免疫熒光染色方法介紹

1、細胞免疫熒光-多重染色1.原理介紹我們現(xiàn)在來考慮一下多重染色。使用多個標(biāo)簽進行免疫染色的目的，是在同一細胞或 組織切片里，同時對兩個或多個抗原進行染色定位。各個抗原分別使用不同的標(biāo)簽，以便 區(qū)分?？乖梢允枪捕ㄎ坏模此鼈兊膩喖毎ㄎ灰恢?，或者是分開的。熒光的作用原理。熒光分子能吸收特定波長的光，然后發(fā)射更長波長的光。在發(fā)出熒 光之前，熒光分子跟環(huán)境相互作用失去能量，從而達到這一目的，這一現(xiàn)象叫內(nèi)轉(zhuǎn)換。電子可以是基態(tài)或靜止態(tài)S0，也可以是較高能量的激發(fā)態(tài)S1和S2。在每一個電子 態(tài)，熒光染料存在的振動能級可以有多種，包括0級、1級和2級。室溫下，能量不足以 使電子激發(fā)到激發(fā)態(tài)S1和S2或基態(tài)的

2、較高振動能級。所以，只有當(dāng)光存在時，吸收才 發(fā)生在振動能態(tài)最低的分子上。熒光染料在吸收光后，通常被激發(fā)至一個較高的振動能級S1或S2，然后再回到S1 的最低振動能級，從而完成內(nèi)轉(zhuǎn)換過程。此過程與光子發(fā)射過程結(jié)合形成熒光。熒光染料 可多次重復(fù)這一激發(fā)發(fā)射循環(huán)，直至熒光消失，也就是光漂白。相較而言，有些熒光素更 容易發(fā)生光漂白。例如，F(xiàn)ITC重復(fù)激發(fā)發(fā)射循環(huán)約30000次后發(fā)生光漂白。而第二代熒 光染料，如Alexa Fluor系列的光漂白沒有這么快，由于它們有較高的消光系數(shù)，比較明 亮，更適合用于多標(biāo)記實驗，如本幻燈片圖像所示常用到的一種傳統(tǒng)染料的組合是：DAPI藍色染料、FITC綠色染料、TR

3、ITC黃色染料 和Cy5紅色染料。而相應(yīng)的第二代染料組合是：DAPI藍色染料、Alexa Fluor 488綠 色染料、Alexa Fluor 555黃色染料和Alexa Fluor 647紅色染料設(shè)計熒光多重標(biāo)記實驗時，可以采取以下幾個步驟，以最大限度的減小或消除串色現(xiàn) 象。首先，分析待選熒光素的吸收光譜和發(fā)射光譜，結(jié)合顯微鏡濾光片組的特點，評估是 否兼容。盡量選擇發(fā)射帶寬窄的熒光素，以最大限度的減小與其它熒光素光譜的重疊。使 用最明亮的熒光素來標(biāo)記表達豐度最低的蛋白。如果蛋白的豐度相近，則適當(dāng)降低波長最 短的熒光素的使用濃度，從而減小到較長波長熒光素的串色程度。仔細選擇顯微鏡的濾光 片組，

4、盡可能的匹配每種熒光素的吸收光譜和發(fā)射光譜。調(diào)整顯微鏡的曝光，增益與減光鏡設(shè)置，微調(diào)過強的熒光信號。最后，在多重染色之 前，分別進行單染預(yù)實驗，使用其它濾光片來觀察評估串色問題。并根據(jù)上述參數(shù)調(diào)整實 驗設(shè)計。2.方法現(xiàn)在讓我們來討論多重染色技術(shù)。簡言之，多重染色實驗是同時使用兩個或多個標(biāo)簽 的染色技術(shù)。多重染色方案以本次講座前半部分為基礎(chǔ)，必要時加上孵育和清洗步驟。無論何種情況，都強烈推薦使用預(yù)吸附的二抗，有助于盡可能的減少交叉反應(yīng)。在多重標(biāo)記實驗中，強烈建議先單獨優(yōu)化每種單標(biāo)記的實驗條件，然后才將它們組合起來主要關(guān)注 點是怎樣避免每一檢測體系的單個成分之間發(fā)生交叉反應(yīng)多重染色技術(shù)可分為兩種方

5、法：同步法，一抗同時孵育；逐步法，一個單標(biāo)記染色技術(shù)做 完后再做另一個。首先我們來看同步染色。如果一抗來源的種屬之間差異足夠大，那么它們可以同時孵育。 小鼠來源和兔來源的一抗組合，差異足夠大，而小鼠來源和大鼠來源的一抗組合則不然。 其次，如果二抗的種屬來源相同，可以同時孵育。如果抗體是直標(biāo)一抗，即一抗上直接偶 聯(lián)不同的標(biāo)記物，那么哪怕抗體的宿主來源相近甚至相同，也可以做到同步染色。當(dāng)然， 前提是抗原的表達豐度高，要求的信號放大程度低。如果抗體來源于同一物種，但是同種 型不同，那么使用針對相應(yīng)同種型的二抗，也可以進行同步染色。大家可以看出，在同步 染色中，我們能做的很有限，尤其是在信號放大方面，

6、相較而言，這方面逐步染色更有優(yōu) 勢。比起同步染色，逐步染色靈活得多，對于低豐度的抗原，可以進行額外的信號放大，而不 僅僅是使用二抗。對于豐度最低的抗原，應(yīng)使用最靈敏的檢測體系。需特別注意試劑的添 加順序。舉個例子，三個均源于小鼠的一抗：一個是熒光素直標(biāo)一抗，一個生物素直標(biāo)一 抗，一個是非直標(biāo)一抗。第一步：將樣本與非直標(biāo)小鼠一抗一起孵育。第二步：將樣本與熒光素標(biāo)記二抗一起孵育，如山羊抗小鼠二抗。第三步，將樣本與小鼠血清一起孵育，確保山羊抗小鼠二抗被封閉。第四步：將樣本與生物素化小鼠一抗一起孵育。第五步：將樣本與熒光素偶聯(lián)ABC復(fù)合物一起孵育。最后第六步：將樣本與熒光素直標(biāo)小鼠抗體一起孵育。這就是

7、三重染色，而試劑之間不會發(fā)生交叉反應(yīng)。還請注意，以上的每一步驟之間，需要 用緩沖液漂洗。使用同一種屬來源的抗體時，另一個方法是增加橋接抗體。舉個例子，兩個小鼠來源的一 抗：一個非直標(biāo)抗體，另一個是HRP直標(biāo)一抗。第一步：將樣本與非直標(biāo)一抗一起孵育。第二步：將樣本與熒光素標(biāo)記二抗一起孵育，如山羊抗小鼠二抗。第三步，將樣本與小鼠血清一起孵育，確保山羊抗小鼠二抗被封閉。第四步：將樣本與HRP直標(biāo)一抗一起孵育。第五步：將樣本與抗HRP的抗體（如兔抗）一起孵育。最后第六步：將樣本與熒光素偶聯(lián)山羊抗兔抗體一起孵育。第二種也可以換用生物素化的抗體和ABC體系。同樣，還請注意，以上各步驟之間，需 用緩沖液漂洗

8、。最后，讓我們考慮一下多重免疫染色時必須使用的對照組。對照組是非常必要的，用于驗 證染色結(jié)果是否真實，而不是根據(jù)檢測體系或樣本特性。由于多重染色是兩個或多個單標(biāo) 記染色技術(shù)的組合，每一檢測體系所需的試劑對照數(shù)量相當(dāng)龐大?？紤]到時間限制，至少 要完成以下對照組。首先是陽性對照，針對各個一抗。然后是陰性對照，針對每一檢測體 系，分別實施無一抗對照。我的講座差不多該結(jié)束了，但是關(guān)于多重染色，如果別的都忘了，那么請記住以下內(nèi)容。 只要在實驗設(shè)計上多花功夫，可用的染色組合非常多。選擇發(fā)射光譜不重疊的熒光素，并 匹配顯微鏡的濾光片。認(rèn)真考慮各種可供選擇的檢測體系、潛在的交叉反應(yīng)以及試劑添加 順序。最后，一

9、定使用適當(dāng)?shù)膶φ?，并單獨對每一個染色進行預(yù)實驗，以便優(yōu)化各個試劑 的濃度并評估可能的串色。一般來說，多重免疫熒光染色實驗中二抗的選擇條件比較多：1，要使用間接標(biāo)記的熒光抗體1）應(yīng)用范圍廣；2）直接標(biāo)記的一抗經(jīng)過純化后標(biāo)記，擁有干凈的背景，適用于多染，但在IF多染實驗的實 際應(yīng)用中很有限，且身披不菲的價格，對個人的實驗條件有一定限制。2，二抗種屬來源需相同這是為防止不同種屬來源的二抗發(fā)生交叉反應(yīng)以及生成較高的背景一一若一抗A、B種屬 分別為 Rat、Rabbit，那么二抗的種屬必須為 donkey anti-Rat、donkey anti-Rabbit 或 goat anti-Rat、goat anti-Rabbit等。3，要選擇預(yù)吸附的二抗普通熒光二抗有可能與內(nèi)源性的免疫球蛋白發(fā)生相互作用，而預(yù)吸附的二抗則可以降低這 種情況的發(fā)生，從而提供很低的背景。4,二抗熒光顏色盡量差異大若選用熒光相近的粉色和粉紅或青綠和綠色則很有可能面臨拍出來的圖片存在串色的