病理學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)及其應(yīng)用

1、病理學(xué)研究中常用(chn yn)的分子生物學(xué)基本技術(shù)及其應(yīng)用病理(bngl)教研室 王婭蘭共八十三頁(yè)分子病理學(xué)基本概念 現(xiàn)代分子生物學(xué) vs 傳統(tǒng)病理學(xué) 疾病發(fā)生過(guò)程中 分子事件及其與疾病發(fā)生的關(guān)系(gun x) 揭示 根本機(jī)制共八十三頁(yè)復(fù)習(xí)有關(guān)的分子生物學(xué)概念(1)核酸的結(jié)構(gòu)與功能 核酸 -多核苷酸。 核酸由核苷酸組成 核苷酸由堿基、核糖/ 脫氧核糖和磷酸構(gòu)成堿基有五種： A 腺嘌呤 T 胸腺嘧啶(m dn) U 尿嘧啶 G 鳥(niǎo)嘌呤 C 胞嘧啶核苷酸連接方式核酸-DNA （脫氧核糖核酸）和RNA（核 糖核酸）共八十三頁(yè)DNA和RNA的差別從結(jié)構(gòu)上看DNA ：含脫氧核糖及胸腺嘧啶 ACGTRN

2、A： 含核糖及尿嘧啶 ACGU從功能上看DNA ：構(gòu)成染色體內(nèi)的基因組、細(xì)胞器基因 組，是遺傳信息的貯存和 攜帶者 RNA： 包括mRNA(信使RNA), rRNA(核糖體 RNA), tRNA(轉(zhuǎn)移RNA) ，分別進(jìn)行 轉(zhuǎn)錄(zhun l)、轉(zhuǎn)譯的功能共八十三頁(yè)DNA 結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu) 即DNA 分子中脫氧核苷酸的排列順 序堿基順序就代表了核苷酸順序。 又稱為核苷酸序列或堿基序列二級(jí)結(jié)構(gòu) 即DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)這種雙螺旋結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要特征是：在一定條件(tiojin)下，雙鏈可解開(kāi)，亦可重新形成雙鏈三級(jí)結(jié)構(gòu) DNA超螺旋結(jié)構(gòu) 共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)DNA 復(fù)制 雙鏈解鏈 各自為模板合成新的互 補(bǔ)

3、鏈 DNA 轉(zhuǎn)錄 以DNA為模板合成RNA過(guò)程 DNA 翻譯 蛋白質(zhì)合成的同義詞以遺傳密碼 破讀(p d)的手段轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)的氨基 酸排列順序共八十三頁(yè)如 GGC 甘氨酸 GTC 頡氨酸遺傳信息貯存于DNA，在核內(nèi)通過(guò)轉(zhuǎn)錄成mRNA，在胞漿內(nèi)mRNA作直接模板來(lái)指導(dǎo)翻譯(2) 基因 (gene)基因表達(dá)是指基因的轉(zhuǎn)錄翻譯以及它們的調(diào)控轉(zhuǎn)錄在胞核內(nèi)進(jìn)行，翻譯在胞漿中進(jìn)行(3) 染色質(zhì) (chromatin)主要成分是DNA 和 蛋白質(zhì)， 細(xì)胞間期,光鏡下呈細(xì)顆 粒狀 染色體 （chromatosome） 主要成分同上， 細(xì)胞分裂期，由染色質(zhì)濃集而成，呈桿狀,有恒定(hngdng)數(shù)目共八十三頁(yè)

4、同一物質(zhì)在不同時(shí)期的形態(tài)變化 (4) 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu) 多肽鏈氨基酸排列順序(shnx) 序列改變 構(gòu)型改變 功能改變二級(jí)結(jié)構(gòu) 局部/某一段肽鏈空間位置 三級(jí)結(jié)構(gòu) (三維結(jié)構(gòu)）整條肽鏈空間位置四級(jí)結(jié)構(gòu) 多條肽鏈位置共八十三頁(yè)真核生物基因組單復(fù)制順序（single copy sequence）在整 個(gè)DNA分子中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次中等重復(fù)(chngf)順序 (moderatelyrepetitivesequences) 在DNA分子中重復(fù)出現(xiàn)幾十到幾千次高重復(fù)順序(highly tepetitive sequence) 在DNA分子中重復(fù)幾百萬(wàn)次反轉(zhuǎn)重復(fù)順序(inverted repetitiv

5、e sequerce) 其特點(diǎn)是一段堿基呈回文結(jié)構(gòu) 回文結(jié)構(gòu)（palindromic structure） 又稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin structure)共八十三頁(yè)如： 5 AAGCTAGCTT3 3 TTCGATCGAA5 其中一條(y tio)單鏈回折又可形成雙鏈 3 T T C G A 5A A G C T共八十三頁(yè)內(nèi)含子與外顯子內(nèi)含子（intron）或插入順序(shnx)外顯子（exon）DNA變性 定義 變性后性質(zhì) 變性條件DNA復(fù)性（renaturation） 退火共八十三頁(yè)影響復(fù)性(f xn)因素 簡(jiǎn)單分子快于復(fù)雜分子 小分子快于大分子 DNA濃度高快于濃度低 離子強(qiáng)度高（鹽

6、濃度高）快于離子強(qiáng)度低cDNA mRNA的互補(bǔ)拷貝cDNA缺乏該基因的內(nèi)含子，但含有為產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)所需的全部編碼信息 寡核苷酸共八十三頁(yè)一.病理學(xué)研究中常用(chn yn)的分子生物學(xué)基本技術(shù)(一)核酸分子雜交（nucleic acid molecular hybridisation）技術(shù) 概念具有一定同源性的核酸單鏈 一定條件下堿基互補(bǔ)退火形成雙鏈 用帶有標(biāo)記的具有特殊堿基序列（已知堿 基序列）的一段DNA或RNA單鏈片段 來(lái)檢測(cè)靶核酸（待測(cè)核酸）中是否存在與之 同源的序列 已知的核酸序列即探針（probe） 探針標(biāo)記共八十三頁(yè)1.固相雜交 (solid-phase hybridizati

7、on)概念 固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳 酸顆粒、磁珠和微孔板等基本方法： 在此以膜相為例 (1) DNA 變性(binxng)：使DNA由雙鏈解鏈成為單鏈。 是成功的關(guān)鍵(2)變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定(3)預(yù)雜交(4)雜交(5)洗膜(6)結(jié)果顯示共八十三頁(yè)A.放射性測(cè)定 放射自顯影法 液閃記數(shù)法B.非放射性檢測(cè)法 AP 顯色系統(tǒng)， NBT（四 氮唑藍(lán)）顯色分類(fn li)(1)菌落原位雜交（colony in situ hybridization） 菌落轉(zhuǎn)到膜上 將濾膜上的菌落裂解以釋出DNA(2)斑點(diǎn)雜交（Dot blot） 最簡(jiǎn)單有效的膜雜交方法 核酸原液或純化的標(biāo)本

8、直接點(diǎn)到膜上共八十三頁(yè)斑點(diǎn)雜交應(yīng)用于 DNA斑點(diǎn)雜交 RNA斑點(diǎn)雜交對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，不必提取和純化RNA，只需簡(jiǎn)單處理(0.5%Nonidet P40 低滲緩沖液) 完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交 NaOH 處理，使DNA 暴露 可用于篩選大量(dling)標(biāo)本，但它不適用于非放射性 標(biāo)記探針 (DNA純度不夠) 共八十三頁(yè)斑點(diǎn)雜交的特點(diǎn)(tdin)優(yōu)點(diǎn) A 操作簡(jiǎn)便、快速，事先不用限制性內(nèi) 切酶消化或凝膠電泳分離核酸樣品 B 可在同一張膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè) C 可作半定量分析 缺點(diǎn) A 不能鑒定所測(cè)基因的相對(duì)分子量 B 特異性較差，有一定比例的假陽(yáng)性(3)印跡雜交（blotting hybridizati

9、on)southern 印跡雜交 （southern blotting hybridization）共八十三頁(yè)1975 年由 Southern 創(chuàng)建多用限制性內(nèi)切酶將DNA切成片段進(jìn)行凝膠電泳分離（分開(kāi)）,凝膠上使DNA 變性原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移固相支持物上 再與相應(yīng)的已標(biāo)記(bioj)的探針進(jìn)行雜交反應(yīng) 用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，確定探針互補(bǔ)的每一條DNA 帶的位置可用于 DNA 圖譜分析 基因克隆鑒定（克隆基因的酶切圖譜分析） 基因構(gòu)成研究（基因組的定性及定量 分析、基因突變分析及限制性長(zhǎng)度多 態(tài)性分析（RFLP）等。），共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)northern 印跡雜交（Norther

10、n blotting hybridization ）其被測(cè)樣品是RNA方法(fngf)與southern 印跡雜交類似 此法常用于基因表達(dá)的研究，可推算出癌基因的表達(dá)程度(4)原位雜交（in situ hybridization ）核酸原位雜交（nucleic acid hybridization in situ ）的簡(jiǎn)稱已知堿基順序并帶有標(biāo)記的核酸作為探針與細(xì)胞組織切片中待測(cè)的核酸 特異性結(jié)合 成雜交體應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)在被檢測(cè)的核酸原位檢測(cè)雜交信號(hào)共八十三頁(yè)首創(chuàng) 放射性標(biāo)記(1969) 熒光素標(biāo)記 (1981) 生物素標(biāo)記 (1983) 其與菌落原位雜交不同原位雜交可以確定探針的互

11、補(bǔ)(h b)序列在細(xì)胞內(nèi)的空間位置共八十三頁(yè)用途 檢測(cè)特定DNA 序列在細(xì)胞核或染色體上 的特定位置分布 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RNA 在細(xì)胞中和組織(zzh)中的 分布及特定基因表達(dá)水平； 檢測(cè) 細(xì)胞、組織中有無(wú)特異性病原菌、病毒 優(yōu)點(diǎn)：A 特異性高，可精確定位,對(duì)于組織中 含量極低的靶序列有極高的敏感性 B 能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì) 胞的研究而不受同一組織中其它成 分的影響 共八十三頁(yè)C 不需要從組織中提取核酸 D 可完整的保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，準(zhǔn)確反 映其與組織細(xì)胞的相互關(guān)系原位雜交與免疫組化方法結(jié)合(jih) 免疫組化 檢測(cè)抗原成分，在翻譯水平上研究基因表達(dá) 原位雜交 檢測(cè)DNA/RNA，進(jìn)

12、行基因定位，在基因擴(kuò)增或在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)共八十三頁(yè)原位雜交的探針(tn zhn) 單鏈DNA 雙鏈DNA RNA 探針基本方法 (RNA 雜交為例) A.雜交前準(zhǔn)備 固定 盡快予以冷凍/固定 培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織、石蠟包埋組織均可進(jìn)行原位雜交通常石蠟包埋信號(hào)低于冰凍切片共八十三頁(yè)玻片處理增強(qiáng)組織通透性和探針(tn zhn)穿透性 稀釋的酸去垢劑（detergent）或清洗劑Triton X 100 某些消化酶 應(yīng)掌握其用量及孵育時(shí)間 減低背景染色 充分洗滌 預(yù)雜交 雜交后低濃度RNA酶處理防止RNA酶污染 B.雜交共八十三頁(yè)C.雜交后處理D.顯示 如 AP 顯色系統(tǒng) NBT（四氮唑藍(lán)）顯

13、色等有兩種方法: 直接法 直接標(biāo)記探針 間接(jin ji)法 抗原標(biāo)記探針, 雜交后,再用特異性 標(biāo)記的抗體反應(yīng), 在呈色共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)雙重原位雜交方法 通常有兩種方法 A . 用相鄰的連續(xù)切片(qi pin)（3 ），用兩種不同的探針進(jìn)行原位雜交 適用于較大細(xì)胞的研究共八十三頁(yè)優(yōu)點(diǎn) 二者雜交過(guò)程和結(jié)果互不干擾 顯示方法和呈色可用同一檢測(cè)系統(tǒng)，敏 感性相同，可比性強(qiáng) 缺點(diǎn) 雜交信號(hào)可能因切片較薄而減弱 尋找同一細(xì)胞的切面進(jìn)行分析有一定(ydng)困難B. 用兩種探針在同一標(biāo)本上作原位雜交，兩種不同標(biāo) 記探針的雜交陽(yáng)性信號(hào)呈色不同共八十三頁(yè)(5) 熒光原位雜交（flu

14、orescence in situ hybridization , FISH）技術(shù)基本原理 生物素、地高辛或熒光素標(biāo)記 特異的DNA探針 對(duì)外周血、腫瘤細(xì)胞或癌前組織的離散培養(yǎng)(piyng) 細(xì)胞的染色體鋪片或切片（包括石蠟切片） DNA-DNA原位雜交 熒光素標(biāo)記抗探針標(biāo)記物的抗體 其雜交定位信號(hào)用熒光法顯示。共八十三頁(yè)可用多種熒光素的不同顏色顯示多個(gè)染色體的結(jié)構(gòu)或DNA。 如 FITC (fluorescien isothiocy-anate , 異硫氰 酸熒光素) 呈黃綠色 Texas 紅 呈紅色特點(diǎn) 操作簡(jiǎn)易，快捷,探針標(biāo)記后穩(wěn)定 方法(fngf)敏感 在同一標(biāo)本上可以同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)不同

15、的基因 不僅可以在染色體分裂相上觀察結(jié)果，而且可以應(yīng)用 于培養(yǎng)的間期細(xì)胞，組織的石蠟切片、冰凍切片共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)應(yīng)用 臨床應(yīng)用 應(yīng)用非常廣泛 研究應(yīng)用 腫瘤中染色體異常 基因圖譜繪制 確定基因在染色體上的順序(6)其它(qt)雜交方法 A. 差異雜交（differential hybridization ） B. cDNA微點(diǎn)陣雜交（cDNA microarray hybridization ） C. 寡核苷酸微點(diǎn)陣雜交 （oligonucleotide microarray hybridization ） 共八十三頁(yè)2. 液相雜交 （solution hybridization ）所參

16、加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液(rngy)中(1)吸附雜交方法HAP（羥基磷灰石）吸附雜交方法(DNA:DNA)親和吸附雜交方法 (DNA:RNA) 生物素標(biāo)記DNA探針 ?；H和素包被固相支持物 用特異性抗DNA-RNA雜交物的酶標(biāo)單克隆抗 體與固相支持物上的雜交物反應(yīng) 酶顯色共八十三頁(yè)磁珠吸附雜交方法 吖啶翁酯（acridinium ester ）標(biāo)記探針 吸附在磁化的有孔小珠 (2)發(fā)光(f un)液相方法能量傳遞法 兩個(gè)緊接的探針，一個(gè)探針的一端用化學(xué)發(fā)光基團(tuán)（供體）標(biāo)記，另一個(gè)探針的一端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，并且這兩個(gè)探針靠得很近。由于只有在兩個(gè)探針?lè)肿涌康煤芙鼤r(shí)，才能產(chǎn)生發(fā)光具有較好的特

17、異性共八十三頁(yè) 吖啶翁酯標(biāo)記法 檢測(cè)雜交探針的化學(xué)發(fā)光 此法敏感度低 僅適用于檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列(3) 液相夾心雜交方法親和雜交方法 兩個(gè)(lin )探針與靶核酸雜交，形成夾心結(jié)構(gòu)。 雜交物上的吸附探針可結(jié)合到固相支持物上 雜交物上的檢測(cè)探針可產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào) 一般用生物素標(biāo)記吸附探針，用125I標(biāo)記檢 測(cè)探針該試驗(yàn)保持了固相雜交的高度特異性共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)(二)聚合酶鏈反應(yīng)及其相關(guān)技術(shù)1.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction , PCR）技術(shù) 又稱體外基因擴(kuò)增 利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定(tdng)的 DNA 片段高效擴(kuò)增的技術(shù) 獲得或放大特異基因信號(hào)的

18、重要手段基本原理 在模板DNA（待測(cè)DNA） 引物（模板兩端的已知序列） 四種脫氧核苷酸 (dNTP) DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)共八十三頁(yè)擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA 整個(gè)步驟分三步 變性 加熱 模板DNA 成兩條單鏈 退火 降溫 模板DNA 與引物 互補(bǔ)(h b)結(jié)合 延伸 DNA聚合酶及鎂離子 形成與模板鏈 互補(bǔ)的新DNA鏈三步為一個(gè)循環(huán) DNA量增加1倍25-30個(gè)循環(huán) DNA 可增加10 6-109 倍 共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)P(yáng)CR 反應(yīng)體系組分包括 引物 DNA聚合酶 PCR反應(yīng)緩沖液 dNTPs （四種核苷酸）實(shí)際操作中, 分別有不同的要求和注意事項(xiàng)反應(yīng)條件應(yīng)不斷優(yōu)化 如

19、 變性 復(fù)性 延伸溫度及時(shí)間(shjin) 循環(huán)參數(shù) 鎂離子濃度 平臺(tái)效應(yīng) 防止污染等共八十三頁(yè) PCR模板（待測(cè)DNA） 細(xì)菌 全血標(biāo)本或白細(xì)胞 新鮮組織 石蠟包埋組織 但各自的制備方法各異 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分析(fnx) 凝膠電泳分析 瓊脂糖凝膠電泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 單一條帶 點(diǎn)雜交方法 將產(chǎn)物直接點(diǎn)到膜上共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)共八十三頁(yè)2. PCR 相關(guān)技術(shù)(jsh) (1)定量PCR 最常用的為競(jìng)爭(zhēng)性PCR (2)逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR) 用來(lái)擴(kuò)增RNA 的方法 由mRNA 逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription, RT ）反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA第一條

20、鏈作PCR的模板 共八十三頁(yè)(3)競(jìng)爭(zhēng)逆轉(zhuǎn)錄PCR(competitive reverst transcription-polymerase chain reaction, c-RT-PCR)(4)多重PCR ( multiplex PCR) (5)反向PCR (inverse PCR) 對(duì)已知DNA 片段(pin dun)兩側(cè)未知 序列進(jìn)行擴(kuò)增(6)不對(duì)稱PCR (7)錨定PCR (8)著色互補(bǔ)試驗(yàn)或熒光PCR(9)雙溫PCR (two-temperature PCR)共八十三頁(yè)(10)原位PCR（in situ PCR, ISPCR）技術(shù)(jsh) 90年Hasse 首次創(chuàng)建 概念 在細(xì)胞

21、 (爬片, 甩片, 涂片) 組織切片(冰 凍/ 石蠟) 直接對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)摻入標(biāo)記基 團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測(cè)的 方法 共八十三頁(yè) 既能在組織原位檢測(cè)單復(fù)制的特定DNA/RNA 又能使擴(kuò)增的特定的DNA/RNA片段在組織切片中 定位 特點(diǎn)(tdin) 1. PCR特異性高敏感性,又有原位雜交樣的定位準(zhǔn)確性 2. 能檢測(cè)低于2個(gè)拷貝量的細(xì)胞內(nèi)特定的DNA序 列 共八十三頁(yè) 3. 有助于細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學(xué)變化的 結(jié) 合分析基本方法 A. 細(xì)胞或組織切片上滴加PCR反應(yīng)(fnyng)液 B. 把載玻片放入熱循環(huán)儀（原位PCR儀）中進(jìn)行擴(kuò)增 C. 進(jìn)行原位 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 共

22、八十三頁(yè)共八十三頁(yè)分類(fn li) A. 直接法原位PCR ( direct in situ PCR) 基本原理 對(duì)三磷酸核苷酸或引物進(jìn)行標(biāo)記 使擴(kuò)增產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子 據(jù)標(biāo)記物性質(zhì)進(jìn)行產(chǎn)物的檢測(cè) 標(biāo)記物 最常用的有三種 放射性同位素 生物素 地高辛共八十三頁(yè)特點(diǎn) 操作簡(jiǎn)便 特異性較差 易出現(xiàn)假陽(yáng)性 擴(kuò)增效率低應(yīng)用注意事項(xiàng) a. 不能用于切片標(biāo)本(biobn) b. 不適用于研究?jī)?nèi)源性基因重排和染色體 易位 B間接原位PCR (indirect in situ ,PCR) 基本原理 同常規(guī)PCR,不帶任何標(biāo)記物 再利用原位雜交方法加以檢測(cè)共八十三頁(yè) 主要步驟 標(biāo)本(biobn)固定 保持原

23、有組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu) 滲入 使引物 核苷酸和酶等反應(yīng)液進(jìn)入細(xì)胞 內(nèi) (如用酶進(jìn)行消化) 原位擴(kuò)增 通過(guò)原位PCR技術(shù)（原位 PCR儀） 增加靶核酸序列的數(shù)量，以達(dá)到可 檢測(cè)的水平 原位雜交檢測(cè) 用特異性探針檢測(cè)產(chǎn)物 特點(diǎn) 步驟雖然較多，但擴(kuò)增效率高，特異 性較直接法強(qiáng) 共八十三頁(yè) 在原位PCR中常用的原位雜交標(biāo)記(bioj)物 非同位素標(biāo)記物 如 生物素 地高辛等 C原位反轉(zhuǎn)錄PCR (in situ reverse transcription ,PCR) 又稱為 in situ RT-PCR 結(jié)合反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（以mRNA為模板合成cDNA ）和 PCR擴(kuò)增檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低復(fù)制mRNA的方法 共八十

24、三頁(yè)基本原理 它由mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生cDNA鏈（即在 逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，以mRNA 為模板合成 cDNA） 再以cDNA為模板，用PCR對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增 擴(kuò)增結(jié)束后，再用特異性的探針進(jìn)行原位雜交 整個(gè)反應(yīng)過(guò)程均在固定的組織或細(xì)胞(xbo)標(biāo)本上進(jìn)行 標(biāo)本要用DNA酶處理共八十三頁(yè) 原位PCR的應(yīng)用 1) 檢測(cè)內(nèi)源性基因(jyn) 固有基因的檢測(cè) 異?；蜃儺惢?2) 外源性基因的檢測(cè) 感染基因 病毒基因 細(xì)菌基因 導(dǎo)入基因原位PCR應(yīng)用中存在的問(wèn)題及對(duì)策 敏感性 特異性共八十三頁(yè) 產(chǎn)生假陽(yáng)性原因(直接法) 錯(cuò)配 核苷酸錯(cuò)誤(cuw) 摻入 受損DNA 修復(fù) ; 擴(kuò)增產(chǎn)物彌散 對(duì)策 熱啟動(dòng)

25、 減少?gòu)浬?fù)雜性定量分析 目前還停留在相對(duì)定量或半定量水平(11)免疫聚合酶鏈反應(yīng)（immuno polymerase chain reaction, immuno-PCR,簡(jiǎn)稱免疫PCR）技術(shù)由Sano等于1992年首建共八十三頁(yè)基本原理 單克隆抗體進(jìn)行(jnxng)生物素化 核苷酸（DNA）也生物素化 用親和素或鏈霉親和素將兩者連接 構(gòu)成具有雙功能的嵌合分子共八十三頁(yè)單抗-生物素-中介分子-生物素-DNA (親和素) 與抗原結(jié)合 PCR擴(kuò)增抗體端可以與抗原結(jié)合，特異性地捕獲待測(cè)抗原，以保證檢測(cè)結(jié)果的特異性，核酸（DNA）端則可用引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，間接證明抗原的存在。產(chǎn)

26、物可用瓊脂糖電泳檢測(cè)采用不同(b tn)大小標(biāo)準(zhǔn)的DNA進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行電泳檢測(cè)，則可同時(shí)檢出不同的抗原分子。共八十三頁(yè)(12) 原位免疫PCR（in situ immuno-PCR , IS-PCR）技術(shù) 基本原理 中介分子同時(shí) 與DNA和抗體分子特異結(jié)合 其 一端連接DNA（DNA作為(zuwi)標(biāo)記物） 另一端連接抗原-抗體復(fù)合物 形成一個(gè)抗原-抗體-DNA連接物 作為標(biāo)記物的DNA分子用原位PCR擴(kuò)增，檢 測(cè)特異的PCR產(chǎn)物，即可間接地證明抗原的 存在 中介分子 鏈酶親和素（SA）- 蛋白A 嵌合體共八十三頁(yè)(三) 用引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記(bioj)（primed in situ labe

27、lling , PRINS）技術(shù)用于細(xì)胞或染色體原位檢測(cè)特異性DNA/RNA基本原理 PCR和FISH技術(shù)的結(jié)合 dUTP（用熒光素如FITC標(biāo)記）和dATP dCTP,dGTP 摻入延伸的DNA中，使新合成 的DNA帶有熒光素, 用熒光顯微鏡檢測(cè) 地高辛標(biāo)記再用免疫細(xì)胞化學(xué)顯色普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)共八十三頁(yè)特點(diǎn)及應(yīng)用前景 1.快速，簡(jiǎn)便也適用于組織切片 2.敏感性和特異性較高. 3.具有很高的快速性 4. 地高辛標(biāo)記， 適用于普通顯微鏡觀察， 避免了標(biāo)本熒光素標(biāo)記褪色快的缺點(diǎn) 5. 不需使用DNA或cDNA探針，只需要特異 性引物序列(xli)，合成簡(jiǎn)便共八十三頁(yè)(四) 基因重組技術(shù)基因重組是

28、基因克隆的關(guān)鍵技術(shù)。其基本內(nèi)容包括 分離純化或人工合成DNA 制備DNA重組體 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞 篩選表達(dá)重組DNA的宿主細(xì)胞使其擴(kuò)增 鑒定目的基因的正確連接及表達(dá)主要目的是獲得某一基因或DNA片段(pin dun)的大量拷貝共八十三頁(yè)目的基因的獲得 通常所需要的目的基因都是一些(yxi)已有相關(guān)基礎(chǔ)研究的基因 常用方法 1.PCR擴(kuò)增目的基因 2.從基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中獲得目的基因 3.人工合成目的基因共八十三頁(yè) DNA 體外重組載體 常用的有 質(zhì)粒載體 最常用的是pBR322 噬菌體（phage）載體 最常用的為DNA及其衍生物 重組DNA 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞 重組體克隆的篩選(shixun)

29、與鑒定 酶切、電泳、雜 交等方法共八十三頁(yè)(五) 基因轉(zhuǎn)染（gene transfection）技術(shù) 將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA 送入細(xì)胞(xbo)內(nèi)，并在 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的技術(shù) 方法有 磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法 DEAE 葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法 脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法 電擊基因轉(zhuǎn)染法共八十三頁(yè)二.腫瘤研究(ynji)中常用的分子生物學(xué)技術(shù) (一)基因擴(kuò)增的檢測(cè)1.原位雜交 （ISH）2.熒光原位雜交 （FISH）3.Southern blot (DNA 雜交)4.Northern blot (RNA 雜交)5.原位PCR6.RT_PCR共八十三頁(yè)(二)基因突變的檢測(cè)突變的幾種形式(xngsh)點(diǎn)突變 基因特定

30、位置發(fā)生一個(gè)核苷酸的改變基因缺失基因易位或重排其他：插入 甲基化 染色體非組蛋白改變等 共八十三頁(yè)突變的檢測(cè)方法1.聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP） 長(zhǎng)度相同，但堿基序列不同的單鏈DNA 構(gòu)象 不同,在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)， 遷移率（泳動(dòng)率）不同基本方法 作PCR 將產(chǎn)物變性而成為(chngwi)單鏈 進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 顯示結(jié)果共八十三頁(yè)共八十三頁(yè) 可用同位素/熒光素標(biāo)記 電泳后用相應(yīng)方法 檢測(cè)(標(biāo)記在PCR時(shí)進(jìn)行) 非同位素標(biāo)記 電泳后銀染顯色。特點(diǎn)(tdin) PCR-SSCP能有效的檢出單個(gè)堿基置換點(diǎn) 突變 對(duì)短片段靈敏度高 方法簡(jiǎn)便，快速，適用于大量樣本突變的 篩選，但其不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)共八十三頁(yè) 2.PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技術(shù) PCR技術(shù)擴(kuò)增出來(lái)(ch li)的DNA片段用限制性內(nèi)切酶消化， 檢