人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)工藝 精品

1、人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)工藝生長(zhǎng)素分為植物生長(zhǎng)素和高等動(dòng)物、人生長(zhǎng)激素。植物體內(nèi)的生長(zhǎng)素，其化學(xué)成 分是吲噪乙酸。而高等動(dòng)物和人體內(nèi)的生長(zhǎng)激素，其化學(xué)成分是蛋白質(zhì)，不同種屬 的哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)激素間有明顯的種屬特異性，只有靈長(zhǎng)類(lèi)的生長(zhǎng)激素對(duì)人有活 性。因而動(dòng)物的生長(zhǎng)激素一般不能用在人身上。人生長(zhǎng)激素是腦垂體前葉分泌細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，是由一條191個(gè)氨基酸的多肽鏈 所構(gòu)成的蛋白質(zhì)，分子中有兩個(gè)二硫鍵,相對(duì)分子質(zhì)量21700,等電點(diǎn)4.9，沉降系數(shù)S20, 2.179, N端的1-134氨基酸段肽鏈為活性所必需，C端的一段肽鏈可能起保護(hù)作用，使 w生長(zhǎng)激素在血循環(huán)中不致被酶破環(huán)。人生長(zhǎng)激素分子相當(dāng)穩(wěn)定，其活

2、性在冰凍條件下可 保持?jǐn)?shù)年，在室溫放置48h無(wú)變化。一、生長(zhǎng)激素發(fā)展歷程：1：科學(xué)家早家1920年就知道了生長(zhǎng)激素的存在，但直到1958年才被用于臨 床治療。直到1986年美國(guó)禮來(lái)大藥廠(chǎng)通過(guò)基因工程方法，成功地制造出了 191個(gè) 氨基酸的HGH。2: 1985年，基于對(duì)HGH的多年研究和廣泛深入的臨床實(shí)驗(yàn)，美國(guó)威斯康辛醫(yī) 學(xué)院的羅德曼博士在美國(guó)抗衰老協(xié)會(huì)雜志上首次正式提出一個(gè)有關(guān)人體衰老原 因的嶄新理論。3: 1990年7月5日美國(guó)威斯康辛醫(yī)學(xué)院的Daniel Rudman羅德曼醫(yī)師在新 英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上發(fā)表了他那一篇震驚醫(yī)學(xué)界的論文Effects of humangrowth hormone

3、 in men over 60 years old （人類(lèi)生長(zhǎng)激素在60歲以上老年人中 的應(yīng)用），這篇論文可以說(shuō)是HGH應(yīng)用到抗衰老研究醫(yī)學(xué)史上的一座里程碑。4: 1996年，愛(ài)德門(mén)錢(qián)博士在自己親身體驗(yàn)到HGH的卓越效果后，擴(kuò)展使用到 超過(guò)800個(gè)患者，包括電影明星、大公司高級(jí)主管、甚至許多著名的醫(yī)生、專(zhuān)家、 學(xué)者，均達(dá)到驚人的效果。1996年8月美國(guó)FDA （美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局）終于 正式批準(zhǔn)HGH在臨床上使用，用來(lái)治療所有缺乏HGH的病人，也包括正常成年人。5:現(xiàn)在科學(xué)發(fā)現(xiàn)人體生長(zhǎng)素HGH減少才會(huì)出現(xiàn)人體的衰老。合理的補(bǔ)充人體 生長(zhǎng)素（HGH），可以使人體的衰老現(xiàn)象產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)。二、人生長(zhǎng)

4、激素作用有：1：有抗衰老作用2：對(duì)人肝細(xì)胞有增加核分裂作用3：對(duì)紅細(xì)胞有抑制葡萄糖利用作用4：對(duì)白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞有促進(jìn)蛋白質(zhì)及核酸合成作用5：有促進(jìn)骨骼、肌肉、結(jié)締組織和內(nèi)臟增長(zhǎng)作用6：對(duì)垂體功能不全而引起的侏儒癥有效。三、人生長(zhǎng)激素的傳統(tǒng)工藝流程：生產(chǎn)工藝流程提取0.25mol/硫酸銨匚建、店分級(jí)沉淀，硫酸銨1T.iinol/LpH =7.5鹽析物溶解，人腦垂體前葉一上清液溶解液除鹽對(duì)蒸餾透析內(nèi)液除雜蛋白酸或堿 上清液 蒸餾水溶解站H = E離心清液透析內(nèi)液，除鹽凝膠過(guò)濾SephadexG-75對(duì)（HfN敏溶解液溶解 對(duì) 0.imoi/LNaci,tris-HC透析透析鹽析,硫酸銨.2ho【

5、/L 鹽析 蒸餾水h = m離子交換層，活性組成對(duì)絲ml甌砂鹽酸透析透析內(nèi)液匝EJ吸附DE-52H = RpH = 18/7H = M工瞄冷工一除鹽生長(zhǎng)素.透析內(nèi)液遂蒸餾水透析先脫峰組分65mmo/硼小鹽酸5-3CCpH = 8.7工藝過(guò)程：1：原料處理。取出人腦垂體，速凍，置于-20C保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用蒸餡水淋洗。 剝離后葉，取腺垂體前葉。2：提取pH=5.5置組織搗碎機(jī)制成勻漿，水提，離心，收集沉淀用pH =4.0、0.1mol/L 硫酸鉉提取，離心，然后用pH =5.5、0.25 mol/L硫酸鉉提取沉淀，離心，得提取液。3：分級(jí)沉淀。在pH =7.5時(shí)，提取液中加入飽和硫酸鉉稀至濃度1

6、 mol/L，離心， 棄沉淀，上清液加飽和硫酸鉉稀至濃度為1.8mol/L，離心，收集沉淀。4：透析。腺垂體硫酸鉉一pH=5.5 提取液硫酸鉉一pH=7.5鹽析物透析除鹽、 去雜蛋白將沉淀溶于少量蒸餡水中，用水透析除鹽。5：等電點(diǎn)沉淀。再將透析液在pH=4.0和pH=4.9分別進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，離心，除 去雜蛋白，得上清液。鹽析物蒸餾水一溶解液一透析液HCl或NaOH pH=4.0, 4.9 上清液。6：鹽析。鹽析、離心、洗脫 上清液在pH=4時(shí)用飽和硫酸銨稀至1.25mol/L，鹽析， 離心，收集沉淀。7：凝膠過(guò)濾。將沉淀溶于少量蒸餾水，對(duì)pH =8.5的Tris-HCl緩沖液（含0.1mol

7、/L 氯化鈉）透析，再上SephadexG-75柱，用50mmol/L、pH= 8.5的Tris-HCl緩沖液（含 0.1mol/L氯化鈉）洗脫，分步收集組分。上清液硫酸銨一pH4.0鹽析物透 析一pH=8.5透析液SephadexG-75 pH=8.5活性成分8： DEAE-C （DE-50）層析。透析、除鹽、凍干 將活性成分對(duì)pH= 8.7、6.5 mmol/L 的硼砂-HCl緩沖液進(jìn)行透析，透析液上DEAE-C柱，用6.5 mmol/L、pH=8.7的硼砂-HCl 緩沖液（含0-0.3mol/L氯化鈉）梯度洗脫，收集組分，合并，透析除鹽，冷凍干燥即得 pGH?；钚猿煞滞肝鲆?pH=8.7

8、透析液DEAE-C pH=8.7吸附物洗脫一 pH=8.7 洗脫峰組分透析一透析液凍干一 -30CpGH成品。四、人生長(zhǎng)激素現(xiàn)在生產(chǎn)工藝現(xiàn)在生產(chǎn)工藝主要運(yùn)用生物技術(shù)，有現(xiàn)采用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)表達(dá)或用大腸桿菌表 達(dá)系統(tǒng)，現(xiàn)主要介紹運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成表達(dá)重組人生長(zhǎng)激素的 工程菌種子培養(yǎng)LB培養(yǎng)液誘導(dǎo)和補(bǔ)料 ,發(fā)酵酵Ml分析檢測(cè)-hGH的純化和純度鑒定產(chǎn)品pET30a（ + ） -hGH/BL21 （ DE31：構(gòu)建工程菌 pET30a( + ) -hGH/BL21 ( DE3 ),2：種子液的制備。從-70甘油凍存的菌種中取出少量接種于5ml液體LB (含氨 芐青霉素100ug/ml),在

9、37C 200r/min振蕩培養(yǎng)10 12h。按1%量再轉(zhuǎn)接于100ml液 體LB (含氨芐青霉素100ug/ml ),在37C 200r/min振蕩培養(yǎng)8h左右。3:發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基體積為4L, pH控制在7.00 +/- 0.10,由發(fā)酵控制系統(tǒng)自動(dòng)補(bǔ) 入5mol/L NaOH和2mol/L H2SO4調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。培養(yǎng)溫度控制在37 C。發(fā)酵過(guò)程中溶氧 控制在20%以上，當(dāng)溶氧降低至該值時(shí)可通過(guò)提高通氣量和攪拌速度以提高溶氧。4:誘導(dǎo)和補(bǔ)料發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到3.54h后，培養(yǎng)基中的葡萄糖幾乎消耗完，一 次性加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，使其終濃度為0.5mmol/L,同時(shí)以34ml/min的流速滴加補(bǔ) 料液，補(bǔ)料體積為500ml。5:分析檢測(cè)。菌密度的測(cè)定；葡萄糖的測(cè)定;周質(zhì)蛋白的提??；蛋白的定量；生物 量的測(cè)定6:hGH的純化和純度鑒定hGH多克隆抗體的制備及純化；抗體親和層析柱的制備; 抗體親和層析純化hGH;純度鑒定；相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定；免疫活性檢測(cè)參考文獻(xiàn)：齊香君.現(xiàn)代生物制藥工藝學(xué).176-177楊少民，陳方，付永標(biāo)，等.用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素研究.生物學(xué) 雜志，1998, 15( 81) : 13- 15王海波，王驪麗，歐俊杰，等 用重組大腸桿菌生產(chǎn)rhG