同步染色。如果一抗來(lái)源的種屬之間差異足夠大，那么它們可以同時(shí)孵育。 小鼠來(lái)源和兔來(lái)源的一抗組合，差異足夠大，而小鼠來(lái)源和大鼠來(lái)源的一抗組合則不然。 其次，如果二抗的種屬來(lái)源相同，可以同時(shí)孵育。如果抗體是直標(biāo)一抗，即一抗上直接偶 聯(lián)不同的標(biāo)記物，那么哪怕抗體的宿主來(lái)源相近甚至相同，也可以做到同步染色。當(dāng)然， 前提是抗原的表達(dá)豐度高，要求的信號(hào)放大程度低。如果抗體來(lái)源于同一物種，但是同種 型不同，那么使用針對(duì)相應(yīng)同種型的二抗，也可以進(jìn)行同步染色。大家可以看出，在同步 染色中，我們能做的很有限，尤其是在信號(hào)放大方面，

6、相較而言，這方面逐步染色更有優(yōu) 勢(shì)。比起同步染色，逐步染色靈活得多，對(duì)于低豐度的抗原，可以進(jìn)行額外的信號(hào)放大，而不 僅僅是使用二抗。對(duì)于豐度最低的抗原，應(yīng)使用最靈敏的檢測(cè)體系。需特別注意試劑的添 加順序。舉個(gè)例子，三個(gè)均源于小鼠的一抗：一個(gè)是熒光素直標(biāo)一抗，一個(gè)生物素直標(biāo)一 抗，一個(gè)是非直標(biāo)一抗。第一步：將樣本與非直標(biāo)小鼠一抗一起孵育。第二步：將樣本與熒光素標(biāo)記二抗一起孵育，如山羊抗小鼠二抗。第三步，將樣本與小鼠血清一起孵育，確保山羊抗小鼠二抗被封閉。第四步：將樣本與生物素化小鼠一抗一起孵育。第五步：將樣本與熒光素偶聯(lián)ABC復(fù)合物一起孵育。最后第六步：將樣本與熒光素直標(biāo)小鼠抗體一起孵育。這就是

7、三重染色，而試劑之間不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。還請(qǐng)注意，以上的每一步驟之間，需要 用緩沖液漂洗。使用同一種屬來(lái)源的抗體時(shí)，另一個(gè)方法是增加橋接抗體。舉個(gè)例子，兩個(gè)小鼠來(lái)源的一 抗：一個(gè)非直標(biāo)抗體，另一個(gè)是HRP直標(biāo)一抗。第一步：將樣本與非直標(biāo)一抗一起孵育。第二步：將樣本與熒光素標(biāo)記二抗一起孵育，如山羊抗小鼠二抗。第三步，將樣本與小鼠血清一起孵育，確保山羊抗小鼠二抗被封閉。第四步：將樣本與HRP直標(biāo)一抗一起孵育。第五步：將樣本與抗HRP的抗體（如兔抗）一起孵育。最后第六步：將樣本與熒光素偶聯(lián)山羊抗兔抗體一起孵育。第二種也可以換用生物素化的抗體和ABC體系。同樣，還請(qǐng)注意，以上各步驟之間，需 用緩沖液漂洗

8、。最后，讓我們考慮一下多重免疫染色時(shí)必須使用的對(duì)照組。對(duì)照組是非常必要的，用于驗(yàn) 證染色結(jié)果是否真實(shí)，而不是根據(jù)檢測(cè)體系或樣本特性。由于多重染色是兩個(gè)或多個(gè)單標(biāo) 記染色技術(shù)的組合，每一檢測(cè)體系所需的試劑對(duì)照數(shù)量相當(dāng)龐大?？紤]到時(shí)間限制，至少 要完成以下對(duì)照組。首先是陽(yáng)性對(duì)照，針對(duì)各個(gè)一抗。然后是陰性對(duì)照，針對(duì)每一檢測(cè)體 系，分別實(shí)施無(wú)一抗對(duì)照。我的講座差不多該結(jié)束了，但是關(guān)于多重染色，如果別的都忘了，那么請(qǐng)記住以下內(nèi)容。 只要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上多花功夫，可用的染色組合非常多。選擇發(fā)射光譜不重疊的熒光素，并 匹配顯微鏡的濾光片。認(rèn)真考慮各種可供選擇的檢測(cè)體系、潛在的交叉反應(yīng)以及試劑添加 順序。最后，一

9、定使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照，并單獨(dú)對(duì)每一個(gè)染色進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以便優(yōu)化各個(gè)試劑 的濃度并評(píng)估可能的串色。一般來(lái)說(shuō)，多重免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中二抗的選擇條件比較多：1，要使用間接標(biāo)記的熒光抗體1）應(yīng)用范圍廣；2）直接標(biāo)記的一抗經(jīng)過(guò)純化后標(biāo)記，擁有干凈的背景，適用于多染，但在IF多染實(shí)驗(yàn)的實(shí) 際應(yīng)用中很有限，且身披不菲的價(jià)格，對(duì)個(gè)人的實(shí)驗(yàn)條件有一定限制。2，二抗種屬來(lái)源需相同這是為防止不同種屬來(lái)源的二抗發(fā)生交叉反應(yīng)以及生成較高的背景一一若一抗A、B種屬 分別為 Rat、Rabbit，那么二抗的種屬必須為 donkey anti-Rat、donkey anti-Rabbit 或 goat anti-Rat、goat anti-Rabbit等。3，要選擇預(yù)吸附的二抗普通熒光二抗有可能與內(nèi)源性的免疫球蛋白發(fā)生相互作用，而預(yù)吸附的二抗則可以降低這 種情況的發(fā)生，從而提供很低的背景。4,二抗熒光顏色盡量差異大若選用熒光相近的粉色和粉紅或青綠和綠色則很有可能面臨拍出來(lái)的圖片存在串色的