遺傳學(xué)實驗課件

1、 遺傳學(xué)實驗1 實驗一 植物細(xì)胞有 絲分裂及染色體制片技術(shù)2一實驗?zāi)康模?2 觀察植物細(xì)胞有絲分裂過程及各個時期的染色體行為； 1 學(xué)習(xí)并掌握植物染色體玻片標(biāo)本的制作方法；二實驗原理： 植物的生長旺盛的分生組織（如根尖、莖尖、幼葉等）都在進(jìn)行著有絲分裂。取這些組織為材料，經(jīng)過固定后迅速殺死細(xì)胞，并使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和生活狀態(tài)得以保持，再經(jīng)過解離、染色、壓片等過程，在顯微鏡下就可以看到大量處于有絲分裂各個時期的細(xì)胞，并進(jìn)行染色體行為的觀察。3 有絲分裂中期的染色體具有典型的形態(tài)特征，并容易計數(shù)。為了獲得更多的中期染色體裝片，可以采用常用的藥物處理方法，阻止紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂停止在中期，便于進(jìn)行

2、觀察。三實驗材料： 洋蔥、大蒜的鱗莖，玉米、蠶豆的種子等。本實驗選用大蒜。實驗用品： 用具：顯微鏡、剪刀、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、酒精燈、鉛筆、吸水紙等。 藥品：蒸餾水、卡諾氏固定液、45%醋酸、秋水仙素、改良苯酚品紅染液等。4四實驗步驟： 1 培養(yǎng)根尖：將大蒜瓣放在盛有清水的培養(yǎng)皿中，讓根部接觸水，在2025光照下培養(yǎng)，待根尖長到12cm時，自尖端約1處剪下備用。剪取根尖的時間以上午9時左右為好（為什么？）。 2 預(yù)處理：將剪取的新鮮材料于0.1%秋水仙素溶液中室溫下處理34小時。 3 固定：將經(jīng)過預(yù)處理和未經(jīng)預(yù)處理的材料沖洗后轉(zhuǎn)移至卡諾氏固定液中，室溫下處理324小時。 4 解離：將

3、沖洗后的根尖放入1mol/L的鹽酸中，室溫下處理1015min。5 5 軟化：將解離好的根尖沖洗后，放入45%醋酸中軟化10min左右。請問解離與軟化的目的是什么？ 6 染色：切取12mm的分生區(qū)，用改良苯酚品紅染液染色1020min。為保證染色的充分要注意哪些問題？6 7 壓片：蓋上蓋玻片，在酒精燈上烤片。然后固定蓋玻片，用鉛筆垂直、用力敲擊蓋片幾下，將材料壓成一層細(xì)胞。 8 鏡檢：先在低倍鏡下找到細(xì)胞，再換成高倍鏡仔細(xì)觀察有絲分裂過程中染色體的行為。壓片時應(yīng)注意的問題有哪些？請注意比較經(jīng)過預(yù)處理和未經(jīng)預(yù)處理的材料有何不同？7五作業(yè)： 1 說明實驗過程中每步的作用是什么； 2 畫出在顯微鏡下

4、看到的有絲分裂各時期的圖像； 3 比較經(jīng)過預(yù)處理和未經(jīng)預(yù)處理的兩個裝片的不同，為什么會不同？六結(jié)果與討論： 1 結(jié)果89 2 討論：經(jīng)過預(yù)處理和未經(jīng)預(yù)處理的兩個裝片的不同，為什么會不同？10實驗二 果蠅的生活史及形態(tài)觀察一、實驗?zāi)康呐c要求1.了解果蠅生活史各階段的形態(tài)特征，觀察果蠅的幾種常見的突變類型。2.掌握辨別雌雄果蠅的方法。3.了解果蠅的飼養(yǎng)方法和處理方法。 二、實驗原理三、實驗材料、用具和藥品1.材料：野生型和常見的突變型果蠅。2.用具：體視顯微鏡、放大鏡、小鑷子、培養(yǎng)瓶、麻醉瓶、白瓷板、培養(yǎng)皿、毛筆。3. 藥品：乙醚、瓊脂、玉米粉、蔗糖、酵母粉、苯甲酸。果蠅形體小，生長迅速，繁殖率高

5、，飼養(yǎng)簡便，突變性狀多，是遺傳學(xué)研究的極好材料。11四、實驗方法與步驟1. 果蠅培養(yǎng)基的配制 玉米粉培養(yǎng)基2.果蠅的生活史觀察 3.果蠅的麻醉 乙醚麻醉0.5min后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，如觀察中蘇醒，可在培養(yǎng)皿內(nèi)放一個滴有乙醚的濾紙條補救。 4.果蠅的性狀觀察五、作業(yè)1.描述果蠅的生活史。2.如何區(qū)別雌雄果蠅？12四、實驗方法與步驟1. 取材 取果蠅三齡幼蟲置于載玻片上，滴加0.7生理鹽水2.剖取果蠅唾腺 3.染色壓片4.鏡檢五、作業(yè)1. 繪出所觀察到的果蠅唾腺染色體的圖像，標(biāo)明染色中心和5條臂。2. 果蠅唾腺染色體與其他染色體在形態(tài)結(jié)構(gòu)上有什么區(qū)別？13實驗三 果蠅雜交實驗一、實驗?zāi)康呐c要求通過自

6、行設(shè)計實驗方案，研究果蠅兩對相對性狀的雜交試驗結(jié)果分析，驗證獨立分配規(guī)律。二、實驗原理三、實驗材料、用具和藥品1.材料：長翅、黑檀體與殘翅、灰體的果蠅。2.用具：體視顯微鏡、飼養(yǎng)瓶、麻醉瓶、海棉板、白瓷板、解剖針、鑷子、毛筆等。3. 藥品：乙醚、酒精等。長翅黑檀體的雌蠅與殘翅、灰體的雄蠅交配(或反交)，F(xiàn)1代自交而得的F2產(chǎn)生性狀分離和重組，出現(xiàn)四種表現(xiàn)型，比例為9:3:3:1。14四、實驗方法與步驟1. 麻醉2.選取長翅、黑檀體處女蠅和殘翅、灰體雄蠅56對(或反交)，一起放入事先裝有培養(yǎng)基的飼養(yǎng)瓶內(nèi)。3.一周后倒出親本果蠅，等F1羽化后進(jìn)行觀察、記錄。 4.任意選取正交或反交組合的F1雌雄果

7、蠅(雌蠅必須處女蠅)78對，放入一個培養(yǎng)瓶中。5.一周后倒去F1果蠅，待F2羽化后10天進(jìn)行觀察統(tǒng)計。五、作業(yè)1.對觀察資料進(jìn)行2測驗，討論實驗結(jié)果是否符合獨立分配規(guī)律。2.果蠅雜交時應(yīng)注意哪些事項？15實驗四 植物多倍體的誘發(fā)與鑒定一、實驗?zāi)康呐c要求1. 掌握人工誘發(fā)多倍體植物的原理、方法及其在植物育種上的意義。2. 觀察多倍體植物，鑒別植物染色體數(shù)目的變化。二、實驗原理三、實驗材料、用具和藥品1.材料：玉米、水稻或其他植物種子。 2.用具：顯微鏡、生化培養(yǎng)箱、冰箱、天平、鑷子、解剖針、刀片、載玻片、蓋玻片、燒杯、量筒、吸水紙。3. 藥品：秋水仙素、95%酒精、冰醋酸、鹽酸、碘化鉀等。16四

8、、實驗方法與步驟1. 秋水仙素溶液配制2. 材料處理、固定、保存3. 壓片4. 鏡檢五、作業(yè)繪出玉米根尖多倍性細(xì)胞的中期染色體圖像。17實驗五 蠶豆根尖微核檢測技術(shù)一、實驗?zāi)康呐c要求1. 了解微核測試原理和毒理遺傳學(xué)意義 。2. 學(xué)習(xí)蠶豆根尖的微核測試技術(shù) 。二、實驗原理三、實驗材料、用具和藥品1.材料：蠶豆種子。 2.用具：顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、燒杯等。3. 藥品：卡諾固定液、鹽酸酒精解離液、改良苯酚品紅染液、NaN3等。微核是真核生物細(xì)胞經(jīng)各種理化因子作用后引起染色體畸變，在間期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。18四、實驗方法與步驟1.浸種催芽2.用被檢測液處理根尖3.根尖細(xì)胞恢復(fù)4.根尖細(xì)

9、胞固定、酸解、染色 5.顯微鏡下觀察五、作業(yè)1. 在蠶豆根尖細(xì)胞的微核測試中，為什么要進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)？2. 產(chǎn)生微核的根尖細(xì)胞在產(chǎn)生前的分裂中期可能出現(xiàn)什么樣的中期分裂圖像？19實驗六 利用ISSR分析植物遺傳多樣性一、實驗?zāi)康?、掌握ISSR技術(shù)的基本原理和操作方法；2、掌握植物遺傳多樣性分析方法。二、實驗原理 ISSR分子標(biāo)記是在SSR標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，其基本原理是在SSR的5或3端加錨14個嘌呤或嘧啶堿基，然后以此為引物，對兩側(cè)具有反向排列SSR的一段基因組DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。重復(fù)序列和錨定堿基是隨機(jī)選擇的，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后，每個引物可以產(chǎn)生比RAP

10、D方法更多的擴(kuò)增片段，因此，ISSR標(biāo)記是一種快速、可靠、可以提供有關(guān)基因組豐富信息的DNA指紋技術(shù)。20三、實驗材料 水稻或其他植物不同品種或品系。四、操作步驟：（以水稻為例）。1準(zhǔn)備材料，10-15個水稻品種的種子。2、種子發(fā)芽，提取玉米總DNA（具體操作參見附1）。3、檢測DNA的純度（具體操作參見附2）。4、應(yīng)用ISSR引物擴(kuò)增玉米DNA（具體操作參見附3）。5、應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物（具體操作參見附4）。6、分析實驗結(jié)果。21五、注意事項1、本實驗涉及內(nèi)容較多，請大家認(rèn)真閱讀有關(guān)資料，掌握實驗原理。2、本實驗所用的一些試劑具有一定的毒性，請大家注意安全。3、本實驗所用時間較長

11、，部分實驗內(nèi)容同學(xué)可以另外安排實驗進(jìn)行。22六、作業(yè)及思考題1、應(yīng)用ISSR技術(shù)分析植物品種遺傳多樣性應(yīng)注意哪些因素？2、分析植物品種遺傳多樣性在遺傳學(xué)研究上有什么作用？23附1植物基因組DNA的提取一、實驗?zāi)康呐c要求掌握從高等真核生物細(xì)胞中制備基因組DNA的基本原理，熟悉從高等植物中提取基因組DNA的技術(shù)流程。二、實驗原理三、實驗材料、用具和藥品1.材料：幼嫩的水稻幼苗。 2.用具：水浴鍋、液氮罐、離心機(jī)、移液槍、電泳設(shè)備、凝膠成像分析系統(tǒng)、研缽等。3. 藥品：2CTAB抽提緩沖液、氯仿異戊醇（241）、異丙醇、無水乙醇、70%乙醇、TE等。采用CTAB法提取植物DNA24四、實驗方法與步驟

12、1.樣品加液氮研磨成粉末，加2CTAB抽提緩沖液65水浴保溫30 min以上；2.加入等體積的氯仿異戊醇（241）；3. 12000 rpm，室溫，離心1020 min； 4.將上清液加入2/3體積的經(jīng)-20預(yù)冷的異丙醇；5.將DNA沉淀用70%乙醇洗滌；6.干燥后的DNA沉淀溶于適量TE（pH8.0）緩沖液中； 7.取少量DNA溶液在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳分離并在凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察。五、作業(yè)分析電泳結(jié)果，解釋原因。25附2 DNA濃度的測定一、實驗材料 所提取的水稻DNA母液。二、實驗器具和藥品1用具：7522紫外分光光度計、取樣器2藥品：雙蒸餾水、TE三、操作步驟1講解和練習(xí)分光光

13、度計的使用方法2取20ml提取的核DNA，加入1980ml蒸餾水對待測DNA樣品做1:100(或更高倍數(shù)的稀釋);263蒸餾水作為空白,在波長260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)至零。4加入DNA稀釋液，測定260nm 及280nm的吸收值。260nm 讀數(shù)用于計算樣品中核酸的濃度，OD260值為1相當(dāng)于約50mg /ml雙鏈DNA，33mg /ml單鏈?？筛鶕?jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)的比值（OD260/OD280）估計核酸的純度。一般DNA的純品，其比值為1.8，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染。275記錄OD值，通過計算確定DNA濃度或純度，公式如下: dsDNA（

14、mg /ml）=50(OD260) 稀釋倍數(shù)28附3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗一、基本原理 雙鏈DNA分子經(jīng)高溫變性后成為兩條單鏈DNA（模板DNA），單鏈DNA在互補寡聚核苷酸片段（引物）的引導(dǎo)下，可以利用DNA多聚酶按5 3方向復(fù)制出互補DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在緩沖液中有引物、DNA合成底物dNTP存在下，經(jīng)變性、退火和延伸即可合成產(chǎn)物DNA。經(jīng)若干個這樣的循環(huán)后，DNA即可擴(kuò)增2n倍。具體過程如下：291、變性：加熱使模板DNA在高溫（94oC）下變性，雙鏈中的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。2、退火：使

15、溶液溫度逐漸降至50-60 oC，模板DNA即可與引物按堿基配對原則互補結(jié)合。3、延伸：再將溶液反應(yīng)溫度升至72 oC，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷酸（dNTP），按5 3方向復(fù)制出互補DNA。上述三步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量即可增加一倍，新形成的鏈又可成為下一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25-30個循環(huán)后，DNA可擴(kuò)增106-109倍。30二、實驗器材PCR熱循環(huán)儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、加樣槍、槍頭、離心管。三、材料與試劑1）DNA模板：0.1ug/ul水稻DNA，使用前用TE緩沖液或ddH2O稀釋10倍置于冰中。2）4種脫氧核苷

16、酸（dNTP）：4倍dNTP，即1mmol/L dNTP 、1mmol/L dATP 、1mmol/L dCTP 、1mmol/L dGTP 、1mmol/L dTTP 。3） 50nmol/L 引物：ISSR第808號引物：AGAGAGAGAGAGAGAGCISSR第812號引物：GAGAGAGAGAGAGAGAA314）2.5U/ul Taq聚合酶 5）DNA 標(biāo)記（Marker） 6）10X PCR反應(yīng)緩沖液：含有500mmol/L KCl、100mmol/L HCl(PH9.0)、15mmol/L Mg2Cl、0.1%(W/V)明膠、1%Triton X-100。 7） DNA瓊脂糖凝

17、膠電泳全部試劑32四、操作步驟1）0.5ml Eppendorf管一個，反應(yīng)總體積20ul,用加樣槍按以下順序分別加入各種試劑： 反應(yīng)物 體積（ul） ddH2O 14.3 10X buffer 2 Mg2+ 1.5 dNTP 1 primer 0.5 Taq 0.2 DNA模板 0.533附4 瓊脂糖凝膠電泳檢測植物DNA實驗一、實驗原理 瓊脂糖凝膠電泳法（agarose gel electrophoresis）主要用于分離、鑒定和純化DNA片段。用溴化乙錠(ethidium bromide,簡稱EB，誘變致癌物質(zhì)！)染色，在紫外燈下，凝膠中1ng的DNA即能直接觀察到。瓊脂糖凝膠電泳對核酸

18、的分離作用主要依賴它們的分子量及分子構(gòu)型。凝膠類型及其濃度對被分離核酸的分子大小的關(guān)系重大。34二、實驗器材和試劑的配制1、實驗器材：恒壓恒流電泳儀、水平板電泳槽、移液器、燒杯、容量瓶、三角瓶、電爐。2、試劑的配制：1）電泳緩沖液（10XTBE溶液）：108g Tris，55g硼酸，7.44g EDTA，加雙蒸水定容至1000ml，PH8.5，用時稀釋10倍。2）載樣緩沖液：溴酚藍(lán)250mg,加雙蒸水10ml ，室溫下過夜；二甲苯腈藍(lán)250mg，加雙蒸水10ml 溶解；蔗糖40g，加雙蒸水溶解；合并三溶液，加雙蒸水定容至100ml。35三、實驗步驟1、制agarose凝膠：稱0.3g agar

19、ose，倒入250ml三角瓶中，加1X TBE溶液50ml，水浴加熱溶解。冷卻至60oC，用移液器加入2ul EB溶液，晃動使混勻。將制膠板兩端密封，放上梳子，倒膠，3060min膠凝固后，拔去梳子。1）上樣：將膠板兩端的擋板或膠布移去，把膠板置于電泳槽中，注入1X TBE緩沖液，使電泳緩沖液液面高出膠平面1cm左右。移取載樣緩沖液15ul,DNA提取液2ul，混勻后將樣品液加入梳孔中。在兩端或中央梳孔上加入DNA ladder標(biāo)記。362）電泳：接通電泳儀，上樣品端接負(fù)極。調(diào)節(jié)電壓電流，電壓5-10V/cm，電流1050mA。恒壓電泳2小時左右。3）檢測：關(guān)閉電泳儀，將電泳后的凝膠置于紫外分

20、析儀上觀測。DNA被溴化乙錠染色后在紫外光下呈現(xiàn)金黃色熒光，照相后關(guān)閉電源（紫外線對人眼有害，不要久看）。 372) PCR擴(kuò)增程序，總時間約4小時94 OC預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)94 OC變性30S52 OC復(fù)性45S72 OC延伸1minGo to ,34 cycle72 OC延伸8min12 OC ForeverEnd 3) 瓊脂糖凝膠電泳,分析PCR結(jié)果。38實驗七人類X小體檢測 一、實驗?zāi)康?掌握X小體的玻片標(biāo)片制作方法，繪制X小體形態(tài)特征及所在部位。鑒定個體的性別，為進(jìn)一步研究人類染色體畸變與疾病的關(guān)系提供基礎(chǔ)方法、為遺傳病臨床診斷提供參考。 39二、實驗原理 1949年Barr

21、和Bertran在研究貓的間期神經(jīng)細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)雌貓體細(xì)胞核膜邊緣有一個可被堿性染料染色的小體而雄貓沒有。后來發(fā)現(xiàn)人類正常女性口腔上皮、陰道上皮、皮膚、羊水等的細(xì)胞中都有一個這樣的小體，繼而有人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)所有哺乳動物雌體細(xì)胞中都有同樣的一個小體。40一般認(rèn)為這種小體是兩個X染色體中的一個在間期發(fā)生異固縮形成的，故而將其稱為X小體，X染色質(zhì)，又稱為Barr小體。Barr小體出現(xiàn)在哺乳動物雌性個體細(xì)胞的細(xì)胞核膜邊緣，這主要是因為這條染色體處在失活狀態(tài)所致，Morishima等利用放射性標(biāo)記的方法證實了失活狀態(tài)的性染色體與其他異染色質(zhì)（heterochromatin）一樣，在DNA復(fù)制時總落后于其他常

22、染色質(zhì)，且大多出現(xiàn)在核膜邊緣。性染色質(zhì)的數(shù)目是X染色體數(shù)減1。故可以根據(jù)X小體的有無、數(shù)目來鑒定胎兒的性別和性別畸形。41Y小體是人類男性體細(xì)胞中Y染色體長臂末端顯現(xiàn)的明亮小體，是由螢光染料染色后顯示的螢光所致。因而稱為Y小體或Y染色質(zhì)。亦可根據(jù)Y小體的有無、數(shù)目鑒定胎兒的性別和性別畸形 42三、實驗材料 口腔粘膜（男女）、發(fā)根細(xì)胞（女）。 43四、實驗器具和藥品 1.器具：普通顯微鏡、熒光顯微鏡、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片、鑷子、牙簽、濾紙、紗布等。2.藥品：95%乙醇、乙醚、改良堿性品紅、鹽酸喹吖、Macllvaine氏緩沖液、石蠟。44五、實驗步驟 取材:受檢查者用水漱口數(shù)次，盡可能除去

23、細(xì)菌和食物殘渣；用潔凈的牙簽從口腔兩側(cè)頰部刮取粘膜，第一次刮取物棄去，將第二次、第三次刮取物涂在干凈的載玻片上。固定:滴加固定液（95%乙醇:乙醚=1:1或直接用乙醇）固定2030min，空氣干燥。染色制片:滴加12滴改良品紅于室溫下染色1020min（勿使干燥），加上蓋片，墊上濾紙用手指輕輕加壓即可。45鏡檢：低倍鏡下計數(shù)100個核膜完整，細(xì)胞不重疊，無核固縮的細(xì)胞；并在高倍或油鏡下觀察。若使用女性發(fā)根細(xì)胞，需選用帶有毛囊的頭發(fā)（約2cm長），再加一滴染液后加上蓋玻片，灑精燈上微熱，靜置5min，后蓋一濾紙壓片。 46人口腔X小體47六、實驗結(jié)果 1.X小體：油鏡下可見X小體為一致密的濃染小

24、體。輪廓清晰，約1um，常附著于核膜邊緣或靠邊內(nèi)側(cè)，其形態(tài)有三角形、卵形、扁平形等。正常女性間期細(xì)胞核中X小體比例約30%50%，男性中則偶爾可見（2%），且不典型。48七、作業(yè)及思考題1.統(tǒng)計X小體的頻率，畫23個典型細(xì)胞，示X小體的形態(tài)和所處部位。2.什么是劑量補償效應(yīng)？3.Barr小體分析技術(shù)在人類遺傳學(xué)工作中有什么用途？4.在制片過程中使用HCl酸解的目的是什么？5.為什么Barr小體一般出現(xiàn)在核膜邊緣？ 49實驗八 遺傳平衡定律一、實驗?zāi)康?通過實驗進(jìn)一步理解Hardy-Weinberg 定律的原理；調(diào)查周圍人群中ABO血型系統(tǒng)的基因頻率和基因型頻率的情況；以果蠅為模式生物，人工模擬選擇對基因頻率和基因型頻率改變的影響。50二、實驗原理 Hardy-Weinberg定律是群體遺傳學(xué)中的基本定律，又稱為遺傳平衡定律。它的基本含義是指在一個大的附機(jī)交配的群體中，在無突變、無任何形式的選擇、無遷入遷出、無遺傳漂變的情況下，群體中的基因頻率和基因型頻率可以世代相傳不發(fā)生變化，并且基因型頻率是由基因頻率決定的。它推導(dǎo)過程包括3個主要步驟：1）從親本到其產(chǎn)生的配子；2）從配子結(jié)合到產(chǎn)生基因型；3）從合子基因型到子代的基因頻率。P2+2pq+q2=1 是一對等位基因的