磷脂酶 D 試劑盒說明書

1、貨號(hào)：MS2412規(guī)格：100管/96樣磷脂酶D （ Phospholipases D, PLD）試劑盒說明書微量法注意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。測定意義：磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰膽堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的 一類酶的總稱，廣泛存在于高等動(dòng)植物和細(xì)菌等多種生物體中，具有參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝、信號(hào) 傳導(dǎo)、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。測定原理：磷脂酶D催化水解磷脂酰膽堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽堿，膽堿在膽堿氧化酶 催化作用下生成甜菜堿和過氧化氫，過氧化氫在過氧化氫酶的作用下將4-氨基安替比林和重 蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì)，在500nm

2、處有特征吸收峰。自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：天平、研缽、超速冷凍離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒 溫水浴鍋、無水乙醇。試劑組成和配制：提取液：液體100mLX 1瓶，4C保存。試劑一：液體102mLX瓶，4C避光保存。試劑二：液體3mLX 1瓶，4C避光保存。試劑三：粉劑X1支，-20C避光保存。臨用前加1mL無水乙醇充分溶解；用不完的試劑 分裝后-20C保存，禁止反復(fù)凍融。試劑四：液體15mLX 1瓶，4C避光保存。標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mLX 1支，4C避光保存。酶液提?。航M織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1： 510的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提 取液）加入

3、提取液，冰浴勻漿后于4C，10000g離心5min，取全部上清于4C、100000g 離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為5001000： 1的比例（建議500萬細(xì) 胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）； 然后于4C，10000g離心5min，取全部上清于4C、100000g離心30min，棄上清，取沉淀 溶于1mL試劑一。血清：直接測定。測定操作:空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管試劑一 （p L）20試劑二（ L）303030標(biāo)準(zhǔn)品（p L）20樣品（p L）20試劑三（.L）10101

4、0充分混勻，30 C反應(yīng)30min，沸水浴1min，打開蓋子，自然冷卻2min。試劑四（U L反應(yīng)30min，于微量石英比色皿/96孔板，空白管調(diào)零，測定500nm處吸光 值，分別記為A標(biāo)準(zhǔn)管和A測定管。酶活計(jì)算公式：a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下按照蛋白濃度計(jì)算酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生Inmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單 位。PLD 活性（nmol/min /mg prot）二XC 標(biāo)準(zhǔn)：Cpr：T= 0.017 X A平:CprA標(biāo)準(zhǔn)管A標(biāo)準(zhǔn)管按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生Inmol膽堿所需的酶量為一個(gè)

5、酶活力單位。PLD活性（nmol/min /g鮮重）=A測定管 XC標(biāo)準(zhǔn)：W：T = 0.017X人測定管（WA標(biāo)準(zhǔn)管A標(biāo)準(zhǔn)管按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單 位。PLD活性（nmol/min /1Q cell） = A測定管 XC標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞數(shù)量：T = 0.017X人測定管：細(xì)A標(biāo)準(zhǔn)管A標(biāo)準(zhǔn)管胞數(shù)量按照液體體積計(jì)算酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單 位。PLD 活性（nmol/min /mL） = A測定管 XC 標(biāo)準(zhǔn)：T=0.017X A測定管 人標(biāo)準(zhǔn)官人標(biāo)準(zhǔn)官C標(biāo)準(zhǔn)：

6、標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500nmol/L； Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g/mL； T：反 應(yīng)時(shí)間，30minb.用96孔板測定的計(jì)算公式如下按照蛋白濃度計(jì)算酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單 位。PLD 活性（nmol/min /mg prot）=XC 標(biāo)準(zhǔn)：Cpr：T= 0.017 X A平:CprA標(biāo)準(zhǔn)管A標(biāo)準(zhǔn)管按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。PLD活性（nmol/min /g鮮重）=A測定管 XC標(biāo)準(zhǔn)：W：T = 0.017X人測定管（WA標(biāo)準(zhǔn)管A標(biāo)準(zhǔn)管按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生Inmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單 位。PLD活性(nmol/min /1Q cell)= A測定管 XC標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞數(shù)量：T = 0.017X A測定管 :細(xì)A標(biāo)準(zhǔn)管A標(biāo)準(zhǔn)管胞數(shù)量按照液體體積計(jì)算酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生Inmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單 位。Dinger 1/ /I、A測定管xQ后淮n.A測定管PLD 活性(nmol/min /mL)二 上一、弁” XC 標(biāo)準(zhǔn)一T=0.017X 上一、弁”A標(biāo)準(zhǔn)管A標(biāo)準(zhǔn)管C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500nmol/L； Cpr：樣本蛋白濃度，mg