男性不育的試驗(yàn)室診斷及評(píng)價(jià)南京醫(yī)科大學(xué)

1、男性不育的試驗(yàn)室診斷及評(píng)價(jià)南京醫(yī)科大學(xué)維持男性生育的基本條件：（1）睪丸內(nèi)產(chǎn)生足夠數(shù)量的精子。（2）精子在男性生殖管道內(nèi)獲得運(yùn)動(dòng)能力和 受精能力，既精子的成熟。（3）輸精管道通暢。（4）具有正常的性功能。（5）附屬性腺功能正常。不育癥診斷的步驟：1.病史采集: 包括年齡、職業(yè)、生育史、疾 病史、家族史等。2.體格檢查：包括外生殖器和全身體檢。3.實(shí)驗(yàn)室診斷4.特殊檢查一、 精液常規(guī)分析精子（5%）精液組成 精囊腺液（60%）凝固因子、果糖精漿（95%）前列腺液（20%）液化因子 尿道球腺液（3%）睪丸液、附睪液 精子精液分段成分： 前段睪丸液，附睪液（精子），尿 道球腺液 中段前列腺液 后段精

2、囊腺液精液變量的參考值：精液量：26ml 顏色：灰白液化時(shí)間：60分 粘稠度：拉絲60% 活力： A+B50%或A25%精子計(jì)數(shù)：2000萬/ml 畸形率：30% 膿細(xì)胞： 5個(gè)/HP （6ml病因：附屬性腺感染附屬性腺功能亢進(jìn)2. 精液液化及粘稠度異常精液不凝固或凝固不全：精液稀薄，流動(dòng)性大。 病因：精囊腺炎癥精液不液化或液化不全：液化時(shí)間30分 病因：前列腺功能障礙3.精液pH異常： 測(cè)量方法：pH試紙(pH范圍6.1-10.0 或6.4-8.0)pH過低 原因：輸精管和精囊腺的缺如 附睪病變 pH過高： 原因：精囊腺液分泌過多 前列腺液分泌過少4.精子記數(shù)異常： 正常20106個(gè)/ml

3、測(cè)定方法：血球計(jì)數(shù)板一次性精子計(jì)數(shù)板 Makler精子計(jì)數(shù)板CASA儀1)少精子癥：20106個(gè)/ml 嚴(yán)重少精子癥：250106個(gè)/ml5.精子畸形：觀察方法：吉姆薩染色法或瑞士染色法巴氏染色法布賴恩利什曼染色肖爾染色法畸形分類：頭部畸形：大頭，小頭，錐形頭，梨形頭， 無定形頭，空泡樣頭，雙頭等。頸和中段畸形：缺尾，彎曲尾，腫脹，過薄等。尾部畸形：短尾，多尾，斷尾，卷尾，雙尾等胞質(zhì)殘余體：常位于精子頸部白細(xì)胞檢查： 正甲苯胺藍(lán)過氧化酶染色法：結(jié)果：白細(xì)胞染成棕紅色 聯(lián)苯胺法：染料：聯(lián)苯胺玫瑰紅結(jié)果：白細(xì)胞褐色；其它細(xì)胞品紅色。二精子運(yùn)動(dòng)特性的檢測(cè)和分析1. 顯微鏡觀察：注意事項(xiàng)：(1)取精液

4、10 ul，滴于玻片，蓋上2222蓋玻片，靜置1 分鐘后觀察。(2) 控制溫度，最好在37進(jìn)行(3) 每次觀察46個(gè)視野，計(jì)算100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算A級(jí)、 B級(jí)、C級(jí)和D級(jí)精子的百分比，連續(xù)觀察兩張滴片， 誤差不得10%。2.多點(diǎn)曝光技術(shù)：在1秒鐘內(nèi)對(duì)精子連續(xù)曝光6次，可判斷精子的運(yùn)動(dòng)速度及運(yùn)動(dòng)軌跡。 精子運(yùn)動(dòng)速度分布： 快速： 25微米/秒 中速： 1025微米/秒 慢速：50個(gè)/HP或 A級(jí)精子20個(gè)HP影響因素：女方的內(nèi)分泌狀況。宮頸粘液中的白細(xì)胞。陰道pH，8.5可導(dǎo)致PCT異常。 宮頸結(jié)構(gòu)異常。 抗精子抗體影響。 性功能異常,如陰道痙攣。精子質(zhì)量差。2) 體外試驗(yàn)： 玻片試驗(yàn) 精子宮頸粘

5、液接觸試驗(yàn) 毛細(xì)管試驗(yàn): 穿透介質(zhì): 人宮頸粘液; 宮頸粘液代用品: 牛宮頸粘液; 含人血清精子營(yíng)養(yǎng)液; 含牛血清白蛋白精子營(yíng)養(yǎng)液; 鮮雞蛋清;精子頂體酶測(cè)定（明膠膜法）：1)制備5%明膠溶液，吸取100ul均勻涂于載玻片上，自然干燥，4濕盒備用，使用前用甲醛酒精固定液固定60分鐘。2)精子處理：取液化精液，用PBS稀釋至24106個(gè)/ml。3)涂片：取1滴精液涂于明膠膜上，37濕盒2小時(shí)。4)觀察：于相差顯微鏡下計(jì)數(shù)有反應(yīng)精子的百分率及精子的平均反應(yīng)直徑。5)正常值：平均反應(yīng)率65%，平均反應(yīng)直徑25m。6去透明帶倉鼠卵穿透試驗(yàn)1)精子準(zhǔn)備：精液充分液化調(diào)整精子濃度至10106個(gè)/ml精子獲

6、能：取精液0.5ml，5%CO2，95%空氣中， 37孵育1824小時(shí)，調(diào)整精子濃度至4106/ml。2)卵細(xì)胞準(zhǔn)備：取動(dòng)情第一天倉鼠，腹腔內(nèi)注射PMSG 3040U，4872 小時(shí)后再次注射HCG 3040U，18小時(shí)后輸卵管內(nèi)取卵。1%透明質(zhì)酸去除卵丘細(xì)胞，0.1%胰蛋白酶去除透明帶。3)體外受精：將0.1ml精液加至液體石蠟下，再加入2030個(gè)倉鼠卵，培養(yǎng)3小時(shí)。4)結(jié)果觀察：相差鏡下見卵丘細(xì)胞內(nèi)膨大的精子頭為受精卵，計(jì)算受精率，正常為10%。三精液生化指標(biāo)檢測(cè)1. 酸性磷酸酶測(cè)定（ACP）原理：P硝基酚磷酸二鈉ACPP硝基酚測(cè)定產(chǎn)生的P硝基酚含量，推測(cè)ACP的活性正常值：200U一次射

7、精意義：反映前列腺功能2.果糖測(cè)定：間苯二酚法原理：果糖間苯二酚加熱紅色化合物測(cè)定化合物含量意義：反映精囊腺功能與精子供能有關(guān)3.糖苷酶測(cè)定原理：麥芽糖糖苷酶葡萄糖測(cè)定葡萄糖含量意義：反映附睪功能四抗精子抗體測(cè)定1.常用方法：1)凝集試驗(yàn)：原理：大分子或多價(jià)抗體如IgM或分泌型IgA可以在精子間形成交鏈，產(chǎn)生精子凝集，觀察。試管玻片凝集試驗(yàn)（FramRlin-Dukes）：將待檢樣本與液化的精液混合后，于孵育小時(shí)，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)條以上精子頭頭、尾尾或頭尾連接即為凝集，觀察個(gè)視野，個(gè)以上出現(xiàn)凝集即為陽性。圓盤凝集試驗(yàn)（Friberg）凝膠凝集試驗(yàn)（Kibrick） 缺點(diǎn)：假陽性高2)精子制動(dòng)

8、試驗(yàn)（Isojima）：原理：在補(bǔ)體參與下，精子表面的抗精子抗體可抑制精子的運(yùn)動(dòng)能力。缺點(diǎn)：敏感性差，IgA的作用常測(cè)不出，吸附于精子頭部的AsAb作用也常常測(cè)不出。3)直接免疫熒光試驗(yàn)：原理：用熒光素標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體與精子混合后，如精子表面有抗體，則標(biāo)記的二抗吸附于精子表面，出現(xiàn)熒光。優(yōu)缺點(diǎn)：方法敏感，假陰性少，且可確定吸附部位，但假陽性多。4)免疫珠試驗(yàn)：原理：將聚丙烯珠與兔抗人免疫球蛋白相連，如精子表面有抗精子抗體，則免疫珠與精子表面吸附，光鏡下即可觀察到，計(jì)數(shù)吸附在免疫珠上的活動(dòng)精子數(shù)，計(jì)算百分比，且可確定吸附部位。優(yōu)缺點(diǎn)：結(jié)果可靠，且可進(jìn)行抗體分類和定位，但價(jià)格較貴。5）混合抗

9、球蛋白抗體試驗(yàn)（MAR試驗(yàn)）：原理：將精液與包被了IgG或IgA的乳膠顆?；蚣t細(xì)胞混合，在加入二抗，顆粒與活動(dòng)精子間形成混合凝集預(yù)示精子表面存在IgG或IgA.6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：原理：將精子抗原吸附于酶標(biāo)板上，加入待檢樣本，如有AsAb則吸附于精子抗原上，加入酶標(biāo)二抗，與AsAb結(jié)合，最后加入底物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。優(yōu)缺點(diǎn)：可大規(guī)模使用，但有假陽性和假陰性，必須設(shè)定陽、陰性對(duì)照。五激素測(cè)定六遺傳檢測(cè)（一）染色體檢查染色體的非整倍體）性染色體的非整倍體精子發(fā)生需要性染色體的平衡，即一個(gè)X和一個(gè)Y，X或Y的數(shù)目異常均可導(dǎo)致精子發(fā)生異常。(1) 47,XXY男性（Klinefelter

10、s syndrome），發(fā)生率1：500，睪丸發(fā)育不良，精子發(fā)生障礙；46,XY/47,XXY亦經(jīng)常發(fā)生，伴有無精子或少精子。(2) 48,XXXY，49,XXXXY表型為女性，陰莖發(fā)育不良，隱睪。(3) 46,XX男性：由于Y染色體的短臂（Yp11）異位到X染色體的短臂上（Xp22）。內(nèi)生殖器表現(xiàn)型取決于Yp11的斷裂部位，Yp11遠(yuǎn)端（SRY附近）的斷裂常導(dǎo)致隱睪、小陰莖、尿道下裂。(4) 45,X男性，較少見，為Y長(zhǎng)臂缺失，短臂異位至常染色體上（13,15,22常見）。(5) 47,XYY發(fā)生率1：750，活檢顯示曲精小管受損，生精阻滯于精母細(xì)胞階段，有時(shí)有精子生成。少數(shù)人能生育，但胚胎

11、易死亡，或后代有異常染色體，4575%精母細(xì)胞帶有二個(gè)Y。(6) YA平衡異位：Y長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端的異染區(qū)（Yq12）轉(zhuǎn)移至端著絲粒常染色體的長(zhǎng)臂上，Y長(zhǎng)臂斷裂在Yq11上，斷裂部位對(duì)精子發(fā)生的影響較大，距Yq11較近時(shí)，精子發(fā)生基因受損，致精子發(fā)生障礙。斷裂距Yq11較遠(yuǎn)時(shí)，精子發(fā)生可正常并能生育，但帶有YA異位的很易再斷裂而引起不育，或?qū)愇粋鹘o子代，使子代發(fā)生斷裂而導(dǎo)致精子生成障礙。2) 常染色體的非整倍體在不育男子中，常染色體結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生率是有生育能力男子的10倍。(1) 男性Turner氏綜合征（Noonan 綜合癥）：為常染色體顯性或隱性遺傳病，染色體核型常為46, XY，或XO/XY嵌

12、合體。臨床表現(xiàn)：身體矮小，頸蹼，典型的臉部特征，心臟缺陷，隱睪，無精子或少精子癥，血睪酮下降，F(xiàn)SH和LH升高。21三體（Down綜合癥）：可生育或不育，多余的一條21可影響聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成，也可影響性染色體上性泡（Sex vesicle）的形成。、3、9、10染色體長(zhǎng)臂的部分三體或單體可引起性翻轉(zhuǎn)，性腺退化，生精障礙。羅伯遜異位：無精子癥患者可見，但常引起嚴(yán)重少精子癥。體細(xì)胞和生精細(xì)胞內(nèi)的染色體異常可能不一致。已發(fā)現(xiàn)1號(hào)染色體的非整倍體和XY精子的發(fā)生率是體細(xì)胞的10倍，如用XY精子行ICSI則可產(chǎn)生47,XXY的后代。已有報(bào)道，ICSI的胚胎性染色體非整倍體的發(fā)生率高于自然生殖。因此對(duì)行I

13、CSI的患者，最好進(jìn)行精子的染色體分析或植入前胚胎的遺傳分析。（二）精子發(fā)生基因（Azoospermia factor, AZF）檢測(cè)1.2. AZF的重要候選成分：YRRM1, DYS240, DAZ3. AZF與精子發(fā)生的關(guān)系：精子發(fā)生障礙患者中（無精子或精子計(jì)數(shù)小于500萬ml）約有有AZF缺失4. AZF的檢測(cè)方法：(1) 染色體原位雜交法(2) Southern Blot方法(3) PCR方法：具有迅速、靈敏、操作簡(jiǎn)便和成本低等特點(diǎn)，便于臨床推廣應(yīng)用，多重PCR可同時(shí)檢測(cè)幾AZF成分。(4) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single Strand Conformation analysis, SSCP）檢測(cè)AZF的點(diǎn)突變。(5) 核苷酸序列測(cè)定(6) 基因芯片技術(shù)5. AZF檢測(cè)的意義：(1) 從基因水平揭示精子發(fā)生的機(jī)制。(2) 無精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者的病因診斷。(3) ICSI的病例選擇。(4) 為基因缺陷男子和男性避孕的分子疫苗研究打下基礎(chǔ)。人有了知識(shí)，就會(huì)具備各種分析能力，明辨是非的能力。所以我們要勤懇讀書，廣泛閱讀，古人說“書中自有黃金屋。”通過閱讀科技書籍，我們能豐富知識(shí)，培養(yǎng)邏輯思維能力；通過閱讀文學(xué)作品，我們能提高文學(xué)鑒賞水平，培養(yǎng)文學(xué)情趣；通過閱讀報(bào)刊，