園藝植物生物技術(shù)

1、園藝植物生物技術(shù)實驗教案實驗一 現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室與實驗儀器一、實驗?zāi)康膶嶒炇液蛯嶒瀮x器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家農(nóng)作物分子技術(shù)育種中心和國家柑橘育種中心的生物技術(shù)研究在國內(nèi)一直處于領(lǐng)先地位并有重要國際知名度，其實驗室布局和儀器配置能代表目前國內(nèi)外生物技術(shù)實驗室的整體情況，通過現(xiàn)場參觀和老師講解加深同學(xué)們對現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室的認(rèn)識。二、實驗場所選擇及實驗內(nèi)容作物遺傳改良國家重點(diǎn)實驗室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實驗室分工與布局和主要儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺、高壓滅鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生

2、物學(xué)有關(guān)的如高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。三、實驗方法與步驟1、相關(guān)背景知識回顧：對課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細(xì)胞和組織培養(yǎng)等操作過程進(jìn)行回顧，重要指出每個環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項及儀器選購中應(yīng)注意的問題等。2、每班分為兩小組簡要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室的布局，及功能分區(qū)情況；針對每個分區(qū)的重要儀器進(jìn)行講述，結(jié)束時對所有參觀內(nèi)容進(jìn)行簡要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問四、實驗注意事項實驗有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時要求同學(xué)們認(rèn)真記錄，不要隨意動手，以保證儀器和人身安全。五、思考題1、根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中

3、的注意事項。2、一個現(xiàn)代化生物技術(shù)實驗室應(yīng)具備的基本功能的必備儀器有哪些？園藝植物生物技術(shù)實驗教案實驗二 植物組織培養(yǎng)一、實驗?zāi)康闹参锝M織培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技術(shù)研究的重要技術(shù)手段，在原生質(zhì)體融合、病毒脫除、離體快繁及遺傳轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。胡蘿卜以其培養(yǎng)體系成熟、再生容易而被視為組織培養(yǎng)的理想外植體材料，本實驗通過胡蘿卜的組織培養(yǎng)使同學(xué)們掌握基本培養(yǎng)基的配制、滅菌及培養(yǎng)的基本技能。二、實驗原理基于1902年德國科學(xué)家哈勃蘭特(HabrlMdt)提出植物細(xì)胞的全能性理論，即指已分化的細(xì)胞仍然具有分化發(fā)育成新個體的潛能。在適宜的培養(yǎng)條件下，植物的細(xì)胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。

4、三、主要儀器及試材儀器：PH計、微波爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、培養(yǎng)室、三角瓶、封口膜、無菌濾紙、手術(shù)刀片、鑷子、酒精燈、記號筆等試材：新鮮胡蘿卜，培養(yǎng)基配制所需相關(guān)試劑四、實驗方法與步驟1、培養(yǎng)基的配制（小規(guī)模實驗應(yīng)按比例減少，避免造成很大的浪費(fèi)）：大量元素(10倍液)：稱取下列藥品分別溶解定容到1升后，加到5升存儲瓶中。KNO3 95 gNH4NO3 82.5 gKH2PO4 8.5 g MgSO47H2O 18.5 gCaCl22H2O 22.0 g注意事項：1、配置母液前要仔細(xì)清洗存儲容器2、應(yīng)按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動存儲瓶使其混合均勻；3、溶解時最好加熱，以便

5、充分溶解，避免沉淀的產(chǎn)生；4、夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因為水中帶菌量過大而產(chǎn)生沉淀，同時可以減緩綠藻的生成；5、沉淀的產(chǎn)生一是由于溶解不充分就混合造成的（渾濁型沉淀），所以配置時一定不要急；二是由于長菌而產(chǎn)生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。微量元素母液的配制(100倍)：取少量(200-300ml)溫水依次加入下列藥品，每加一種藥品后攪拌溶解，最后定容到1L：KI 0.083 gH3BO3 0.62 g ZnSO4*7H2O 0.86 gNaMoO4*2H2O 0.025 gCuSO4*5H2O 0.0025 gCoCl2*6H2O 0.0025 gMnSO4*4H2O

6、 2.23 g (MnSO4*H2O 1.69 g)注意： 配好后在室溫下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀。配制過程中產(chǎn)生沉淀的原因有：1. 前一個沒徹底溶解就加入了后一個藥品；2. 蒸餾水pH 值過高，可加幾滴鹽酸校正。甘氨酸和肌醇的配制(100倍):甘氨酸: 0.2 g溶解定容到一升; 肌醇: 10 g溶解定容到一升。鐵鹽的配制（100倍）:稱取EDTA 3.73 g，F(xiàn)eSO47H2O 2.78 g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細(xì)口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結(jié)晶沉淀），然后放入4冰箱。維生素B的配制（100倍）：改良MT ： VB1（鹽酸硫氨素）1g

7、, MS： 10 mgVB6 (鹽酸吡哆素) 1g, 50 mgVB5 (煙 酸) 0.5g, 50 mg分別稱取順序溶解在溫?zé)岬恼麴s水中，定容到1升。注: 需要溶解完一個再加另一個。VB5不易溶解，需要攪拌，必要時可以加熱。Vc的配制（100倍）：稱取Vc 0.5g 溶解在蒸餾水中，定容到1升即可。注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量較大，短時間內(nèi)用不完，最好分裝一部分到小的細(xì)口瓶中，在做培養(yǎng)基時使用。這樣不容易產(chǎn)生沉淀。2、配好母液后，按以下體種（或質(zhì)量）量取，最后用蒸餾水定溶到1升,調(diào)節(jié)pH至5.8，用塑料燒杯放入微波爐中充分溶解后分裝滅菌。大量元素(10倍液) 100 ml微量元素

8、母液的配制(100倍) 10 ml甘氨酸和肌醇的配制(100倍) 10 ml鐵鹽的配制（100倍） 10 ml維生素B的配制（100倍） 10 mlVc的配制（100倍） 10 ml蔗糖 20 g瓊脂 7.5 g3、接種與培養(yǎng)，在超凈臺上接種后，用記號筆做好標(biāo)簽，放置到光照培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。五、實驗注意事項1、實驗中涉及到酒精及砷汞等危險品，注意人身安全的環(huán)境安全，廢液不要隨意亂倒。2、外植體消毒及接種操作要規(guī)范，注意超凈臺的衛(wèi)生，養(yǎng)成良好的實驗習(xí)慣。六、實驗結(jié)果處理一星期后，統(tǒng)計污染率，并對未污染材料的生長狀況進(jìn)行觀察，并分析產(chǎn)生污染的可能原因。七、思考題影響植物組織培養(yǎng)的因素有哪些？主要參

9、考文獻(xiàn) HYPERLINK /dzqk/qikan/cpaper/zuozhexiangguan.asp?xingming=張婭曾君祉周志勇陳毓荃黃華樑 t _blank 張婭，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。胡蘿卜組織培養(yǎng)和高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。植物學(xué)通報,2005，22:37-42華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）園藝植物生物技術(shù)實驗教案實驗三 植物DNA的提取及電泳檢測一、實驗?zāi)康腄NA 提取是開展分子生物學(xué)的重要前提之一，高質(zhì)量的DNA直接關(guān)系到分子標(biāo)記、基因克隆、圖譜構(gòu)建及功能基因組研究等工作的成敗。本實驗旨在鍛煉同學(xué)們DN

10、A操作及檢測的基本技能，為將來從事園藝植物生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。二、實驗原理植物的遺傳物質(zhì)是DNA，植物細(xì)胞內(nèi)含有豐富的遺傳物質(zhì)。在機(jī)械研磨、高溫和去污劑的共同作用下，植物細(xì)胞破裂，DNA從細(xì)胞核釋放到提取緩沖液中。經(jīng)蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑處理結(jié)合離心，除去蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)，再用乙醇沉淀便可獲得高純度的DNA。DNA電泳是依據(jù)DNA帶負(fù)電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場的作用下DNA由負(fù)極向正極移動，分子量小的移動快而分子量大的移動慢，最終達(dá)到不同分子量大小的DNA分離的目的。三、主要儀器及試材水浴鍋、離心機(jī)、電泳儀等新鮮健康柑橘葉片，液氮、及DNA提取有關(guān)試劑四、實驗方法與步驟1

11、. 藥品的配制: CTAB提取液：(1) 100 mM Tris-HCl(PH 8.0),1.5 M NaCl,50 mM EDTA(PH 8.0)(2) 1% PVP，2% CTAB(3) 取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量,65水浴充分溶解備用。使用前要在65溫浴一會兒，然后加入1-4%巰基乙醇,混均勻。苯酚：氯仿：異戊醇（25241）：重蒸酚65水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫?zé)岬恼麴s水，加入少許8-羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力攪拌器上攪拌1.5 h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入

12、棕色瓶中，4冰箱中儲存?zhèn)溆谩?. DNA的粗提在裝有葉片的離心管中加入石英砂少許（約0.07克），用尖頭玻棒將材料研細(xì)后加入500 ul CTAB提取液，再繼續(xù)研磨一會兒使其懸浮均勻，然后在65水浴鍋中溫浴60分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒幾次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下晃動10分鐘以上，其間置于37水浴鍋中溫浴一會（冬季），使之充分混勻，然后8000-10000 rpm離心5-10分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20冰凍無水乙醇1 ml，輕輕顛倒數(shù)次，混合均勻后冰凍30分鐘沉淀DNA，然后8000-1000

13、0 rpm離心5分鐘，棄上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小時或過夜，8000 rpm離心5分鐘,棄酒精之后在工作臺上風(fēng)干DNA，注意不要過干，否則會使以后溶解困難。3. DNA的純化： 向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1TE，37水浴15-30分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase,37水浴6小時，然后加入500 l苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下顛倒離心管約10分鐘，至充分混勻，8000-10000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入500 l氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），8000 10000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 l 5M NaCl，再加入1 ml冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒，然后在-20冰箱中置30分鐘沉淀DNA，8000-10000 rpm離心2-3分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡,2小時后換一次,后浸泡過夜，8000 rpm離心3分鐘后棄酒精，風(fēng)干，加50-100 l TE充分溶解備用。4、DNA檢測取DNA原液15 l稀釋至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度計測定230 nm、 260 nm及280 nm的吸光值。高質(zhì)量的DNA要求：A260/A2302.0； 1.7A260/A2801.9將DNA原液適當(dāng)稀釋