分子生物學(xué)基因功能研究1基因打靶和轉(zhuǎn)基因課件

1、Strategies for analyzing gene function基因功能的鑒定技術(shù)分子生物學(xué)基因結(jié)構(gòu)分析的基本策略第1頁(yè)，共46頁(yè)。對(duì)題目的解析：基因的功能ProteinDNARNAProteinGenemRNA基本思路：利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的基因功能在DNA水平的技術(shù) 使相應(yīng)基因缺失而失活: 基因敲除 細(xì)胞或動(dòng)物獲得新基因、或 額外拷貝的基因：轉(zhuǎn)基因技術(shù) 在mRNA水平的技術(shù)：封閉或降解mRNA 反義RNA， RNAi基因功能的研究是21世紀(jì)生命科學(xué)研究的重點(diǎn)之一，這對(duì)于我們深入理解疾病的發(fā)生機(jī)理、探索新的治療途徑非常重要！第2頁(yè)，共46頁(yè)。第一節(jié) 使體內(nèi)原有基因缺失的技術(shù):

2、 基因敲除 (gene knock-out)美國(guó)猶他大學(xué)Eccles人類遺傳學(xué)研究所 馬里奧卡佩奇 MarioR.Capecchi英國(guó)卡迪夫大學(xué)卡迪夫生命科學(xué)學(xué)院 馬丁埃文斯 MartinJ.Evans美國(guó)北卡羅來納州大學(xué)教會(huì)山分校醫(yī)學(xué)院 奧利弗史密斯 OliverSmithies 2007 諾貝爾獎(jiǎng)貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主卡佩奇有段坎坷童第3頁(yè)，共46頁(yè)。利用DNA同源重組的原理，在活體內(nèi)將特定基因從染色體上剔除的過程。Genomic DNA:Targeting DNA fragment:Genomic DNA/gene knocked out:Lost its original functionHo

3、mologous arm sequence一、基因敲除的定義 *第4頁(yè)，共46頁(yè)。構(gòu)建基因敲除載體基因敲除載體的特點(diǎn)：待敲除基因的同源臂序列陽(yáng)性篩選標(biāo)記基因陰性篩選標(biāo)記基因二、基因敲除的基本流程*PTargeting vector打靶載體問題：如何構(gòu)建打靶載體？Positive screening marker geneHomologous armsHSV-Tk geneNeoRestriction enzyme打靶載體PTargeting vector Linearize the targeting vector Homologous arms of gene waiting for bei

4、ng knocked outNegative screening marker gene: TK geneNeoR*Targeting vector第5頁(yè)，共46頁(yè)。 基因敲除載體的構(gòu)建過程：將待敲除基因切除大部分使其失活，留下用于重組的同源臂PP在同源臂的外側(cè)線性化載體PTargeting vectorPCloning vector打靶載體待敲除基因NeoR geneHSV-Tk genePRecombinant cloning vectorTarget geneTarget geneRemove most part of target gene sequence to inactivate

5、 it and remain partial sequences as homologous arms.NeoR geneTk geneTargeting vectorCloning vectorRecombinant cloning vectorTargeting vectorInsert a NeoR gene which will be located between homologous armsInsert a Tk gene into the vector第1步： Construct the targeting vector.PRecombinant cloning vector第

6、6頁(yè)，共46頁(yè)。二、基因敲除的基本流程*ES cell(Embryonic stem cell) Brown mouse小鼠受精卵發(fā)育第45天的胚泡細(xì)胞；能在體外培養(yǎng)，具有發(fā)育的全能性?；蚯贸d體構(gòu)建基因敲除載體 將基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換為什么需要將打靶載體線性化？ 第7頁(yè)，共46頁(yè)。構(gòu)建基因敲除載體 將基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換ES cell二、基因敲除的基本流程*PTargeting vectorRestriction enzymeHomologous armsHSV-TkNeo同源重組時(shí)可能遇到哪些問題，篩選標(biāo)志在這個(gè)過程中發(fā)揮什么樣的作用？ 第8頁(yè)，共46頁(yè)。 P

7、53 gene is replaced by Neo gene. Cells are resistant to both neomycin and gancyclovirHomologous RecombinationOther sitesRandom Insertion P53 gene is not replaced. Cells are resistant to neomycin but sensitive to gancyclovir.10-5-10-6Neo geneNeo geneHSV-Tk geneHSV-Tk Neo in ES cellsP53 geneP53 geneP5

8、3 geneP53 geneTwo ways for Neo gene insertion 第9頁(yè)，共46頁(yè)。細(xì)胞死亡細(xì)胞的培養(yǎng)基含單核苷酸類似物 (gancyclovir)細(xì)胞生長(zhǎng)良好單核苷酸類似物是無毒的陰性篩選標(biāo)記基因（HSV-Tk）的篩選原理陰性篩選目的：但如果細(xì)胞中如果有HSV-TK 基因的表達(dá)，即存在TK (thymidine kinase)，單核苷酸類似物將被其磷酸化成有毒的產(chǎn)物用打靶載體轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞時(shí)，我們只需要同源部分重組入ES cell的genome，而Tk基因等載體的其它部分是不可以進(jìn)入ES cell的genome(by隨機(jī)重組)。用單核苷酸類似物篩選轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，存活的

9、細(xì)胞基本上不含載體的其它序列第10頁(yè)，共46頁(yè)。Positive-negative selectionTransfectionHomologous recombinantsG418 Neomycin (positive selection) kills the non-insertions;Gancyclovir (negative selection) kills the random insertionsIn survival cells, P53 gene is replaced by Neo, but only on 1 chr.Medium with G418 & Gancyclov

10、irNormal ES cellsHomologous armsTk geneNeo geneAmplify the ES cells in which homologous recombinant has happened, but on only 1 chr.ES cells in medium with G418 + 單核苷酸類似物Provides ES cells第11頁(yè)，共46頁(yè)。構(gòu)建基因敲除載體將基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞，通過重組建立 雜合基因敲除的胚胎干細(xì)胞將雜合基因敲除的ES細(xì)胞發(fā)育成基因敲除的小鼠二、基因敲除的基本流程*? a).基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡 b). 嵌合胚泡植

11、入假孕小鼠子宮中 c). 嵌合體的雜交育種第12頁(yè)，共46頁(yè)。 a).基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡 Inject Chimeric Blastocystoriginal inner cell massInject the gene knocked-out ES cells into a blastocyst.Normal Mouse embryoMate3 days Provides normal blastocyst b). 嵌合胚泡植入假孕小鼠子宮中 Test offspring for presence of gene by PCR Implant into uterus of a pse

12、udopregnant foster mother Neo (+/-)Psuedopregnant black mouse第13頁(yè)，共46頁(yè)。（-/-）（+/-）（-/-） c). 嵌合體的雜交育種如果某些嵌合體小鼠的生殖細(xì)胞恰巧是由基因敲除的ES細(xì)胞發(fā)育成的，Mating with normal mice1/2 is heterozygous 所有細(xì)胞Neo (生殖細(xì)胞+/-) Neo Mating between offsprings with genotype of Neo(+/-)（+/-）（-/-）（+/-）Neo（+/+）Mating heterozygous offspring

13、to produce homozygous gene knocked-out strain第14頁(yè)，共46頁(yè)。Gene knockout mice is a powerful tool for studying gene function. 腫瘤基因“ alive test tubes”. 。三、基因敲除的應(yīng)用 基因敲除鼠是基因功能研究的活試管*第15頁(yè)，共46頁(yè)?；蚯贸∈蠊こ?006年，美國(guó)NIH推出knockout Mouse Project (KOMP)將系統(tǒng)敲除或破壞小鼠的2萬個(gè)基因計(jì)劃投入5200萬美元建立小鼠基因組突變基因數(shù)據(jù)庫(kù)此計(jì)劃與加拿大North American Con

14、ditional Mouse Mutagenesis Project (NorCOMM)及European Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM)合作，以避免重復(fù)工作設(shè)想：各種基因缺陷小鼠將成為研究基因功能、解釋人類疾病的模型。事實(shí)上，目前至少500種基因已經(jīng)獲得了基因敲除小鼠！三、基因敲除的應(yīng)用 基因敲除鼠是基因功能研究的活試管*第16頁(yè)，共46頁(yè)。(3) 基因敲入技術(shù)-生物制藥Mouse Ig genes were knocked outHuman Ig genes were knocked in“人鼠”Produce humanize

15、 antibodies(2) 獲得疾病的動(dòng)物模型*人Ig基因敲入三、基因敲除的應(yīng)用 基因敲除鼠是基因功能研究的活試管*如何理解基因剔除過程其實(shí)就是一個(gè)經(jīng)過改造的基因敲入的過程？第17頁(yè)，共46頁(yè)。Gene knockout procedure 小結(jié)：基因敲除的基本流程*第18頁(yè)，共46頁(yè)。第二節(jié).外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞或生物體內(nèi)一、細(xì)胞水平：細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染 (gene transfection)二、動(dòng)物水平：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物第19頁(yè)，共46頁(yè)。一、細(xì)胞水平：細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染 (gene transfection)如何建立基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型？真核轉(zhuǎn)染載體的必備元件：第二節(jié).外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞或生物體內(nèi)K

16、ozak sequenceCoding sequence(gcc)gccRccAUGG-TAA-6-5-4-3-2-1+1+2+3+4一般是嘌呤(A 或G)目的基因:起始密碼和終止密碼Kozak 序列：是核糖體識(shí)別序列+4G 和-6G 對(duì)于核糖體識(shí)別AUG 有顯著的促進(jìn)作用必要的順式作用元件如啟動(dòng)子等篩選標(biāo)記基因第20頁(yè)，共46頁(yè)。二、 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 （Transgenic mouse ）* ： 指將外源基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞或受精卵細(xì)胞中， 外源基因隨機(jī)插入到受體細(xì)胞的染色體DNA中，從而獲得攜帶目的基因并能穩(wěn)定遺傳的動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenic technology

17、）* ： 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物的技術(shù)。第21頁(yè)，共46頁(yè)?；玖鞒?：轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建Ptransgenic geneEnhancer NeoR 二、 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立第22頁(yè)，共46頁(yè)?；玖鞒?：轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將重組轉(zhuǎn)基因?qū)胧荏w細(xì)胞核內(nèi)pronucleiES cells兩種方法：胚胎干細(xì)胞法前核法Fertilized egg二、 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立第23頁(yè)，共46頁(yè)?；玖鞒蹋恨D(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將重組轉(zhuǎn)基因?qū)胧荏w細(xì)胞核內(nèi)將轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞移植胚泡中Blastocyst二、 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立第24頁(yè)，共46頁(yè)。基本流程：轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將重組轉(zhuǎn)基因?qū)胧荏w細(xì)胞核內(nèi)將轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞移植胚

18、泡中將嵌合胚泡、或轉(zhuǎn)基因受精卵移植入假孕小鼠的子宮腔中Psuedopregnantmouse二、 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立第25頁(yè)，共46頁(yè)。基本流程：轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將重組轉(zhuǎn)基因?qū)胧荏w細(xì)胞核內(nèi)將轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞移植胚泡中將嵌合胚泡、或轉(zhuǎn)基因受精卵移植入假孕小鼠的子宮腔中鑒定并篩選轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因純合子小鼠的幾率為1/4一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因是隨機(jī)整合到染色體上，因此，轉(zhuǎn)基因雜合子的幾率在10-20% 以下Sister-brother MateHeterozygous transgenic mice將目的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)整合到小鼠的染色體中，從而獲得攜帶目的基因并能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因小鼠*二、 轉(zhuǎn)基因小

19、鼠模型的建立第26頁(yè)，共46頁(yè)。 1982年美國(guó)哈佛大學(xué)的一個(gè)科學(xué)家小組，將大鼠的生長(zhǎng)激素（rGH）基因與小鼠的金屬硫蛋白（MT）基因的啟動(dòng)子順序連接，再引入質(zhì)粒中?？茖W(xué)家把這種重組的質(zhì)粒直接注射入小鼠受精卵中，經(jīng)過充分發(fā)育后終于分娩出了21小鼠，其中有七只帶有融合基因，六只生長(zhǎng)迅速，每只體重平均可達(dá)44g，超過同窩無融合基因小鼠（平均體重29g）的1.5倍，這就是聞名于世的“超級(jí)小鼠”。二、 As animal models ： HBV transgenic mice三、轉(zhuǎn)基因的“動(dòng)物藥廠”四、改良動(dòng)物（植物）品種？blood clotting factor IX transgenic sh

20、eep: To produce the protein隨機(jī)插入二、 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用一、基因功能的研究第27頁(yè)，共46頁(yè)。難點(diǎn)：HSV-TK基因: 陰性篩選標(biāo)記基因SpecificRandom【重點(diǎn)內(nèi)容】二、基本流程*一、定義 *：三、應(yīng)用第一節(jié) 基因敲除 第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因 二、基本流程*一、定義 *三、應(yīng)用第28頁(yè)，共46頁(yè)。思考1：Primer 2NeoRPrimer 1Mouse genome如何鑒定發(fā)生了同源重組的基因敲除ES細(xì)胞？提示：Each arm should be about 3 Kb. Shorter than 2 Kb might result in a reduced f

21、requency of recombination.Homologous armHomologous arm第29頁(yè)，共46頁(yè)。Determination of homologous recombinant ES cells (hybrid)思考：如何鑒定發(fā)生了同源重組的基因敲除ES細(xì)胞？第30頁(yè)，共46頁(yè)。用什么方法可以鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠？要求：明確轉(zhuǎn)基因是否存在、以及轉(zhuǎn)基因整合到染色體的拷貝數(shù)思考：第31頁(yè)，共46頁(yè)。qPCR考慮：用EcoRI 酶切提取的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組，但轉(zhuǎn)進(jìn)去的基因不會(huì)被切斷。 如何解釋上面的照片？ 用什么方法可以鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠？思考：方法：Southern blot第

22、32頁(yè)，共46頁(yè)。有些基因是胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過程中非常重要的基因，一旦被敲除可導(dǎo)致胚胎發(fā)育受損甚至不能發(fā)育為一個(gè)個(gè)體。重要的基因是否可以在胚系發(fā)生前剔除？問：針對(duì)這類基因，如何采用基因敲除技術(shù)進(jìn)行研究呢？思考3：了解即可第33頁(yè)，共46頁(yè)。條件性基因敲除Conditional gene knockout利用可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子和Cre重組酶特異性識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)建基因敲除載體，通過誘導(dǎo)劑實(shí)現(xiàn)可控性基因敲除兩個(gè)要素：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Cre重組酶Cre:是一種蛋白質(zhì)(從噬菌體P1提取獲得)名字來源于cause recombination特異性識(shí)別DNA序列 (34bp)LoxP (locus of crossing

23、over in P1)介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的特異性重組，從而刪除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列了解即可第34頁(yè)，共46頁(yè)。Cre/LoxP重組系統(tǒng)：鼠2：Cre 基因位于可誘導(dǎo)性、組織特異性啟動(dòng)子下游的轉(zhuǎn)基因小鼠鼠1：待敲除基因位于兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的基因敲除小鼠鼠3：待敲除基因位于兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的基因敲除小鼠第35頁(yè)，共46頁(yè)。1234LoxPLoxP鼠1的制備：使待敲除基因位于兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間第36頁(yè)，共46頁(yè)。鼠2的制備：使Cre 基因位于可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子下游，從而使Cre重組酶可在特定組織內(nèi)進(jìn)行可控性表達(dá)TRECreCreinducerONCreCreCreTissue-spe

24、cific第37頁(yè)，共46頁(yè)。鼠3：TRECreCreinducerONCreCreCreTissue-specific1234LoxPLoxPCreCreCreCre123LoxP條件性基因剔除利用了一些什么知識(shí)？是否可以實(shí)現(xiàn)活體在體基因剔除？為什么？第38頁(yè)，共46頁(yè)?；蛱蕹侵圃炝艘环N基因缺失模型，但其實(shí)很多情況下基因在體內(nèi)并沒有缺失，而是因某種原因沒有表達(dá)或表達(dá)量低。因此，基因剔除技術(shù)不能反映基因存在時(shí)的生理病理情況。下節(jié)課：RNA Interference思考4：第39頁(yè)，共46頁(yè)?；玖鞒蹋簵l件性基因敲除載體的構(gòu)建基因敲除載體的結(jié)構(gòu)是：4NeoLoxPLoxPLoxPTK如果基因

25、組序列是：1234待敲除基因鼠1的制備：使待敲除基因位于兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間第40頁(yè)，共46頁(yè)?；玖鞒蹋簵l件性基因敲除載體的構(gòu)建在ES細(xì)胞中進(jìn)行第一次常規(guī)性基因敲除12344NeoLoxPLoxPLoxPTK1234NeoLoxPLoxPLoxPHomologous recombinationGenomic DNA:鼠1的制備：使待敲除基因位于兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間第41頁(yè)，共46頁(yè)?；玖鞒蹋簵l件性基因敲除載體的構(gòu)建在ES細(xì)胞中進(jìn)行第一次常規(guī)性基因敲除在ES細(xì)胞中敲除Neo基因1234NeoLoxPLoxPLoxPCre expression gene was transiently int